The effects of Bilirubin and Bilirubin-di-taurate on ischemia reperfusion injruy in a rat model of kidney transplantation

Background: Heme oxygenase-1 (HO-1) is the rate-limiting enzyme in the conversion of heme into biliverdin, carbon monoxide (CO) and free iron. Biliverdin is then subsequently reduced to bilirubin by the enzyme bilverdin reductase. In the past decades a lot of effort was conducted to investigate the beneficial effects of HO-1 and its end products biliverdin/bilirubin and CO. Due to intensive research, solid organ transplantation can nowadays be seen as clinical routine. However ischemia reperfusion injury (IR), acute rejection episodes and the occurrence of chronic rejection remain main problems. The severity of IRI can be seen as a prognostic factor for early graft function, immunogenecity of grafts as well as for long term graft survival. The goal of our experiments was to investigate the potential beneficial effects of bilirubin and biliverdin on ischemia reperfusion in a kidney transplantation model of the rat. Methods: Two different sets of experiments were performed: First, kidneys of Lewis rats were exposed to 60 minutes of warm ischemia by clamping the renal artery followed by a 24h reperfusion period. This model was used to find the optimal dosing regimen of bilirubin/biliverdin before the more clinical relevant model of kidney transplantation in the rat was performed. We found that three doses of 10mg/Kg bilirubin were the most effective dose regimen to protect kidneys from ischemia reperfusion injury. In the second set of experiments, kidney transplantation was performed in Lewis rats. Kidneys were harvested and stored in 4C cold UW-solution for 18h. Subsequently the kidneys were transplanted isotopically into the recipient rat. Time of warm ischemia was kept in all experiments constantly at 60 minutes. After 24h of reperfusion tissue samples and serum were harvested for further analyses. Results: Systemic treatment of bilirubin led to a significant amelioration of organ function after ischemia reperfusion injury as assessed by measuring serum creatinine levels and BUN levels after 24h of reperfusion. In addition treated animals showed increased eGFR and a better cell integrity as histomorphological analyses could demonstrate. Conclusion: Systemic treatment with bilirubin and bilverdin has beneficial effects on graft function after ischemia rerperfusion injury

Untersuchung neuroprotektiver Effekte der intrathekalen Baclofenapplikation

Cerebral-ischämische Erkrankungen nehmen eine wichtige Rolle bei der Versorgung neurologischer und neurochirurgischer Patienten ein. Sie sind darüberhinaus ein enormer gesundheitsökonomischer Faktor. Während die Erkenntnisse über die Pathophysiologie dieser Erkrankungen in den letzten Jahrzehnten rasch zugenommen haben, stagniert die Umsetzung pharmakologischer Therapieansätze aus verschiedenen Gründen. Dies macht die Notwendigkeit der Erprobung neuer, klinisch anwendbarer Substanzen in der Klasse der Neuroprotektiva deutlich. Baclofen, ein selektiver Agonist am GABAB-Rezeptor, stellt ein seit ca. drei Jahrzehnten probates Pharmakon bei der Behandlung der spastischen Muskeltonuserhöhung dar. Neben der oralen oder intravenösen Darreichungsform kommt der intrathekalen Gabe von Baclofen eine zunehmend größere Bedeutung bei der Behandlung von Patienten mit Spastiken zu. Ergänzend zu dieser Indikation kristallisierten sich während der letzten Jahre neue Anwendungsgebiete für diese Substanz heraus. Darunter auch die intrathekale Gabe von Baclofen bei Patienten mit schweren und schwersten Hirnverletzungen, während deren intensivmedizinischer Behandlung es zu nicht anders beeinflussbaren vegetativen Entgleisungen kam. Die vorliegende Arbeit versucht, einen Beitrag zur Aufklärung der Wirksamkeit von Baclofen als Neuroprotektivum zu leisten. An einem eigens entwickelten Modell der reversiblen, transienten, globalen Hirnischämie der Ratte wurde der Einfluß von intrathekal appliziertem Baclofen in einer Dosis von 6 μg/kg KG 30 Minuten vor und nach Durchführung einer zehnminütigen cerebralen Ischämie untersucht. Als Zielregion der Untersuchung diente das CA1-Areal des Hippocampus, in dem die Zellschädigung anhand der Anteile geschädigter vs. ungeschädigter Neurone bestimmt wurde. Verglichen wurden Baclofen-behandelte Tiere mit Kontrolltieren die dem gleichen Procedere unterzogen wurden, jedoch anstatt des Verums eine entsprechende Menge physiologischer Kochsalzlösung verabreicht bekamen. Untersucht wurden zusätzlich noch die Parameter Blutglukoseserumspiegel, Körperkern- und Kranialtemperatur, mittlerer arterieller Blutdruck, arterieller Sauerstoff-, Kohlendioxidpartialdruck und pH-Wert. In dem präischämischen Versuchsarm konnte keine neuroprotektive Wirkung für Baclofen festgestellt werden. Im Gegenteil, zeigte doch das Ausmaß der Zellschädigung einen zwar nicht signifikanten, jedoch deutlich erhöhten Anteil geschädigter Neurone. Diese Beobachtung konnte bei den postischämisch mit Baclofen behandelten Tieren nicht gemacht werden. Hier wurde eine geringfügig verminderte Zellschädigung beobachtet, ohne dass diese jedoch ein signifikantes Niveau erreicht hätte. In beiden Versuchsarmen kam es nach Applikation von Baclofen zu einer kurzzeitigen Blutdrucksenkung, die jedoch insbesondere im Fall des präischämischen Versuchsarms keinen Einfluß auf das intraischämische Blutdruckniveau mehr hatte. Allerdings ließ sich bei den präischämisch behandelten Tieren eine deutliche Ventilationseinschränkung mit Ausbildung einer respiratorischen Azidose und Hyperkapnie nachweisen. Dabei sollte bedacht werden, dass Baclofen als Agonist am GABA-Rezeptor mit Atemdepression und Sedierung vergleichbare substanzgruppenspezifische Nebenwirkungen besitzt, die auch anderen GABA-Agonisten, z.B. den Benzodiazepinen, eigen sind. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse lassen sich zunächst keine weiteren Rückschlüsse bezüglich der Fragestellung ziehen. Eine neurotoxische Wirkung von Baclofen kann genauso wenig ausgeschlossen werden wie ein neuroprotektiver Einfluß nachgewiesen werden kann. Zur weiteren Evaluation der Fragestellung müssen zusätzliche Untersuchungen durchgeführt werden. Diese sollten eine Dosis-Wirkungsstudie einschließen, ebenso wie die mechanische Ventilation der Tiere zum Ausschluß respiratorischer Einflüsse auf die neuronale Schädigung

Validierung von Genexpressionsanalysen in einem Mausmodell für Hirnschlag

Zusammenfassung: Zur Identifizierung wichtiger Signalgene beim Schlaganfall im Mausmodell wurden Genexpressionsprofile mit Hilfe der Affymetrix-GeneChip-Technologie anfertigt und mir zu Beginn dieser Arbeit zur Verfügung gestellt. Diese wurden mit einer unabhängigen Methode, der quantitativen real-time PCR, validiert. Dazu wurde in Wildtypmäusen (C57 black six) ein sechzigminütiger Verschluss der Arteria cerebri media verursacht und die Genexpressionsstärke von differentiell exprimierten Genen zu vier verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Es wurden Expressionswerte der ipsilateralen Hemisphäre relativ zur kontralateralen Gehirnhälfte errechnet und diese Werte anschließend graphisch mit den zu validierenden Hybridisierungsdaten verglichen. Von den 150 untersuchten Genen konnten 96 (63%) angesichts ihrer im Trend gleichförmigen Hoch- bzw. Herunterregulierung sehr gut belegt werden. Weitere 34% wurden aufgrund des Abweichens eines Messpunktes vom gesamten Trend als relativ gut validiert beurteilt. Für 3% bzw. 4 Gene konnte auf keine Bestätigung der Hybridisierungsdaten geschlossen werden. Aus Reproduzierbarkeitsexperimenten ergab sich eine mittlere Abweichung der CT-Werte von ±0,9 bzw. ein Fold Change-Wert von ±1,87. Die Expression einzelner, ausgewählter Proteine, z.B. Mt2, Blnk, Ccl9, Hmgb1, Plaur und Tlr2 sollte immunohistochemisch überprüft werden. Dabei auftretende Schwierigkeiten konnten noch nicht vollständig gelöst werden. Hierzu gehört die schlechte Fixierung des Gewebes aufgrund der ungenügenden Postfixierung mit PFA bzw. mit einem Methanol/Aceton-Gemisch. Gewebeschnitte PFA-perfusionsfixierter Mäusehirne konnten jedoch eine verbesserte Fixierung vorweisen und zusätzlich eine Spezifitätserhöhung der immunohistochemischen Färbung von Ccl9 ermöglichen. Bei Mt2 und Blnk führte erst das Verwenden eines Mouse-On-Mouse-Kits zur Detektion des Antigens mit monoklonalen Mausantikörpern. Die zu erwartende Regulierung von Hmgb1 und Tlr2 konnte teilweise dargestellt werden. Eine Zuordnung der differentiell exprimierten Gene war nur zu den bereits bekannten Signalwegen der Entzündung, der Apoptose und Zelldifferenzierung möglich

Kardiale Bildgebung beim (asymptomatischen) Diabetiker

Zusammenfassung: Der koronaren Herzkrankheit (KHK) kommt bei Diabetikern eine äußerst wichtige Bedeutung zu, da Diabetiker mit einer KHK eine stark erhöhte Mortalität aufweisen. Die Frage stellt sich, ob und wie Diabetiker auf eine KHK gescreent werden sollten. Bei Patienten mit Angina Pectoris und auch atypischen sowie anginaäquivalenten Symptomen (v.a. Dyspnoe) ist eine weitere Abklärung indiziert. Ein generelles Screening von asymptomatischen Patienten scheint unselektioniert nicht sinnvoll zu sein. Die einzige große prospektive Studie in dieser Hinsicht hat keinen Überlebensvorteil für gescreente Patienten gezeigt. Allerdings stellt sich die Frage, ob besondere Hochrisikogruppen identifiziert und gescreent werden sollten. Eine spezielle Situation stellt in dieser Hinsicht die präoperative Risikostratifikation dar. Werden die Patienten gescreent, stellt sich die Frage, ob beim Screening ein anatomischer Test (z.B. Kalzium-Scoring oder nichtinvasive Koronarangiographie) oder ein funktioneller Test (Ischämiesuche) zur Anwendung kommen soll. Bei Diabetikern mit bereits ausgebauter Therapie hinsichtlich koronarer Prävention dürfte eine anatomische Darstellung als erster Schritt weniger Sinn machen als eine funktionelle (außer bei fehlenden Veränderungen mit dann ausgezeichnet negativ prädiktivem Wert). Diese Aussage begründet sich damit, dass lediglich eine prognostisch relevante Ischämie eine invasive Abklärung nach sich ziehen würde, wogegen Verkalkungen oder weiche Plaques ohne Ischämie darin bestärken, dass Diabetiker eine gute Prävention brauchen. Somit ist es wichtig, Patienten individuell zu beraten und langfristig zu begleiten, insbesondere solange keine evidenzbasierten Guidelines verfügbar sin

Transiente cerebrale Ischämie : neuroprotektive Effekte von Bilobalid, Triheptanoin und Veränderungen im Alter

Der ischämische Schlaganfall zählt zu den häufigsten Todesursachen in den Industrienationen und hinterlässt die meisten überlebenden Patienten in einer Pflegebedürftigkeit. Trotz der hohen Inzidenz und der gravierenden Folgen eines Schlaganfalls gibt es bislang keine ausreichende medikamentöse Therapie zum Schutz der Nervenzellen. Die akute Versorgung beschränkt sich auf die Lyse des Thrombus, welcher die betroffene Hirnarterie verschließt, und auf symptomatische Maßnahmen. In der vorliegenden Dissertation wurden daher das neuroprotektiv wirkende Bilobalid, eine Substanz aus dem Ginkgo biloba Baum, und das anaplerotisch wirksame Triheptanoin auf ihre schützende Wirkung während eines ischämischen Schlaganfalls im Mausmodell untersucht. Zusätzlich wurden in der Bilobalid-Studie Tiere aus zwei verschiedenen Altersgruppen (6-8 Wochen gegen 18-24 Monate) verglichen. Der transiente Schlaganfall wurde in der Maus durch einstündigen Verschluss der mittleren Cerebralarterie (MCAO, middle cerebral artery occlusion) induziert. Bilobalid wurde prophylaktisch eine Stunde vor Induktion des Schlaganfalls intraperitoneal (10 mg/kg) oder lokal in das betroffene Hirnareal (10 µM) verabreicht. Alle durchgeführten Experimente wiesen auf eine deutliche Neuroprotektion durch die Gabe von Bilobalid hin. Ein Tag nach MCAO war die Infarktfläche durch die Gabe von Bilobalid signifikant vermindert. In den durchgeführten motorischen Verhaltenstests schnitten die Bilobalid-behandelten Tiere wesentlich besser ab als unbehandelte Tiere. Der beobachtete Schutzeffekt von Bilobalid wurde auf mitochondriale Prozesse zurückgeführt: Die nach Ischämie beobachteten Defizite in Komplex I der mitochondrialen Atmungskette wurden durch die Gabe von Bilobalid deutlich vermindert. Bilobalid verringerte außerdem den enormen Anstieg von extrazellulärem Glutamat und das Ausmaß der mitochondrialen Schwellung während MCAO. In der Altersstudie wurde deutlich, dass sowohl die motorische Aktivität der Tiere als auch einige zelluläre Prozesse wie die mitochondriale Atmung beeinträchtigt sind. Nichtsdestotrotz zeigte Bilobalid auch in gealterten Tieren einen deutlichen protektiven Effekt nach Ischämie. Das anaplerotisch wirksame Triheptanoin wurde den Mäusen in einer 14-tätigen Fütterungsstudie verabreicht (33 % der Gesamt-Kalorien). Deutliche Schutzeffekte der Triheptanoin-Diät wurden nach Ischämie sowohl in TTC-gefärbten Hirnschnitten als auch in motorischen Verhaltenstests beobachtet. Durch den anaplerotischen Effekt sollte einerseits der Citratcyclus mit Acetyl-CoA und Succinyl-CoA gespeist werden, andererseits könnte Succinat in Komplex II der Atmungskette als direkter Energielieferant dienen. Dieser theoretische Ansatz wurde experimentell bestätigt: Die Fütterung mit Triheptanoin bewirkte eine signifikante Aktivitätssteigerung der mitochondrialen Komplexe II und IV nach MCAO. Die durch Ischämie gesenkten ATP-Spiegel und das Membranpotential wurden durch die anaplerotische Diät ebenfalls deutlich erhöht. Triheptanoin bewirkte zudem eine signifikante Reduktion des extrazellulären Glutamat-Anstiegs wŠhrend der MCAO. Die Auswirkungen eines Schlaganfalls wurden demnach sowohl durch die prophylaktische Gabe von Bilobalid eine Stunde vor Ischämie als auch durch die 14-tägige Triheptanoin-Diät maßgeblich vermindert. Beide Substanzen zeigten im Mausmodell bemerkenswerte neuroprotektive Effekte und könnten daher auch beim Auftreten eines humanen Schlaganfalls entscheidende Vorteile bringen. Der präventive therapeutische Einsatz von Bilobalid oder Triheptanoin sollte daher in klinischen Studien weiter verfolgt werden

Untersuchung der Apoptose in kardialen und kardiovaskulären Erkrankungen: Bedeutung von Stickstoffmonoxid

Die Bedeutung der Apoptose und die zugrundeliegenden Mechanismen in verschiedenen pathophysiologischen Zuständen des Herzens sind noch weitgehend ungeklärt und es bleibt zu zeigen, daß die Apoptose-Signaltransduktion ähnlich reguliert wird, wie aus in vitro-Versuchen bekannt ist. Deshalb wurde die Apoptose in verschiedenen Tiermodellen kardialer Erkrankungen untersucht werden, um Hinweise auf die zugrundeliegende Signal-transduktion, durch Analyse der Proteine Bcl-2 und Bax, der finalen Exekutor-Caspase Caspase-3 oder p53 zu bekommen. Apoptose in der durch Hyperlipidämie induzierten Atherosklerose: In Aorten von 'Froxfield Heritable Hypercholesterolemic'-Kaninchen (genetische Hyperlipidämie) korrelierte die Apoptose von vaskulären glatten Muskelzellen und Makrophagen in fortgeschrittenen fibrösen Plaques mit einem 18-fachen Anstieg des proapoptotischen Bax. In Aorten Cholesterin gefütterter 'New Zealand White'-Kaninchen (0,25% Cholest., 12 Wochen) konnte eine erhöhte Baxexpression in Endothelzellen nachgewiesen werden, ohne daß morphologische Veränderungen zu beobachten waren. Die Apoptose in akut abgestoßenen allogenen Herztransplantaten (Rattenmodell) war von einer erhöhten Bax-Expression und einer totalen, posttranslationalen Degradation des antiapoptotischen Bcl-2 in ein spezifisches Degradationsprodukt durch eine Serinprotease gekennzeichnet. Die Rolle des wichtigen kardiovaskulären Mediators Stickstoffmonoxid (NO) auf die Apoptose wird kontrovers diskutiert. Da in der Zellkultur protektive Effekte von NO gezeigt werden konnten, wurde deren physiologische Relevanz in der durch Ischämie/Reperfusion induzierten Apoptose ex vivo im Langendorff-Rattenherzen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Hemmung der endogenen NO-Synthese mit L-NG-Monomethyl-L-Arginin (LNMMA, 1mM) die Apoptose potenzierte und mit einer Aktivierung der Caspase-3 korrelierte. Bcl-2 und Bax wurden nicht reguliert. Untersuchung der Regulation der Proteinexpression der eNOS (endotheliale NO-Synthase) durch den proinflammatorischen/ proatherogenen Tumor-Nekrose-Faktor-[Alpha] (TNF[Alpha]) in der Endothelzellkultur (HUVEC) gaben Hinweise auf einen, die eNOS schützenden, Interaktionspartner. Zusammenfassend konnte in allen untersuchten Modellen für Herz(-Kreislauf)-Krankheiten Apoptose nachgewiesen werden, die jeweils spezifische Charakteristika zeigt, deren genauere Aufklärung interessante Ziele zukünftiger präventiver und therapeutischer Maßnahmen verspricht. Die Befunde weisen zudem auf antiapoptotische Effekte von NO - insbesondere durch die endotheliale NO-Synthaseaktivität - hin, deren genauere Charakterisierung dazu beitragen könnte, pathophysiologische Zustände der kardiovaskulären Biologie zu erklären.Apoptosis is a distinct form of cell death that has been under intensive investigations in the past few years. Many signalling pathways were elucidated in cell-free systems or in intact cells. But only little is known about apoptosis in cardiac and cardiovascular diseases. Therefore, the aim of this study was to investigate apoptosis in various cardiac diseases: in hyperlipidemia induced atherosclerosis, in acute rejected heart transplants, in ischemia and reperfusion as well as in chronic hypoxia. Atherosclerosis is the main contributor to myocardial infarction. Also hyperlipidemia is a known major risk factor. To investigate apoptosis in hyperlipidemia induced atherosclerosis, genetically induced hyperlipidemia in Froxfield Heritable Hypercholesterolemic Rabbits (FFH, n=8) was compared with New Zealand White rabbits either fed with a cholesterol diet (H, n=8, 0,25% cholesterol, 3% coconut oil) or with a normal diet (control, n=5) for 12 weeks. To determine apoptosis DNA-laddering and immunohistochemical TUNEL-stainings were performed. In advanced fibrous plaques of FFH rabbits apoptosis of vascular smooth muscle cells (VSMCs) and macrophages (M|os) correlated with a drastic 18-fold increased expression of proapoptotic Bax. The antiapoptotic protein Bcl-2 remained unchanged. In conclusion, apoptosis in advanced plaques seems to be a double edged sword: apoptosis of VSMCs may lead to plaque rupture due to diminished collagen synthesis and following myocardial infarction. In contrast, apoptosis of M|o could induce plaque stabilisation. Cholesterol diet did not induce morphological changes of the aortas in spite of elevated serum cholesterol. A doubling of Bax expression was observed in endothelial cells, indicating the induction of apoptosis in this cell type. Apoptosis of endothelial cells could be an initial manifestation leading to endothelial dysfunction and subsequent plaque development. The increased expression of Bax seems to correlate with elevated Low Density Lipoprotein (LDL) levels in both models underlining the induction of apoptosis by elevated serum LDL. Heart transplantation is a common therapeutical option in the terminal stages of heart failure. The most important complications are acute rejection and chronic vasculopathy of the transplants. To investigate apoptosis as an effector mechanism of acute rejection, the model of allogenic heart transplantation from Wistar Furth to Lewis rats (n = 15) was used. These hearts were rejected from 6 to 10 days after transplantation. Apoptosis in acute rejected heart transplants was characterised by an enhanced (3-fold) expression of Bax. Bcl-2 was completely degraded into a specific degradation product of about 17 kD. An RNase protection assay with multiple probes revealed no transcriptional changes of mRNA levels in acute rejected compared to control hearts. The posttranscriptional degradation of Bcl-2 was further analysed in a radioactive assay in vitro. The involvement of a serine protease which is sensitive to nitric oxide (NO) and dithiotreitol (DTT) was eludicated. Apoptosis and in particular the elevated ratio of proapoptotic Bax to antiapoptotic Bcl-2 could be responsible for transplant rejection. In addition, the degradation of Bcl-2 could also contribute to transplant rejection probably due to diminished antiapoptotic Bcl-2 levels or by producing an apoptotic degradation fragment. Myocardial infarction is either a consequence of atherosclerotic vessel occlusion or of transplantation. Typically it is accompanied by a loss of cardiomyocytes. Ischemia/ reperfusion is an accepted model for myocardial infarction. To investigate apoptosis in ischemia/reperfusion, hearts from male Wistar Furth rats were perfused ex vivo in a Langendorff apparatus (n=6 per group; 30 minutes equilibration, 30 min. global ischemia, 30 min. reperfusion). Reperfusion, but not ischemia alone induced apoptosis. Apoptosis was accompanied by the activation of caspase-3, a member of the apoptosis inducing caspase-cascade (as determined by western blotting and a radioactive assay in vitro). In contrast to acute hypoxia in ischemia, chronic hypoxia in Wistar Furth rats (21 days 10% O2, n=4) resulted in apoptosis of the hearts which was characterised by a doubling of proapoptotic Bax and a halffold reduction of antiapoptotic Bcl-2. Thus the enhanced ratio of Bax to Bcl-2 could be responsible for apoptosis in chronic hypoxia. Myocardial diseases are often accompanied by a reduction of endogenous nitric oxide. The role of nitric oxide in apoptosis is discussed controversially. The physiological relevance of antiapoptotic NO-effects was demonstrated in ischemia/ reperfusion experiments. Inhibiting the endogenous NO-synthase in ischemia/reperfusion with its competitive inhibitor L-NG-Monomethyl-L-arginine (LNMMA, 1 mM) potentiated apoptosis. In addition, caspase-3 was activated suggesting protective effects of the endogenous NO production due to an inhibiting interference with caspase-3. These results were underlined by the observations that hearts of endothelial nitric oxide synthase (eNOS)-knockout-mice (n=2 per group) showed apoptosis, which correlated with an elevated Bax expression. All taken together, apoptosis was demonstrated in all models under investigation. Apoptosis shows specific characteristic features in the distinct cardiac/cardiovascular diseases providing future targets for prevention and therapy. Proatherosclerotic and proinflammatoric factors are known to inhibit endogenous NO release. Therefore, the regulation of eNOS protein synthesis in response to tumour necrosis factor [Alpha] (TNF[Alpha]) in the presence of cycloheximide (CHX, an inhibitor of protein synthesis) was analysed in human umbilical vein endothelial cell cultures (HUVEC). The apoptotic stimuli TNF[Alpha]/CHX resulted in the proteolysis of eNOS. The diminished eNOS protein levels were accompanied by a reduced enzyme activity suggesting an antiapoptotic function of the endogenous NO synthesis. Inhibition of the proteasome with ZLLLH, a proteasome-specific inhibitor, only reversed eNOS proteolysis induced by TNF[Alpha]/CHX indicating the involvement of a protein which is interacting with eNOS. eNOS itself seems not to be degraded by the proteasome, because ZLLLH had no effect on TNF[Alpha] induced degradation. In conclusion, these results suggest the presence of a protective eNOS associated protein which is degraded by TNF/CHX leading to a subsequent degradation of eNOS. The chaperone Hsp90 could be such an eNOS interacting protein. However, in our system we could not observe a significant role of HSP70 or Caveolin-1 in eNOS degradation. Immunoprecipitation studies revealed the involvement of an eNOS interacting protein of around 70 kD molecular weight. This protein has still to be identified. In summary, nitric oxide, especially derived from eNOS, seems to be protective against apoptotic cell death. Elucidating the mechanisms leading to a decreased NO production by the eNOS could help to explain pathological disorders of the cardiovascular biology

Die Rolle von p53 und der Proteinphosphatase 2C in der neuronalen Apoptose

Störungen der neuronalen Apoptose sind an einer ganzen Reihe von Krankheitsbildern beteiligt, darunter so häufige wie Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und Schlaganfall. Daher ist es wichtig, die zugrundeliegenden Signalwege zu untersuchen, um die Zusammenhänge aufzuklären und die Möglichkeit der therapeutischen Intervention zu schaffen. Im ersten Teil der vorliegenden Untersuchungen wurden die neuroprotektiven Eigenschaften des p53-Inhibitors Pifithrin-a im in vivo-Modell der transienten globalen Ischämie der Ratte getestet. Die Vorbehandlung mit dem Hemmstoff konnte die Schädigung der hippokampalen CA1-Neurone reduzieren; Pifithrin-a war damit neuroprotektiv. Der Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Untersuchung der Rolle der Proteinphosphatase 2C in der ölsäureinduzierten Apoptose. Die Isoformen a und b dieser magnesiumabhängigen Serin/Threonin-Phosphatase werden durch Fettsäuren mit definierten Strukturmerkmalen aktiviert. Für die PP2C-aktivierende Ölsäure konnte im übrigen gezeigt werde, dass sie in bestimmten Systemen Apoptose hervorruft. Um herauszufinden, ob zwischen diesen Ereignissen ein Zusammenhang besteht, wurde zunächst ein Modell etabliert, in dem die Ölsäure in der humanen Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y konzentrations- und zeitabhängig Apoptose auslöst. Schließlich wurde gezeigt, dass PP2C-aktivierende Fettsäuren sowohl SH-SY5Y-Zellen als auch kultivierte embryonale kortikale Neurone der Ratte schädigen konnten, während nicht-aktivierende zwar ebenso gut von den Zellen aufgenommen wurden, aber keine Apoptose zu induzieren vermochten. PP2Ca wird im Zytosol der SH-SY5Y-Zellen exprimiert, die PP2Cb zusätzlich im Zellkern. Die Behandlung mit Ölsäure änderte nichts an der durch Western Blotting und Immunzytochemie detektierten PP2C-Menge in der Zelle. Auch das PP2C-Substrat Bad wurde untersucht; da es ebenfalls im Zytosol lokalisiert ist, kann es prinzipiell auch in der Zelle mit der PP2C interagieren. Allerdings konnten nach der Behandlung mit Ölsäure eine Regulation weder von Gesamt-Bad noch von phosphoryliertem Bad, detektiert nach Immunpräzipitation, gezeigt werden. Zur Klärung der Beteiligung von Bad an der ölsäureinduzierten Apoptose sind daher weitere Untersuchungen notwendig. Da gegenwärtig noch keine spezifischen PP2C-Inhibitoren verfügbar sind, wurde ein Modell etabliert, in dem mit Hilfe der RNA-Interferenz durch gezielten Abbau der entsprechenden mRNA die PP2Ca und PP2Cb spezifisch und gleichzeitig herunterreguliert werden konnten. Schließlich wurden die RNAi-Zellen während des Zeitfensters der Downregulation nach dem üblichen Protokoll mit Ölsäure behandelt: Verglichen mit der entsprechenden Kontrolle waren die SH-SY5Y-Zellen mit reduziertem PP2C-Gehalt weniger stark geschädigt. Die Proteinphosphatase 2C ist also an der ölsäureinduzierten Apoptose von SH-SY5Y-Zellen beteiligt; ihre Hemmung, sei es durch Knockdown oder Inhibitoren, reduziert den Zelltod und könnte damit eine Möglichkeit auch zum therapeutischen Eingriff bei Zuständen mit pathologisch gesteigerter Apoptose bieten

Untersuchungen zum Einfluss von Glycin auf die Schädigung des Dünndarms der Ratte durch absolute mesenteriale Ischämie und Reperfusion

Die akute mesenteriale Ischämie ist ein meist tödlich verlaufendes Krankheitsbild des klinischen Alltags. Die Aminosäure Glycin ist eine quasi ubiquitär vorkommende einfache Substanz. In vielen experimentellen Tiermodellen wurde demonstriert, dass Glycin die mesenteriale Ischämie- und Reperfusionsschädigung vermindern kann und somit ein potentieller Therapieansatz dieses schwerwiegenden Krankheitsbildes ist. Allerdings wurde dies bisher nur in experimentellen Tiermodellen der sogenannten low-flow-Ischämie nachgewiesen, bei der das betroffene Gebiet der Ischämie noch von einem minimalen Blutfluss versorgt wird ohne eine adäquate Sauerstoffversorgung aufrecht zu erhalten. Ob und wie Glycin die Schädigung des Dünndarms durch absolute mesenteriale Ischämie und Reperfusion beeinflusst, ist bisher nicht bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein neuartiges und gut reproduzierbares Modell der segmentalen absoluten mesenterialen Ischämie und Reperfusion des Dünndarms der Ratte etabliert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine no-flow-Ischämie und Reperfusion zu einer stärkeren Schädigung des Dünndarms führt als eine low-flow-Ischämie und Reperfusion. Außerdem unterstützen die Ergebnisse größtenteils das Reflow-Paradoxon, einen pathophysiologischen Aspekt der Mikrozirkulation bei dem die Gewebeschädigung durch die Reperfusion paradoxerweise zunimmt, sowie das no-reflow-Phänomen, dass währenddessen die Kapillaren in der Reperfusion vermindert wiederdurchblutet werden. Das Hauptergebnis dieser Arbeit ist, dass die verwendete Glycindosis unter no-flow-Bedingungen die Schutzwirkung nicht so entfaltet wie unter low-flow-Bedingungen. Ein möglicher Erklärungsansatz ist, dass es während der langen no-flow-Ischämie von 60 Minuten zu einer Glycin-Depletion im Ischämie-betroffenen Gewebe und somit zu einem Wirkungsverlust nach einer längeren Ischämiezeit kommt. In einem low-flow-Ischämie-Modell dagegen kann Glycin weiterhin das betroffene Gewebe erreichen. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit applizierte Glycindosis könnte daher zu niedrig sein, um einen Schutzeffekt in diesem Tiermodell mit der vergleichsweisen hohen Ischämie-Reperfusionsschädigung zu bewirken. Ein anderer Erklärungsansatz ist, dass Glycin in Adenosin-triphosphat-depletierten Zellen antagonistisch an den Glycinrezeptoren wirkt. Um einen eventuellen Schutzeffekt von Glycin in der absoluten Ischämie nachzuweisen, müssten weitere Versuche durchgeführt werden. Beispielsweise könnte Glycin im Rahmen einer klinischen Studie bei einer Aortenaneurysma-Operation, die eine vollständige Unterbrechung der Dünndarmperfusion bedingt, infundiert werden. Wenn die Infusion von Glycin in der Spätphase der Erkrankung die Mortalität des Krankheitsbildes der akuten mesenterialen Ischämie reduzieren würde, würde dies einen enormen Fortschritt in der Therapie dieser meist tödlich verlaufenden Krankheit bedeuten

Angiogenese in chronischer Ischämie durch Rekrutierung vaskulärer Progenitorzellen mittels des künstlichen Adhäsionsmoleküls SDF-1-Fractalkine-GPI

Chronische Extremitätenischämien stellen eine sowohl subjektiv belastende als auch volkswirtschaftlich bedeutende Krankheitsentität dar. Dabei können etliche Patienten mit den zur Verfügung stehenden konventionellen Verfahren nicht befriedigend therapiert werden. Neuere Konzepte zur Zelltherapie der chronischen Therapie führten in der klinischen Erprobung dabei zu eher ausbaufähigen Resultaten. Unsere Gruppe konnte in Vorarbeiten zeigen, dass die exogene Applikation embryonaler Endothelprogenitorzellen (eEPCs) im Tiermodell zu einem deutlichen Effet auf die chronische Ischämie führt. Um diesen Effekt weiter zu steigern, wurde ein künstliches Fusionsmolekül aus dem Chemokin SDF-1 als Kopf, der Mucindomäne des Fractalkine als Rückgrat und einem GPI-Teil zur Verankerung im Endothel (SDF-Fractalkine-GPI oder S1FG) kloniert. Wir konnten ebenfalls in Vorarbeiten zeigen, dass dieses S1FG eEPCs in vitro und in vivo rekrutiert, und dass eine Vortransfektion des Endothels des Ischämiegebietes vor Applikation der eEPCs zu einer Steigerung des funktionellen Effekts führt. Wir stellten die Hypothese auf, dass ein Ersatz der exogenen Applikation der eEPCs durch eine Mobilisierung endogener vaskulärer Progenitorzellen ebenfalls zu einem guten funktionellen Effekt führt. Weiterhin sollte der genaue Rekrutierungsmechanismus des S1FG untersucht werden. Zur Untersuchung des funktionellen Effekts wurde wie in den Vorarbeiten ein Kaninchenmodell der chronischen Hinterlaufischämie gewählt, bei dem an Tag 0 die rechte Femoralarterie entfernt wurde. Nach Entwicklung eines chronischen Zustandes wurde am Tag 7 eine Angiographie beider Femoralisstromgebiete durchgeführt und entweder S1FG oder eGFP liposomal per Retroinfusion transfiziert. An den Tagen 9, 10 und 11 wurde jeweils 1 mg des kurzwirksamen CXCR4-Antagonisten AMD3100 oder 1 ml NaCl intraperitoneal injiziert. An Tag 35 wurde eine erneute Angiographie durchgeführt, das Tier getötet und die Hinterlaufmuskulatur entnommen. Die Angiogenese wurde über die mittels PECAM-1-Färbung bestimmte Kapillardichte gemessen, die Arteriogenese über die Mengenzunahme der in der Angiografie sichtbaren Kollateralen. Zur Messung der Perfusion wurden die Flussgeschwindigkeit in der Angiographie sowie fluoreszierende Mikrosphären verwendet. Um das Rekrutierungsprofil des S1FG in vitro zu eruieren, wurden statische Adhäsionsversuche mit PMNs auf transfizierten HMECs sowie Adhäsionsversuche in Flusskammern von THP-1-Zellen auf transfizierten HUVECs verwendet. Es zeigte sich, dass signifikant weniger PMNs auf S1FG-transfiziertem Endothel adhärieren, als auf Fractalkine-transfizierten HMECs, während die eEPC-Adhäsion signifikant besser war. Bei den Versuchen unter Schubspannung ergab sich durch S1FG-Transfektion keine signifikante Änderung der Anzahl rollender Zellen, während die Anzahl fest haftender Zellen signifikant höher war. Durch Zugabe eines L-Selektin-Antikörpers zu den THP-1-Zellen vor Superfusion konnte die Anzahl fest haftender Zellen wieder auf Kontrollniveau reduziert werden, während die Anzahl rollender Zellen leicht reduziert wurde. Zugabe von AMD3100 führte dort nicht zu einer signifikanten Änderung der Anzahl adhärierender Zellen, jedoch wurde durch AMD3100 die Stärke der Interaktion, gemessen als Anzahl nach Applikation hoher Flüsse noch adhärierender Zellen, wieder auf Kontrollniveau reduziert. Ein über andere Adhäsionsmoleüle vermitteltes Zellrollen ist also vermutlich eine Voraussetzung für eine adäquate S1FG-Funktion. Dabei würde es über SDF-1-CXCR4-Interaktion zu einer Erhöhung der Festigkeit der Bindung kommen. In Bezug auf den funktionellen Effekt im Tiermodell führte Verwendung von S1FG und AMD3100 zu einer signifikanten Steigerung von Kapillardichte, Kollateralenwachstum und Perfusion gegenüber der Kontrolle. Die Werte lagen dabei im selben Bereich wie durch Verwendung von S1FG und eEPCs erzielte Ergebnisse. Transfektion von S1FG ohne weitere Behandlung führte nicht zu einer signifikanten Änderung eines Parameters zur Kontrolle, während die Verwendung von AMD3100 zu moderaten Steigerungen bei Kapillardichte, und Kollateralenwachstum führte. Die Werte waren jedoch immer noch signifikant geringer als die nach Kombination von S1FG und AMD3100 erreichten Werte. Verwendung einer proteaseresistenten, funktionell jedoch aktiven Mutante für das SDF-1 im S1FG-Molekül führte nicht zu signifikanten Änderungen bei funktionellen Parametern, bis auf eine zwar signifikante, quantitativ jedoch geringe Verringerung des Kollateralwachstums. Zusammenfassend kann man sagen, dass die lokale Applikation eines künstlichen Adhäsionsmoleküls gemeinsam mit einer Mobilisierung knochenmarksständiger endothelialer oder vaskulärer Progenitorzellen zu einem deutlichen funktionellen Effekt führt, der den der Zellmobilisierung ohne Adhäsionssteigerung übertrifft. Dennoch birgt der Ansatz einige Risiken, wie die versehentliche Förderung von Tumorangiogenese oder die Beschleunigung des Wachstums atherosklerotischer Plaques. Zusätzlich bleibt unklar, welche Zellen genau durch das Adhäsionsmolekül rekrutiert werden, und ob es sich überhaupt um eine homogene Zellpopulation handelt. Weiterhin bleibt zu überprüfen, in welcher Weise die Wirksamkeit der Therapie durch chronische Defekte der Progenitorzellmobilisierung und -funktion, wie sie beispielsweise bei Diabetes oder Nikotinabusus auftreten, beeinträchtigt wird, und ob gegebenenfalls Optimierungsmöglichkeiten in Bezug auf das Mobilisierungsregime, den Aufbau des Adhäsionsmoleküls oder die Applikationsart bestehen. Nichtsdestotrotz stellt diese Methode einen vielversprechenden neuen Ansatz zur Verbesserung der bisher eher zwiespältigen Ergebnisse der Zelltherapie dar