Comparative Docking to Distinct G Protein–Coupled Receptor Conformations Exclusively Yields Ligands with Agonist Efficacy

G protein-coupled receptors exist in a whole spectrum of conformations which are stabilised by the binding of ligands with different efficacy or intracellular effector proteins. Here, we investigate whether three-dimensional structures of receptor conformations in different states of activation can be utilised to enrich ligands with agonist behaviour in prospective docking calculations. We focused on the β2-adrenergic receptor, as it currently is the receptor with the highest number of active-state crystal structures. Comparative docking calculations to distinct conformations of the receptor were used for the in silico prediction of ligands with agonist efficacy. The pharmacology of molecules selected based on these predictions was characterised experimentally, resulting in a hit rate of 37% ligands, all of which were agonists. The ligands furthermore contain a pyrazole moiety which has previously not been described for β2 -adrenergic receptor ligands and one of them shows an intrinsic efficacy comparable to salbutamol

Photochromic G-Protein Coupled Receptor Ligands

Diese Dissertation behandelt die Synthese, photophysikalische Charakterisierung und Anwendung von photochromen G-Protein gekoppelten Rezeptor-Liganden. Kapitel 1 beschreibt die Einbindung der bereits gut untersuchten Klassen der photochromen Dithienylethene und Fulgide in bekannte Dopamin-Rezeptor-Liganden wie 1,4-disubstituierte aromatische und Hydroxybenzoxazinon-Piperazine sowie Aminoindane. Es gelang, subtyp und funktionell selektive photochrome Liganden zu synthetisieren, welche mittels NMR-Spektroskopie und UV/VIS-Absorptionsspektroskopie charakterisiert wurden. Die photophysikalischen Eigenschaften der Dithienylethen Dopamin-Liganden wiesen eine hohe Ermüdungsresistenz in DMSO auf. Diese konnte in wässrigen Lösungen aufgrund des bekannten Twisted intramolecular charge transfer (TICT) jedoch nicht bestätigt werden. Einige Cyclopenten-Dithienylethene zeigten hohe photostationäre Zustände. Sie formten jedoch ein irreversibles Nebenprodukt, was den Abbau des Photoschalters zur Folge hatte. Bei Betrachtung der Fulgide konnten hohe photostationäre Zustände und eine Schaltbarkeit in polaren Lösungsmitteln festgestellt werden. Fulgimide mit Isopropyl-Rest wiesen ausschließlich eine Isomerisierung zwischen der offenen E-Form und der geschlossenen C-Form auf. Bei einer Konzentration von 1 nM zeigte ein offenes Isomer eines Cyclopenten-Dithienylethens eine 10-fach höhere Aktivierung des pharmakologisch bedeutenden D2S-Rezeptors als das geschlossene Isomer. Als alternativer Photoschalter wurde ein Indolyl-Fulgimid-Isomerenpaar (offen/geschlossen) entdeckt, dessen inverse Aktivierungs-eigenschaften im geschlossenen Zustand eine vierfach höhere Aktivität zeigte. Um die GPCR-regulierenden Photoschalter weiter zu optimieren und weitere biologische Erkenntnisse bezüglich des lichtinduzierten Schaltens am Rezeptor in vivo zu erhalten, müssen weitere Untersuchungen durchgeführt werden. Das Kapitel 2 handelt von peptidischen photochromen Neuropeptid Y4-Rezeptor (NPY Y4-Rezeptor) Liganden. Der NPY Y4-Rezeptor ist ein G-Protein Protein-gekoppelter Rezeptor und bindet als natürlichen Liganden das pankreatischen Polypeptid, ein Homolog des NPY. Selektive Y4-Rezeptor Agonisten wurden zur Behandlung von Fettleibigkeit vorgeschlagen. Hochpotente dimere peptidische Y4-Rezeptor (Y4R)-Agonisten, die aus zwei durch einen aliphatischen Linker verbundenen Pentapeptid-Einheiten bestehen, repräsentieren eine interessante Klasse an Y4R-Liganden. Basierend auf dieser Ligandenklasse wurden photoempfindliche Y4R-Liganden mit Azobenzolen, Azopyrazolen, Dithienylethenen und Fulgimiden synthetisiert, um strukturelle Anforderungen solcher Y4R-Agonisten bezüglich der Y4R-Bindung zu untersuchen. Die synthetisierten Y4R-Liganden beinhalten einen starren nicht aliphatischen, photochromen Linker, der ein reversibles Schalten in wässrigem Puffer ermöglicht und durchwegs hohe Y4R-Affinitäten aufweist. Dies zeigt, dass der Austausch des hochflexiblen aliphatischen Linkers durch einen weniger flexiblen photochromen Linker bezüglich der Y4R-Bindung gut toleriert wird. Unterschiede in der Affinität und Aktivierung des Y4R zwischen den jeweiligen Photoisomeren, welche sich in der räumlichen Orientierung und Flexibilität unterscheiden, waren nur gering. Dies lässt vermuten, dass die verbindende Einheit in dimeren Liganden bezüglich der Adaptierung von hoch affinen Bindungsmodi am Rezeptor eine weniger wichtige Rolle spielt. Da einige der photochromen Peptide einen schwächeren Partialagonismus als das Musterpeptid aufwiesen, könnten die vorliegenden Ergebnisse bei der Entwicklung von Y4R Antagonisten helfen. Die Synthese und biologische Untersuchung von kovalent bindenden photochromen GPCR- Liganden für die Einzelmolekülspektroskopie ist in Kapitel 3 dargestellt. Für Untersuchungen bezüglich kovalent gebundenen Photoschaltern wurden der ß2-adrenerge Rezeptor (ß2-AR) sowie der µ-Opioid-Rezeptor (µOR) betrachtet. Als hoch potente Agonisten für ß2-AR wurde BI-167107, für µOR Fentanyl verwendet. In beide Liganden wurden Azopyrazole eingebaut und kovalente Ankergruppen angefügt. Das Azopyrazol stellt die photochrome funktionale Einheit zwischen dem Pharmakophor und der Ankerposition dar. Die Änderung der Geometrie des kovalent gebundenen Liganden sollte die Bindung und Aktivierung beeinflussen. Es wurden verschiedene Synthesewege der pharmakologischen Kopfgruppe und der photochromen Einheit mit einer kovalenten Struktur, wie einem Disulfid oder einem Maleimid, entwickelt. Als entscheidender und letzter Schritt der Synthese der ß2-AR-Liganden wurde eine reduktive Aminierung durchgeführt, welche den kovalent bindenden Photoschalter mit der pharmakologischen Kopfgruppe verbindet. Die µOR-Liganden wurden mit einer Disulfid-Schutzgruppe oder durch post-Funktionalisierung eines Azopyrazol-Fentanylazides synthetisiert, wobei eine Maleimid- und N-Hydroxysuccinimidester-Funktion mittels Click-Reaktion installiert wurde. Die Untersuchung der photophysikalischen Eigenschaften der photochromen Liganden ergab eine sehr gute Ermüdungsresistenz und große thermische Halbwertszeiten der Azopyrazole. Erste biologische Untersuchungen zeigten hohe Bindungsaffinitäten für beide kovalente ß2-AR-bzw. µOR-Liganden am jeweiligen Wildtyp-Rezeptor und deutlich höhere Affinitäten an den verwendeten Mutanten der Rezeptoren. Hohe intrinsische Aktivitäten zeigten die synthetisierten Liganden in Experimenten mit ß-Arrestin-Assays (für ß2-AR) bzw. G-Protein-Aktivierung (für µOR). Letztendlich waren die Unterschiede in der Wirkung und Bindung zwischen den jeweiligen Photoisomeren nur gering. Da diese ersten Untersuchungen noch nicht die kovalente Bindung der Liganden berücksichtigten, sollten weitere Untersuchungen zur irreversiblen Bindung und der damit verbundenen Auswirkungen auf die Funktionalität durchgeführt werden, um ein besseres Verständnis der kovalenten Natur der Liganden zu bekommen

GPCR-OKB: the G protein coupled receptor oligomer knowledge base

Rapid expansion of available data about G Protein Coupled Receptor (GPCR) dimers/oligomers over the past few years requires an effective system to organize this information electronically. Based on an ontology derived from a community dialog involving colleagues using experimental and computational methodologies, we developed the GPCR-Oligomerization Knowledge Base (GPCR-OKB). GPCR-OKB is a system that supports browsing and searching for GPCR oligomer data. Such data were manually derived from the literature. While focused on GPCR oligomers, GPCR-OKB is seamlessly connected to GPCRDB, facilitating the correlation of information about GPCR protomers and oligomers

Restoration of myocardial β-adrenergic receptor signaling after left ventricular assist device support

ObjectiveLeft ventricular assist device support for patients with chronic heart failure can significantly improve β-adrenergic receptor signaling, which is likely critical to myocardial recovery. The mechanism underlying the restoration of β-adrenergic receptor signaling is unclear. This study investigates our hypothesis that restoration of cardiac β-adrenergic receptor signaling by left ventricular assist devices results from inhibition of the G protein–coupled receptor kinase-2, a G protein–coupled receptor kinase that specifically phosphorylates and desensitizes agonist-occupied β-adrenergic receptors.MethodsLeft ventricular β-adrenergic receptor signaling was assessed in biopsy specimens taken from patients with chronic heart failure (n = 12) at the time of left ventricular assist device implantation (heart failure group) and again at the time of heart transplantation (left ventricular assist device group). Signaling was also studied in left ventricular biopsy specimens from nonfailing control (n = 8) hearts (nonfailing control group). Signaling was assessed by measuring sarcolemmal membrane β-adrenergic receptor density, adenylyl cyclase activity, G protein expression, and G protein–coupled receptor kinase-2 expression and activity.ResultsLeft ventricular β-adrenergic receptor signaling was severely decreased in the heart failure group versus that seen in the nonfailing control group, as demonstrated by adenylyl cyclase activity. G protein–coupled receptor kinase-2 expression and activity was increased 3-fold in the heart failure group versus that seen in the nonfailing control group. After left ventricular assist device support, β-adrenergic receptor signaling was restored to levels similar to those seen in the nonfailing control group. G protein–coupled receptor kinase-2 expression and activity were markedly diminished after left ventricular assist device support compared with that seen in the heart failure group and were not different from that seen in the nonfailing control group.ConclusionIn chronic heart failure left ventricular assist device support leads to restoration of cardiac β-adrenergic receptor signaling. The primary mechanism appears to be diminished myocardial G protein–coupled receptor kinase-2 activity. This demonstrates the potentially beneficial effects of G protein–coupled receptor kinase-2 inhibition on β-adrenergic receptor signaling in heart failure and might represent a novel therapeutic strategy for this disease process

Spatial intensity distribution analysis: studies of G Protein-coupled receptor oligomerization

Spatial intensity distribution analysis (SpIDA) is a recently developed approach for determining quaternary structure information on fluorophore-labelled proteins of interest in situ. It can be applied to live or fixed cells and native tissue. Using confocal images, SpIDA generates fluorescence intensity histograms that are analysed by super-Poissonian distribution functions to obtain density and quantal brightness values of the fluorophore-labelled protein of interest. This allows both expression level and oligomerisation state of the protein to be determined. We describe the application of SpIDA to investigate the oligomeric state of G protein-coupled receptors (GPCRs) at steady state and following cellular challenge, and consider how SpIDA may be used to explore GPCR quaternary organisation in pathophysiology and to stratify medicines

G protein-coupled receptor dimerisation: molecular basis and relevance to function

The belief that G protein-coupled receptors exist and function as monomeric, non-interacting species has been largely supplanted in recent years by evidence, derived from a range of approaches, that indicate they can form dimers and/or higher-order oligomeric complexes. Key roles for receptor homo-dimerisation include effective quality control of protein folding prior to plasma membrane delivery and interactions with hetero-trimeric G proteins. Growing evidence has also indicated the potential for many co-expressed G protein-coupled receptors to form hetero-dimers/oligomers. The relevance of this to physiology and function is only beginning to be unravelled but may offer great potential for more selective therapeutic intervention