Flavoenzymes at the crossroads of biocatalysis and structural biology

Flavine-bevattende eiwitten zijn veelvoorkomende en veelzijdige natuurlijke katalysatoren. Deze eiwitten zijn in staat een grote verscheidenheid aan reductieve en oxidatieve reacties te versnellen. Om flavine-bevattende eiwitten beter te begrijpen, en hun potentiaal beter te kunnen benutten in een industriële setting, zijn gedetailleerde studies nodig. In dit proefschrift wordt de ontdekking, structuur opheldering en biochemische karakterisering van een aantal nieuwe (deaza)flavine-bevattende eiwitten beschreven. Deze enzymen zijn gevonden door middel van genome mining, en de behaalde resultaten laten zien hoe enzymologie en structurele biologie met elkaar verweven zijn. De ontdekte eiwitten zijn voorbeelden van robuuste biokatalysatoren die gemakkelijk op recombinante wijze verkregen en vervolgens gezuiverd kunnen worden. Met behulp van de opgehelderde structuur kunnen deze eiwitten verder ontwikkeld worden tot bruikbare oxidative enzymen om op grote schaal gebruikt te worden in biotechnologische toepassingen

Pyridine alcohols and thiols : synthesis, properties and applications

Enzymen spelen in het leven van mens, dier en plant een enorm grote rol. Enzymen zijn biologische katalysatoren dwz. versnellers van (bio)chemische processen die zich in levende organismen afspelen. Enzymen zijn eiwitten die opgebouwd zijn uit aminozuren. Om meer inzicht te krijgen in de werking van enzymen worden modellen van het actieve centrum gemaakt en bestudeerd. Modellen zijn over het algemeen kleiner dan de enzymen zelf en zijn hierdoor beter te bestuderen. Ook het aanbrengen van variaties voor het regelen van de substraatelectiviteit is hierdoor vergemakkelijkt. Aan de hand van enzymmodellen is het ook mogelijk om nieuwe katalysatoren voor chemische reacties te ontwikkelen. In dit proefschrift wordt het onderzoek beschreven naar enzym modellen van alcohol dehydrogenase en naar katalysatoren op basis van pyridine die uit dit onderzoek naar voren gekomen zijn. ... Zie: Samenvatting.

Biochemical and functional characterization of Nudix hydrolase enzymes with novel regulatory roles in Gram positive methylotrophic bacteria

Harm Kloosterman deed onderzoek naar een familie eiwitten, de Nudix hydrolases, die qua structuur en katalytische activiteit verwant zijn. Het zijn enzymen die de hydrolyse van een fosfaatbinding in een nucleotide kunnen katalyseren. Van twee leden van deze familie onderzocht Kloosterman de specifieke functie. Zo ontdekte hij onder andere dat Nudix hydrolases niet slechts de concentraties van verschillende nucleotiden kunnen reguleren, maar dat ze in bepaalde gevallen ook de functionele eigenschappen van nucleotide bindende eiwitten kunnen reguleren

Koemelk: Effecten van bewerkingen op gezondheid

A small percentage of the milk consumed in the Netherlands is raw, unprocessed milk. All milk distributed through shops and supermarkets are at least standardized and heat treated (e.g. pasteurized), and most of the consumption milk is homogenized. Yet, some consumers prefer to drink unprocessed, raw milk, because of its taste or expected positive health effect. In this report, the results of a literature research are presented. The changes in the milk as a result of processing and the potential effect of these changes on the health of humans are investigated

On the regulation of the metabolic shift and protein synthesis in Lactococcus Lactis

Het in dit proefschrift beschreven werk had als doelstelling de regulatie van het energiemetabolisme en eiwitsynthese in de melkzuurbacterie Lactococcus lactis beter te begrijpen. Deze bacterie werd gekozen vanwege zijn belangrijke rol in de zuivelindustrie. De leden van deze bacteriële soort groeien op melk en produceren o.a. melkzuur en peptiden (brokstukken van eiwitten), waardoor het melk kan omzetten in bijvoorbeeld yoghurt of kaas. Met een metabole verschuiving wordt bedoeld, de verandering van het ene type cellulaire metabolisme naar een andere als reactie op veranderende groeiomstandigheden. Afhankelijk van de hoeveelheid beschikbare suikers kan L. lactis groeien met verschillende snelheden. Bij lage groeisnelheid produceert L. lactis voornamelijk mierenzuur, azijnzuur en ethanol (de gemengde zuurfermentatie) en bij hoge groeisnelheid is melkzuur het voornaamste metabole eindproduct (homolactaatfermentatie). Om deze fermentatie producten te produceren heeft L. lactis verschillende sets van enzymen nodig en een ribosomenpool voor het synthetiseren van deze enzymen. De gestelde hypothese in dit proefschrift luidt dat afhankelijk van de eiwitten die verantwoordelijk zijn in de verschillende metabole reactiepaden, de investeringen in deze eiwitten (enzymen) variëren door de beschikbaarheid van substraat en daarmee van de groeisnelheid, hetgeen van invloed is op de metabole staat van de bacterie. Wij voerden tal van experimenten uit om de hypothese te testen. Onze analyses laten zien dat L. lactis een overcapaciteit aan enzymen heeft en ook de ribosomen (“eiwitsynthesefabrieken”) om deze enzymen te synthetiseren in stand houdt wanneer deze niet strikt noodzakelijk zijn. Deze enzymatische overcapaciteit geeft de cel de mogelijkheid om snel te reageren op veranderende voedselomstandigheden. In plaats van het variëren van de hoeveelheden van de enzymen en ribosomen, reguleert L. lactis de activiteiten ervan door gebruik te maken van verscheidene kleine moleculen. Onze resultaten laten zien dat de L. lactis bacterie altijd voorbereid is op situatie waarin het maximaal kan groeien en stoffen kan omzetten

Cell envelope stress responses upon protein overproduction in Bacillus subtilis

Bacillus subtilis wordt gebruikt in de productie van veel enzymen die nuttig zijn in de was en levensmiddelenindustrie en voor de ontwikkeling van farmaceutische producten. Ondanks eerdere verbeteringen van B. subtilis als een productiestam, door veranderingen van factoren die de verschillende stadia van de productie of secretie van enzymen beperken, kan eiwitproductie nog steeds moeilijk zijn. In dit proefschrift zijn stressreacties geïdentificeerd, die geactiveerd worden door de intensieve productie van homo- en heterologe eiwitten. Een specifieke reactie op membraan stress is gekarakteriseerd, inclusief de inductie van een mogelijk membraan-geassocieerd protease, en een nieuwe repressor van deze reactie is geïdentificeerd. Ook de onmisbaarheid van PrsA, een foldase die verantwoordelijk is voor een correcte vouwing van uitgescheiden eiwitten, is onderzocht. Dat PrsA essentieel is werd aangetoond omdat het indirect betrokken is bij laterale celwand biosynthese. B. subtilis is in staat om efficiënter gebruik te maken van voedinsstoffen door de expressie van genen te reguleren via CcpA gebonden aan cre boxen. Deze regulatie is relevant voor de industrie om de kweek van cellen in grote fermentaties te optimaliseren. cre boxen zijn geanalyseerd op een genoom-brede schaal. Verschillen in cre sequenties en posities ten opzichte van de transcriptie-startsites bleken de regulerende efficiëntie te bepalen. Dit proefschrift levert kennis over de moleculaire reacties van B. subtilis op de overproductie van membraaneiwitten en uitgescheiden eiwitten, die gebruikt kan worden voor verdere verbetering van B. subtilis als eiwitproductie-host. Bovendien biedt het gedetailleerd inzicht in de rol van de cre boxen bij de genexpressieregulering door de CcpA

Mestinnovatie "Bioraffinage van veevoergrondstoffen; een verkenning van opties om de verteerbaarheid van veevoergrondstoffen te vergroten en fosfaat te verwijderen"

Door het fractioneren van mengvoedercomponenten kan fosfor uit het veevoer verwijderd worden voordat het de koe of het varken ingaat. Hierdoor zal de mest minder fosfaat bevatten en dus gemakkelijker afzet kunnen vinden op het land van de omliggende boeren. De gewonnen fosfaat kan gebruikt worden als kunstmestvervanger. Dezelfde voorbehandeling kan ook leiden tot een betere verteerbaarheid van het voer. Omdat niet alle eiwitten in het voer door de dieren opgenomen kunnen worden, eten de dieren op dit moment meer eiwit dan strikt noodzakelijk. In deze studie is aangetoond dat de bovengenoemde strategie een bijdrage kan leveren aan de oplossing van de mestproblematiek. Verschillende lignocellulosehoudende mengvoeder grondstoffen zijn beter beschikbaar gemaakt m.b.v. organische zuren bij hoge temperatuur. Het voordeel van deze methode is dat de suikers uit de lignocellulosefractie bij gaan dragen aan de energiewaarde van het voer

De rol van Cladosporium fulvum-effectoreiwitten in virulentie

De resultaten van dit promotieonderzoek leveren een belangrijke bedrage aan ons begrip over hoe pathogene schimmels de basale verdediging van planten onschadelijk maken. Voor het eerst wordt er een duidelijke link gelegd tussen de biologische functie van twee effectoreiwitten, de C. fulvum-effectoren Avr2 en Avr4, en virulentie van de ziekteverwekker. Verder is een duidelijke rol in virulentie aangetoond voor de LysM-effector Ecp6. Vervolgonderzoek waarbij vergelijkbare strategieën gebruikt gaan worden als bij Avr2 en Avr4 zullen in de toekomst ook de biologische rol van deze effector duidelijk make