Antibodies immobilization

Human Cytomegalovirus (HCMV) is a herpes virus that establishes a lifelong latent infection which, in most of the immunocompetent individuals is normally subclinical. Severe infections occur more frequently in immunocompromised ones, or those with immature immune system, for which can be fatal. Glycoprotein B (gB) is the dominant antigen of HCMV envelope being regarded as a promising component in the establishment of new diagnostic tests. Nowadays there are several diagnosis methods, however, these are expensive, or/and require long time to perform, or/and need skilled operators, or even leads to the possibility of false results. So, in previously work, a disposable immunosensor was developed based on electrochemical silver oxidation as response for gB concentration increasing, using screen-printing carbon electrodes. This method allows a faster and inexpensive way to detect that viral protein. Despite that, a lack on device reproducibility and sensitivity, due to the randomly antibody adsorption was found. It is known that the oriented immobilization has become critical for optimized antigen detection on solid surfaces; therefore, those results lead us to employ other immobilization techniques to improve the immunosensor performance. In this work the immobilization of antibodies was carried out through glutaraldehyde cross-linking, by covalent immobilization using diazonium salts and finally by using the boronic acid affinity towards the carbohydrate present on the antibody molecules. The results were conclusive only for the cross-linking, which has disadvantages when compared with adsorption. Additionally, the importance of the gB on diagnosis tests for HCMV, lead us to study its isolated electrochemical behavior. Questionable results were found demonstrating the impossibility of its use in the determination of gB in biological samples.O Citomegalovírus humano (HCMV) é um herpes vírus que pode originar infeções primárias, a partir das quais a reativação poderá ser frequente. Quando os hospedeiros deste agente viral são indivíduos imunocompetentes, é geralmente associada uma latência do HCMV que eventualmente poderá resultar em sintomas subclínicos. No entanto, em indivíduos imunocomprometidos, tais como os portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e os sujeitos a terapêuticas imunossupressoras ou ainda em indivíduos cujo sistema imune é imaturo, como é o caso de fetos e recém-nascidos, a infeção adquire proporções graves, podendo resultar na morte dos mesmos. Este vírus apresenta um invólucro rico em proteínas virais das quais a glicoproteína B (gB) se destaca, pois está presente em aproximadamente 100% dos indivíduos infetados, sendo também reconhecida por desencadear a produção de anticorpos neutralizantes que levam à eliminação das células infetadas. Assim, esta proteína pode ser vista como um componente essencial no diagnóstico da infeção por HCMV. A definição de um diagnóstico ideal para o HCMV tem sido difícil de implementar devido às desvantagens apresentadas pelos métodos existentes, que se baseiam em informações clinicas e imunológicas. Definido como método convencional, o isolamento do vírus em culturas de fibroblastos, obtido a partir de biópsias ou de fluidos dos hospedeiros, tem associadas as desvantagens de exigir assepsia total e longos períodos de tempo para a sua execução. Para contrapor as dificuldades desta técnica, um método idêntico, o “Shell-vial”, reduz o tempo do ensaio através de um passo de centrifugação que aumenta a penetração do HCMV nos fibroblastos, que por sua vez pode ser avaliada por imunofluorescência. No entanto, o sucesso deste método continua a depender das condições assépticas usadas. Por outro lado, o PCR (“Polimerase Chain Reaction”), analisa amostras clínicas com uma rápida performance e elevada sensibilidade, conseguida na amplificação de ADN viral. Contudo, o elevado custo e a dificuldade de realização contrapõem-se ao seu uso como técnica de diagnóstico corrente. Outra técnica, ELISA (“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”), deteta a presença de anticorpos específicos no sangue, o que pode levar a falsos positivos devido a reações cruzadas com o fator reumatoide, anticorpos antinucleares e outros membros da família herpesviridae. Usado para medir a afinidade e avidez do anticorpo para o antigénio viral, o “Western Blotting” apresenta uma baixa disponibilidade comercial conjugada também com a possibilidade de falsos positivos. Por último, testes citológicos/histológicos permitem observar inclusões virais em biópsias de tecidos do hospedeiro, contudo apresentam igualmente uma baixa sensibilidade tendo apenas 50% de sucesso na identificação de falsos negativos. Todos os métodos têm associadas desvantagens quanto a falsos resultados, ou equipamentos e/ou procedimentos caros, que podem estar ou não relacionados a uma difícil manipulação e elevado tempo de realização. Desta forma, para contrariar estes inconvenientes, num estudo anteriormente realizado neste grupo de investigação, foi desenvolvido um imunossensor eletroquímico descartável para a deteção do HCMV, tendo por base uma imunorreação do tipo sandwich na qual o anticorpo secundário estava marcado com nanopartículas de ouro (AbNPs). Esta marcação permitiu a posterior deposição catalítica de nanopartículas de prata (AgNPs), que geraram um sinal eletroquímico na sua redissolução anódica por voltametria de pulso diferencial. O uso de elétrodos serigrafados (SPEs) como base para o immunosensor, acrescenta vantagens tais como a miniaturização, baixo custo, versatilidade e principalmente a possibilidade de uso como “point of care”. Adicionalmente, a facilidade de produção destes dispositivos por impressão sequencial de camadas de tintas, oferece vantagens na manipulação de padrões e geometrias conforme o pretendido. O maior desafio na construção deste tipo de biossensores, passa pela imobilização dos anticorpos na superfície dos elétrodos. Está descrito na literatura que a imobilização de anticorpos de forma orientada resulta numa melhor exposição dos locais de ligação aos antigénios, exibindo melhores capacidades de ligação e posterior deteção dos mesmos. De facto, foram detetadas algumas limitações relacionadas com este passo de construção do imunossensor, uma vez que os anticorpos anti-HCMV se encontravam adsorvidos de uma forma aleatória na superfície do elétrodo de trabalho. Desta forma, as moléculas de anticorpo apresentam uma orientação nem sempre ideal afetando a reprodutibilidade e a sensibilidade do dispositivo na resposta a concentrações de gB do HCMV. Assim, com o objetivo de melhorar as características do immunosensor descartável, neste trabalho foram aplicadas várias técnicas para a imobilização dos anticorpos anti-HCMV, tais como a reticulação, imobilização covalente através de sais de diazónio e por último usando a afinidade do ácido borónico para os açúcares presentes nas moléculas de anticorpo. O glutaraldeído, usado como agente reticulante, permitiu a imobilização das moléculas de anticorpo anti-HCMV na superfície dos SPEs. O sistema mostrou responder às concentrações incubadas de gB, levando a respostas dependentes das mesmas. Comparativamente aos resultados obtidos para a adsorção, a reticulação demonstrou ter associadas algumas desvantagens em termos de reprodutibilidade e de sensibilidade, devido à imposição da ligação dos anticorpos pelos domínios de ligação ao antigénio. Por outro lado, em condições favoráveis, a adsorção pode resultar numa orientação favorável dos anticorpos, uma vez que as moléculas têm a liberdade para se adaptarem à superfície pela conjugação de diversos fatores, nomeadamente a sua reorientação favorável na zona de saturação. Quanto à imobilização covalente foram encontradas interferências na ativação da superfície dos elétrodos. As vias condutoras de prata presentes nos elétrodos serigrafados geram uma espécie desconhecida de prata que impossibilita o estudo da eficiência de imobilização, levando a uma incompatibilidade com o método de deteção usado no imunossensor. Por fim, uma primeira abordagem foi realizada para a imobilização dos anti-HCMV através da afinidade do ácido borónico para os resíduos de açúcar presentes na estrutura dos anticorpos. Os resultados preliminares demonstraram ser promissores para uma futura aplicação neste imunossensor. Finalmente, a reconhecida importância da gB no diagnóstico do HCMV remeteu-nos para o estudo do seu comportamento eletroquímico. Este estudo permitiu ainda inferir sobre a possibilidade de esta proteína viral interferir no sinal obtido durante a redissolução anódica das AgNPs no immunosensor. A análise foi primeiramente conduzida em SPE, os quais não possibilitaram a procura de um sinal associado à gB, permitindo no entanto concluir que não há interferência desta molécula no imunoensaio. Quando aplicado num sistema eletroquímico convencional, a gB gerou um sinal em meio tamponado, o que não se confirmou quando aplicado a amostras reais (urina)

Biosensors for Environmental Monitoring

Real-time and reliable detection of molecular compounds and bacteria is essential in modern environmental monitoring. For rapid analyses, biosensing devices combining high selectivity of biomolecular recognition and sensitivity of modern signal-detection technologies offer a promising platform. Biosensors allow rapid on-site detection of pollutants and provide potential for better understanding of the environmental processes, including the fate and transport of contaminants.This book, including 12 chapters from 37 authors, introduces different biosensor-based technologies applied for environmental analyses

Biosensor development for the analysis of food quality

This thesis describes the development and evaluation of a number of biosensors for food applications. The first part of this thesis deals with the development of Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor systems, coupled with Polymerase Chain Reaction (PCR) for the detection of GMO related amplified nucleic acids in foodstuffs. The first SPR Biosensor described, used streptavidin-biotin linkage chemistry to attach a P35S nucleic acid probe on dextran-coated SPR transducer chips. Methodologies were developed for both the PCR stage and post-PCR sample preparation for the sensitive, rapid and cost-effective detection of GMO-specific amplified DNA sequences. The final embodiment of the method was an asymmetric PCR amplification system with a simple sample processing step (0.3 M NaOH for 30 min in 20 % v/v formamide). The developed PCR-SPR system was successfully applied to the screening of samples of GMO origin. The second SPR biosensor reported herein, is based on a SPR chip immobilised single-stranded thiolated DNA. The thiolated probe exhibited a hybridisation capacity of 95 RU (Resonance Units) for 100 nM of complementary DNA target and a detection limit of 5 nM. The potential of the current probe system for the detection of symmetrically amplified DNA sequences of short length was subsequently confirmed. The second part of this thesis involved preliminary studies into the development of simple, disposable screen-printed electrodes for the electrochemical determination of glucose and L-amino acids in horticultural products. The dynamic range of the developed biosensors was up to 10 mM for glucose and up to 1 mM for L-leucine determination. The developed glucose biosensor exhibited encouraging analytical performance in fresh fruit samples. However, the L-amino acid oxidase electrodes consistently underestimated the amino acid content of the fruit samples. The latter observation was found to be primarily due to inhibitory components in the matrix.EThOS - Electronic Theses Online ServiceGBUnited Kingdo

A Systematic Approach to Developing National Technology Policy and Strategy for Emerging technologies

As the pace of global competition increases, a country\u27s competitiveness becomes of greater concern. Technology drives competitiveness and is a crucial factor for economic development in developed and developing economies. This poses a need for governments to be involved in supporting technology research and development in their countries. A government must not only provide support when an emerging technology is being considered, it should also nurture and guide its development. The effective national technology policies and strategies should go beyond merely identifying the critical technologies. This research has developed a systematic and comprehensive approach for policy makers to strategically define the national technology policy for emerging technologies. A hierarchical decision model was built and expert opinions were quantified. There are four levels in the hierarchy: mission, objectives, technological goals, and research strategies. This research has also demonstrated several approaches for the validation and analysis of results. The inconsistency measure, intraclass correlation coefficient, and statistical test for the reliability of the experts and group agreement were used for this purpose. Finally, HDM sensitivity analysis was used to study the robustness of the rankings, especially at the technology level. Change may be caused at this level when the national policies change, which is a relatively common occurrence. The approach developed in this research was applied to the assessment of nanotechnologies for Thailand\u27s agriculture. The seven nanotechnologies such as nanosensors, nanodevices for identity preservation and historical tracking, novel tools, smart treatment delivery system, nanomaterials, nanoparticles, and agro-environment were assessed and evaluated with respect to the national mission, Be the world leader in developing a sustainable food and agricultural-based economy. According to the experts, the top three nanotechnologies supporting Thailand\u27s agricultural development are novel tools (26%), smart treatment delivery systems (24%), and nanosensors (23%). Research strategies supporting specific nanotechnologies were also identified and evaluated. As a result, a ranking of research strategies according to theirs contributions to the overall mission was developed

Application of graphene in electrochemical sensing

Graphene possesses distinctive properties such as chemical stability, wide potential window and large surface area, making it an ideal electrode material that could potentially yield significant benefits in many electrochemical applications. The quality of graphene has an enormous impact on its electrochemical performance. It is therefore necessary to study the influence of defects and impurities on the amperometric performance of graphene towards the sensing of a target analyte. This thesis studies the critical role of the fabrication routes of graphene materials on their efficiency and electrochemical performance, putting emphasis on the influence of defects and impurities on direct amperometric detection of hydrogen peroxide. It is found that the sensors based on graphene with lower number of defects lead to a higher sensitivity towards H2O2. Furthermore, graphene's electrochemical and amperometric properties for non-enzymatic glucose determination based on electrodeposition of NiO nanoparticles have been investigated. To address this issue, CVD graphene was patterned with arrays of antidot lattices to provide artificial dangling positions for attachment of nanoparticles to the graphene surface. It is demonstrated that the nanopatterned graphene exhibited better performance in glucose sensing compared to pristine CVD graphene, and efficient tailoring of the size and lattice constant of the antidots on graphene surface can optimize electrodeposition of NiO nanoparticles and the amperometric response of graphene-based sensors towards glucose detection

Biosensors

A biosensor is defined as a detecting device that combines a transducer with a biologically sensitive and selective component. When a specific target molecule interacts with the biological component, a signal is produced, at transducer level, proportional to the concentration of the substance. Therefore biosensors can measure compounds present in the environment, chemical processes, food and human body at low cost if compared with traditional analytical techniques. This book covers a wide range of aspects and issues related to biosensor technology, bringing together researchers from 11 different countries. The book consists of 16 chapters written by 53 authors. The first four chapters describe several aspects of nanotechnology applied to biosensors. The subsequent section, including three chapters, is devoted to biosensor applications in the fields of drug discovery, diagnostics and bacteria detection. The principles behind optical biosensors and some of their application are discussed in chapters from 8 to 11. The last five chapters treat of microelectronics, interfacing circuits, signal transmission, biotelemetry and algorithms applied to biosensing

Iowa State University, Courses and Programs Catalog 2014–2015

The Iowa State University Catalog is a one-year publication which lists all academic policies, and procedures. The catalog also includes the following: information for fees; curriculum requirements; first-year courses of study for over 100 undergraduate majors; course descriptions for nearly 5000 undergraduate and graduate courses; and a listing of faculty members at Iowa State University.https://lib.dr.iastate.edu/catalog/1025/thumbnail.jp