Advanced biosensors for detection of pathogens related to livestock and poultry

Infectious animal diseases caused by pathogenic microorganisms such as bacteria and viruses threaten the health and well-being of wildlife, livestock, and human populations, limit productivity and increase significantly economic losses to each sector. The pathogen detection is an important step for the diagnostics, successful treatment of animal infection diseases and control management in farms and field conditions. Current techniques employed to diagnose pathogens in livestock and poultry include classical plate-based methods and conventional biochemical methods as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). These methods are time-consuming and frequently incapable to distinguish between low and highly pathogenic strains. Molecular techniques such as polymerase chain reaction (PCR) and real time PCR (RT-PCR) have also been proposed to be used to diagnose and identify relevant infectious disease in animals. However these DNA-based methodologies need isolated genetic materials and sophisticated instruments, being not suitable for in field analysis. Consequently, there is strong interest for developing new swift point-of-care biosensing systems for early detection of animal diseases with high sensitivity and specificity. In this review, we provide an overview of the innovative biosensing systems that can be applied for livestock pathogen detection. Different sensing strategies based on DNA receptors, glycan, aptamers and antibodies are presented. Besides devices still at development level some are validated according to standards of the World Organization for Animal Health and are commercially available. Especially, paper-based platforms proposed as an affordable, rapid and easy to perform sensing systems for implementation in field condition are included in this review

Detection and Quantification of HspX Antigen in Sputum Samples Using Plasmonic Biosensing : Toward a Real Point-of-Care (POC) for Tuberculosis Diagnosis

Advancements that occurred during the last years in the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis infection, have prompted increased survival rates of patients. However, limitations related to the inefficiency of an early detection still remain; some techniques and laboratory methods do not have enough specificity and most instruments are expensive and require handling by trained staff. In order to contribute to a prompt and effective diagnosis of tuberculosis, we report the development of a portable, user-friendly, and low-cost biosensor device for its early detection. By using a label-free surface plasmon resonance (SPR) biosensor, we have established a direct immunoassay for the direct detection and quantification of the heat shock protein X (HspX) of Mtb, a well-established biomarker of this pathogen, directly in pretreated sputum samples. The method relies on highly specific monoclonal antibodies that are previously immobilized on the plasmonic sensor surface. This technology allows for the direct detection of the biomarker without amplification steps, showing a limit of detection (LOD) of 0.63 ng mL-1 and a limit of quantification (LOQ) of 2.12 ng mL-1. The direct analysis in pretreated sputum shows significant differences in the HspX concentration in patients with tuberculosis (with concentration levels in the order of 116-175 ng mL-1) compared with non-tuberculosis infected patients (values below the LOQ of the assay)

Point-of-care diagnostics for niche applications

Point-of-care or point-of-use diagnostics are analytical devices that provide clinically relevant information without the need for a core clinical laboratory. In this review we define point-of-care diagnostics as portable versions of assays performed in a traditional clinical chemistry laboratory. This review discusses five areas relevant to human and animal health where increased attention could produce significant impact: veterinary medicine, space travel, sports medicine, emergency medicine, and operating room efficiency. For each of these areas, clinical need, available commercial products, and ongoing research into new devices are highlighted

Construction of an immunosensor for human cytomegalovirus infection diagnosis

Human Cytomegalovirus (HCMV) is a herpes virus that establish a lifelong latent infection of the host, so once a person is infected, the virus persists in a state of cellular latency. Following primary infection, HCMV is excreted in body fluids and its transmission occurs through mucous contact and exposure to urine, blood transfusion and organ or bone marrow transplant procedures, being extremely difficult to identify the transmission route. HCMV infection induces no overt disease in healthy carriers, owing to effective immune control, but this infection can be severe or even fatal in immunosuppressed individuals, fetuses and newborns. Furthermore, HCMV is also relatively common among women in reproductive age, with seroprevalence ranging from 45 to 100%. The diagnosis of HCMV disease remains controversial because of the difficulty of separating patients who are asymptomatic but shedding HCMV in body fluids, from patients who have the symptomatic disease. Nowadays the most common methods for diagnosis of HCMV infection are: - serological tests based on IgM and IgG detection; - direct free HCMV detection by viral isolation and viral antigens detection in tissue, urine or saliva samples; and - PCR, which is based on amplification of selected segments of the HCMV genome and its hybridization. However, these methods are disadvantageous to be routinely used in clinical diagnosis as point of care because they require a long time to perform or are costly. Thus, there is a need to develop a method which is fast, effective and inexpensive for this virus diagnosis. As an alternative, the use of capture antibodies against the envelope glycoproteins of HCMV open the possibility of faster immunochemical methods. Glycoprotein B of HCMV (gB) is the dominant antigen in the envelope of HCMV, being possible its determination in body fluids like urine and saliva, where viral loads are higher. In consequence, the development of new methods based on the accurate detection of gB in body fluids, is of great interest. In recent years, electrochemical biosensors were widely used to determine various substances with different properties and for continuous monitoring of biological processes. Bioanalytical assays such as immunoassays (IAs), are also very important in many fields. IAs are based on antibodies ability to form complexes with the corresponding antigen, making them highly specific and selective. Thus, electrochemical immunoassays offer enhanced sensitivities and reduced instrumentation costs compared to their counterparts using other transducing elements. Also, screen-printed electrodes (SPE) contribute to develop miniaturized, easy to handle and reliable IAs devices. In addition, SPEs allow for a high-volume production of electrode systems with uniform size and geometry, ensuring measurement reproducibility at low cost. They are also very versatile, since a wide range of designs and materials can be applied in their construction. The present work describes the development of an alternative method for HCMV gB detection and quantification. It is intended the development of an immunosensor to quantify the presence of gB in urine samples. For the construction of this device we made use of a sandwich type immunoassay, wherein HCMV gB is sandwiched between a primary antibody, previously immobilized on a solid surface, and a labelled secondary antibody. Sandwich immunoassays are currently the most commonly and successfully used, mainly due to their high sensitivity and minimized background signal. Moreover, they can be performed on any kind of sensing surface, being the main criterion for these assays the availability of two antibodies with different binding sites on the target antigens. Three different immunoassays were developed. The first one was an electrochemical immunoassay, gB detection was carried out over electrochemical stripping analysis of silver nanoparticles quantitatively deposited on the immunosensor through catalysis by nanogold labels. Capture anti-gB antibodies were absorbed on screen-printed carbon electrodes, and a secondary anti-gB antibody labelled with gold nanoparticles. Nevertheless, the reproducibility of the method (RSDs ≈ 12%) was not very good owing to the random immobilization of the primary antibody on the working electrode, which resulted in small efficiency of antigen detection. Contributing to the low observed RSD was also the nonspecific deposition of silver on the sensor surface. For these reasons, it was decided the development of another approach to overcome the observed limitations. A spectrophotometric magnetic particle-based enzyme immunoassays (mpEIA) was constructed. The use of magnetic beads (MBs) functionalized with protein G (MBs-prG) as solid surface for primary antibody (mAb1) immobilization allows its oriented attachment, resulting in a more effective recognition of gB. Additionally, they improve the affinity interaction thanks to a faster assay kinetics of the dispersed beads in urine samples. The results obtained with this spectrophotometric mpEIA compared favorably to those obtained in other reports of gB detection in terms of analytical performance. Despite the advantages, ELISA readers cannot be applied as portable devices to make in situ measurements. It was then proposed an adaptation to electrochemical transduction on screen-printed electrodes. This variation aimed the achievement of a simple, sensitive, disposable and portable device. It was maintained the immunoassay scheme based on the analyte protein gB sandwiched between the primary monoclonal antibody and the secondary anti-gB-HCMV HRP labelled antibody. Similarly, magnetic particles functionalized with protein G (MBs-prG), were used. The developed immunosensor was shown to be a portable, fast, accurate, rigorous, low cost and an effective method of detecting gB in human urine samples for the valuable diagnosis/screening of HCMV infections.O citomegalovírus humano (HCMV) é o maior vírus da família Herpesviridae e da subfamília β-herpesviridae. Como em todos os vírus herpes, a infeção pelo HCMV resulta no estabelecimento de uma infeção latente ao longo da vida do hospedeiro. Assim, sempre que uma pessoa é infetada, o vírus persiste num estado de latência celular, no qual as células infetadas não produzem nenhuma partícula infeciosa do vírus, mas retêm o seu genoma completo, tendo potencial para começar a produzir partículas virais mais tarde. Após infeção primária, o HCMV é excretado em fluidos corporais, como urina, sangue, saliva, lágrimas, secreções vaginais e cervicais, sêmen e leite materno. Este processo pode durar de meses a anos. Dessa forma, o HCMV pode ser transmitido por via oral, congénita, sexual, através da exposição à urina, por transfusão de sangue e transplante de órgãos ou medula óssea, sendo extremamente difícil identificar a sua via de transmissão. O HCMV é considerado um vírus de paradoxos, pois este pode ser um potencial assassino ou um companheiro silencioso para toda a vida. Isto deve-se ao facto de a infeção pelo HCMV não induzir doença evidente em portadores saudáveis, devido a um controle imunológico efetivo, contudo a infeção pode ser grave e até fatal em indivíduos imunocomprometidos, como é o caso de transplantados, infetados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e aqueles com um sistema imunológico imaturo, como fetos e recém-nascidos. O HCMV também é considerado um dos mais bem-sucedidos parasitas, pois pode ser encontrado tanto em sociedades industrializadas e desenvolvidas como em grupos indígenas isolados, sendo a infeção por este vírus relativamente comum entre mulheres em idade reprodutiva, com seroprevalência variando de 45 a 100%. O diagnóstico da infeção por HCMV permanece controverso, pois é difícil separar os pacientes assintomáticos (mas que excretam HCMV em fluidos corporais) e que poderão vir a necessitar de terapia, de pacientes com doença sintomática (pneumonia ou retinite). Atualmente, os métodos laboratoriais para o diagnóstico da infeção por HCMV podem ser divididos em técnicas sorológicas e virológicas. Os métodos sorológicos são usados principalmente para avaliar os anticorpos do doador ou do recetor em situações de transplante e prever o risco de os pacientes imunocomprometidos virem a desenvolver doença sintomática. Por outro lado, o diagnóstico virológico da doença por HCMV é geralmente baseado no isolamento do vírus por métodos de cultura. Estes métodos podem ser usados mediante a utilização de amostras de sangue, urina, saliva, fezes, lágrimas, leite materno, secreções cervicais e vaginais e sêmen. Os métodos mais comuns para o diagnóstico da infeção por HCMV são então: - testes sorológicos baseados na deteção de IgM e IgG; - a deteção direta de HCMV através de isolamento viral em cultura de fibroblastos e deteção de antigénios virais em amostras de tecido, urina ou saliva; e - PCR, que se baseia na amplificação de fragmentos específicos do genoma do HCMV e sua posterior hibridização. No entanto, estes métodos apresentam alguns inconvenientes na sua aplicação como métodos de triagem em laboratórios de análises clínicas, pois requerem um longo período de tempo até à obtenção de um diagnóstico ou são caros. Assim, existe a necessidade de desenvolver um método que seja rápido, eficaz e barato para o diagnóstico deste vírus, capaz de ser usado em série. Nos últimos anos, os biossensores eletroquímicos foram amplamente utilizados na determinação de variadas substâncias com diferentes propriedades e para a monitorização contínua de processos biológicos. A deteção eletroquímica é usada devido a sua sensibilidade aprimorada e custos de instrumentação reduzidos em comparação com outros métodos de transdução. Para além disto, para desenvolver dispositivos eletroquímicos confiáveis, miniaturizados e gerenciáveis, a tecnologia screen-printing é uma escolha inteligente. Os elétrodos serigrafados (SPE) contribuem para o desenvolvimento de novos biosensores em dispositivos miniaturizados, que apresentam as vantagens acima descritas, permitindo a obtenção de resultados em poucos minutos. Adicionalmente, os SPEs permitem uma produção massiva de sistemas eletródicos com tamanho e geometria uniformes, garantindo reprodutibilidade entre medições a baixo custo. Outra mais-valia destes sensores é o facto de serem descartáveis, o que evita alguns problemas frequentemente associados aos elétrodos tradicionais, como a necessidade de um processo de limpeza. Eles são igualmente bastante versáteis, uma vez que uma ampla gama de designs e materiais podem ser aplicados para na sua construção. Na literatura podemos encontrar relatos do uso de dispositivos de deteção miniaturizados para o reconhecimento eletroquímico de sequências amplificadas de ADN provenientes de HCMV. Num desses trabalhos, baseado em elétrodos serigrafados, o ADN alvo foi adsorvido e hibridado com uma sonda de ADN biotinilada e os híbridos formados foram determinados com estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP). Apesar da amplificação de sinal ter sido conseguida, a atividade do conjugado tem de ser controlada periodicamente devido à estabilidade da enzima. Para superar essa limitação, um outro grupo explorou outra estratégia recorrendo a marcação do ADN com nanopartículas de ouro. Apesar de terem tido melhores resultados, ambos os métodos descritos não descartam a utilização de PCR, o que os torna dispendiosos e inúteis como métodos de triagem. Um sensor piezoelétrico também foi descrito para detetar a glicoproteína do HCMV. Embora a técnica não dependa de ADN amplificado, requer o uso de instrumentação cara. Adicionalmente, um dispositivo de deteção baseado em imunofluorescência foi desenvolvido por outro grupo, aqui a amostra biológica é aplicada sobre uma superfície de ouro revestida com anticorpos específicos para HCMV (se presente em amostras biológicas, o HCMV é aprisionado na superfície deste). Ensaios positivos e negativos eram discriminados pelo uso de uma sonda fluorescente. A principal desvantagem deste dispositivo é a baixa sensibilidade que compromete a sua aplicabilidade em amostras com baixas cargas virais. Recentemente, foi ainda proposto um imunoensaio para a deteção do antígeno pp65 do HCMV utilizando HPR e nanopartículas de Pt-Pd funcionalizadas com single-walled nanohorns de carbono. A abordagem permitiu a deteção rápida de HCMV, no entanto, o uso de elétrodos de carbono vítreo não é uma alternativa prática para um método de triagem. O presente trabalho descreve o desenvolvimento de um método alternativo para a deteção e quantificação de HCMV gB. O objetivo é construir um imunossensor que determine a presença de gB em amostras de urina. O uso de anticorpos de captura contra as glicoproteínas do envelope do HCMV abre a possibilidade para o desenvolvimento de novos métodos de análise imunoquímica. A glicoproteína B do HCMV (gB) é uma glicoproteína viral que desempenha um papel crucial na entrada do vírus na célula e surge durante os estágios iniciais de uma infeção pelo mesmo vírus. A gB também é o antigénio dominante presente no envelope do HCMV, sendo possível a sua determinação em fluídos corporais como a urina e saliva, onde as cargas virais são maiores. Como consequência, o desenvolvimento de novos métodos baseados na deteção de gB em fluídos corporais é de grande interesse. Para a construção dos dispositivos, usamos sempre imunoensaios com configuração em sandwich, pois a gB é colocada entre um anticorpo primário, previamente imobilizado numa superfície sólida, e um anticorpo secundário marcado. Os imunoensaios em sandwich são atualmente os mais frequentemente usados, principalmente devido a sua alta sensibilidade e correspondente minimização de interferências. Para além disto, podem ser realizados em qualquer tipo de superfície, sendo o principal critério destes ensaios a disponibilidade de dois anticorpos com sítios de ligação diferentes para o mesmo antigénio-alvo. Durante o decorrer deste trabalho foram desenvolvidos três imunoensaios diferentes. O primeiro foi um imunoensaio eletroquímico. Foram usados anticorpos de captura anti-gB absorvidos em elétrodos de carbono serigrafados e um anticorpo secundário anti-gB marcado com nanopartículas de ouro. A deteção de gB foi realizada por meio da análise eletroquímica de nanopartículas de prata depositadas quantitativamente no imunossensor através de catálise por nanopartículas de ouro, as quais foram utilizadas como marcadores do anticorpo secundário. A reprodutibilidade do método (RSDs de cerca de 12%) não foi muito boa devido à imobilização aleatória do anticorpo primário no elétrodo de trabalho, o que resultou numa pequena eficiência de deteção do antígeno (foram observados baixos sinais considerando a grande quantidade de anticorpo utilizado). Contribui-o também para a baixa RSD observada a deposição não específica de prata na superfície do sensor. Por estas razões, decidiu-se desenvolver outra abordagem para superar as limitações observadas. Desenvolvemos um imunoensaio enzimático espectrofotométrico baseados em partículas magnéticas (mpEIA). O uso de esferas magnéticas (MBs) funcionalizadas com proteína G (MBs-prG) como superfície sólida para a imobilização do anticorpo primário (mAb1) permite a sua fixação orientada, resultando num reconhecimento mais efetivo do gB. Para além disto, estas partículas melhoram a interação de afinidade graças a uma cinética de análise mais rápida. O anticorpo secundário foi marcado com HRP para possibilitar a deteção espectrofotométrica. Os resultados obtidos com este mpEIA espectrofotométrico são favoravelmente comparáveis com outros relatos de deteção de gB em termos de desempenho analítico. No entanto, apesar das vantagens, os leitores ELISA não podem ser aplicados como dispositivos portáteis para fazer medições in situ. Para superar essa limitação, o método mpEIA mencionado acima foi adaptado à transdução eletroquímica recorrendo ao uso de elétrodos serigrafados. Esta variação visou a obtenção de um dispositivo simples, sensível, descartável e portátil. É mantido o esquema de imunoensaio com base na proteína analítica gB intercalada entre um anticorpo monoclonal primário e o anticorpo secundário anti-gB marcado com HRP, que permite igualmente deteção eletroquímica. Da mesma forma, partículas magnéticas funcionalizadas com proteína G (MBs-prG) são usadas para permitir a imobilização orientada ao anticorpo (mAb1). O imunossensor desenvolvido mostrou ser um método portátil, rápido, preciso, rigoroso, de baixo custo e, portanto, eficaz na deteção de gB em amostras de urina humana para a valiosa triagem de infeções por HCMV

Fundamentals of SARS-CoV-2 Biosensors

COVID-19 diagnostic strategies based on advanced techniques are currently essential topics of interest, with crucial roles in scientific research. This book integrates fundamental concepts and critical analyses that explore the progress of modern methods for the detection of SARS-CoV-2

Chagas Disease Diagnostic Applications: Present Knowledge and Future Steps

Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a lifelong and debilitating illness of major significance throughout Latin America and an emergent threat to global public health. Being a neglected disease, the vast majority of Chagasic patients have limited access to proper diagnosis and treatment, and there is only a marginal investment into R&D for drug and vaccine development. In this context, identification of novel biomarkers able to transcend the current limits of diagnostic methods surfaces as a main priority in Chagas disease applied research. The expectation is that these novel biomarkers will provide reliable, reproducible and accurate results irrespective of the genetic background, infecting parasite strain, stage of disease, and clinical-associated features of Chagasic populations. In addition, they should be able to address other still unmet diagnostic needs, including early detection of congenital T. cruzi transmission, rapid assessment of treatment efficiency or failure, indication/prediction of disease progression and direct parasite typification in clinical samples. The lack of access of poor and neglected populations to essential diagnostics also stresses the necessity of developing new methods operational in point-of-care settings. In summary, emergent diagnostic tests integrating these novel and tailored tools should provide a significant impact on the effectiveness of current intervention schemes and on the clinical management of Chagasic patients. In this chapter, we discuss the present knowledge and possible future steps in Chagas disease diagnostic applications, as well as the opportunity provided by recent advances in high-throughput methods for biomarker discovery.Fil: Balouz, Virginia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Fernandez Aguero, Maria Jose. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Buscaglia, Carlos Andres. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); Argentin

Ten years of lateral flow immunoassay technique applications: Trends, challenges and future perspectives

The Lateral Flow Immunoassay (LFIA) is by far one of the most successful analytical platforms to perform the on-site detection of target substances. LFIA can be considered as a sort of lab-in-a-hand and, together with other point-of-need tests, has represented a paradigm shift from sample-to-lab to lab-to-sample aiming to improve decision making and turnaround time. The features of LFIAs made them a very attractive tool in clinical diagnostic where they can improve patient care by enabling more prompt diagnosis and treatment decisions. The rapidity, simplicity, relative cost-effectiveness, and the possibility to be used by nonskilled personnel contributed to the wide acceptance of LFIAs. As a consequence, from the detection of molecules, organisms, and (bio)markers for clinical purposes, the LFIA application has been rapidly extended to other fields, including food and feed safety, veterinary medicine, environmental control, and many others. This review aims to provide readers with a 10-years overview of applications, outlining the trends for the main application fields and the relative compounded annual growth rates. Moreover, future perspectives and challenges are discussed

One-Shot Full-Range Quantification of Multi-Biomarkers With Different Abundance by a Tandem Giant Magnetoresistance Assay

In this study, we reported a tandem giant magnetoresistance (GMR) assay that realized the one-shot quantification of multi-biomarkers of infection, C-reactive protein (CRP) with procalcitonin (PCT), and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), all of which could cover their clinically relevant concentration ranges under a different principle. In the presence of co-determined assay, we quantified these three biomarkers in undiluted human blood serum in a single test. The tandem principle, based on which quantification of CRP occurs, combines a sandwich assay and an indirect competitive assay, which allows for the discrimination of the concentration values resulting from the multivalued dose-response curve (\u27Hook\u27 effect), which characterizes the one-step sandwich assay at high CRP concentrations. However, the entire diagnostically dynamic range, in the quantification of PCT and NGAL, was achieved by differential coating of two identical GMR sensors operated in tandem and by combining two standard curves. The sensor quantified low detection limits and a broader dynamic range for the detection of infection biomarkers. The noticeable features of the assay are its dynamic range and small sample volume requirement (50 mu L), and the need for a short measurement time of 15 min. These figures of merit render it a prospective candidate for practical use in point-of-care analysis

Lateral flow test engineering and lessons learned from COVID-19

The acceptability and feasibility of large-scale testing with lateral flow tests (LFTs) for clinical and public health purposes has been demonstrated during the COVID-19 pandemic. LFTs can detect analytes in a variety of samples, providing a rapid read-out, which allows self-testing and decentralized diagnosis. In this Review, we examine the changing LFT landscape with a focus on lessons learned from COVID-19. We discuss the implications of LFTs for decentralized testing of infectious diseases, including diseases of epidemic potential, the ‘silent pandemic’ of antimicrobial resistance, and other acute and chronic infections. Bioengineering approaches will play a key part in increasing the sensitivity and specificity of LFTs, improving sample preparation, incorporating nucleic acid amplification and detection, and enabling multiplexing, digital connection and green manufacturing, with the aim of creating the next generation of high-accuracy, easy-to-use, affordable and digitally connected LFTs. We conclude with recommendations, including the building of a global network of LFT research and development hubs to facilitate and strengthen future diagnostic resilience