Dossier zur Beschreibung und Beurteilung von Züchtungsmethoden für den ökologischen Landbau

Chancen und Potenziale verschiedener Züchtungsmethoden für den Ökolandbau

Workshop: Züchtung für den Ökolandbau

Am 10. - 11. Juni 2002 fand beim Bundessortenamt in Hannover ein Workshop zum Thema "Züchtung für den Ökolandbau" statt. Bei der Sortenwahl haben für den Ökolandbau die Konkurrenzkraft gegenüber Unkräutern, die Nährstoffeffizienz und die Toleranz gegenüber Krankheitsbefall eine weit größere Bedeutung als im konventionellen Landbau. Die Krankheitstoleranz hat grundsätzlich sowohl für den Ökolandbau als auch für den konventionellen Landbau eine zunehmende Bedeutung. Die Gewichtung einzelner Krankheiten ist allerdings unterschiedlich, insbesondere aufgrund unterschiedlicher Fruchtfolgen und Bestandesdichten. Die Notwendigkeit einer abiotischen Stresstoleranz der Sorten ist für den Ökolandbau höher als für den konventionellen Landbau. Allerdings fehlen einfache Methoden zur Erfassung von Stresstoleranz. Der Produktqualität wird im Ökolandbau eine größere Bedeutung zugemessen, weil das Qualitätsargument bei der Vermarktung und Preisfindung einen höheren Stellenwert hat. Die Anforderungen an Lagereignung, Verarbeitungs- und Futterqualität sind im Ökolandbau höher, weil keine Hilfs- und Zusatzstoffe zur Verfügung stehen. Im Ökolandbau wird der Anbau gentechnisch veränderter Sorten nicht akzeptiert. Die Akzeptanz anderer biotechnischer Methoden der Pflanzenzüchtung wird zur Zeit in den Anbauverbänden des Ökolandbaues unterschiedlich diskutiert. Die Zertifizierung von Betrieben, die ökologisch züchten, wird gefordert. Die Forschungsförderung muß langfristig angelegt werden. Es muß sichergestellt werden, dass die Methoden der klassischen Pflanzenzüchtung, die sowohl im Ökolandbau als auch im konventionellen Anbau akzeptiert werden, weiterentwickelt werden

Beeinflussung des Ertragspotentials von Gerste und Weizen durch Modifikation ährenarchitektonischer Eigenschaften mittels Cas-Endonuklease-vermittelter Mutagenese

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Anwendung des Genome Engineerings mittels RNA-vermittelter Cas9-Endonuklease in den Getreidearten Weizen und Gerste. Dieses neue Werkzeug der Pflanzenzüchtung ermöglicht, innerhalb eines kurzen Zeitraumes spezifische Veränderungen im Genom von Getreide zu induzieren und dadurch gezielt Merkmale der Pflanzen zu verändern. Hierfür wurden zu verändernde Zielmotive im Weizen-Gen Branched head (Bh)/ Wheat frizzy panicle (Wfzp) bzw. in den Gersten-Genen Squamosa-promotor binding protein-like 14 und 17 (Spl14/Spl17) ausgewählt und passende guide RNA(gRNA)/cas9-Konstrukte kloniert. Die Aktivität der gRNAs wurde in Epidermiszellen von Weizen bzw. Gerste und in Weizenprotoplasten untersucht. Die stabile Transformation erfolgte anhand unreifer Embryonen über ballistischen Gentransfer (Weizen) bzw. durch Agrobakterien-vermittelte Übertragung von T-DNA (Gerste). Die anschließend regenerierten Pflanzen wurden auf die Anwesenheit der T-DNA und induzierter Mutationen untersucht. Im Weizen wurden mutierte Regenerate durch Selbstungen, Kreuzungen und die Anwendung von Haploidentechnologie in nachfolgende Generationen überführt und eine Kollektion von Pflanzen mit verschieden mutierten Allelen einschließlich Kombinationen mutierter homoeologer Allele zusammengestellt. Resultierende Pflanzen mit ein oder zwei mutierten Bh/Wfzp-Homoeoallelen waren T-DNA-frei und zeigten phänotypische Veränderungen der Ährenarchitektur, der Korngröße, der Kornanzahl und zum Teil auch bezüglich der Wurzeln. Das Vorhandensein von drei mutierten Bh/Wfzp-Homoeoallelen führte zum Teil zu sehr drastischen Veränderungen der Ähren, welche überzählige Ährchen und auch Verzweigungen ausbildeten. Jedoch führten diese Mutationen zu einem hohen Verlust an Fertilität. Insgesamt konnte die Bedeutung des Transkriptionsfaktors BH/WFZP für die Entwicklung der Ähre und der Körner sowie für die Wurzeln weiter erschlossen werden. Die in Gerste induzierten Mutationen in Spl14 führten grundsätzlich zu einer verzögerten generativen Entwicklung und teilweise zur Reaktivierung der Ausbildung der lateralen Ährchen. Die Ähren waren zudem verkürzt und bildeten weniger Körner. Die erzeugten Mutationen in Spl17 beeinflussten nicht die generative Entwicklung, jedoch die Ährenlänge und Kornbildung. Pflanzen mit Doppelmutationen in Spl14 und Spl17 zeigten eine drastische Verschärfung des spl14-Phänotyps, wobei die generative Entwicklung so sehr gestört war, dass keine Ähren ausgebildet werden konnten. Dies legt den Schluss nahe, dass SPL14 eine zentrale Rolle für die frühe generative Entwicklung spielt und SPL17 dabei als Co-Faktor wirkt.This thesis describes the application of genome engineering using RNA-mediated Cas9 endonuclease in the cereal species wheat and barley. This new breeding tool makes it possible to induce specific changes in the genome of cereals within a short period of time, thereby specifically modifying plant characteristics. For this purpose, target motifs were selected in the wheat gene Branched head (Bh)/ Wheat frizzy panicle (Wfzp) and in the barley genes Squamosa-promoter binding protein-like 14 and 17 (Spl14/Spl17) and suitable guide RNA (gRNA)/cas9 constructs were cloned. The activity of the gRNAs was investigated in wheat and barley epidermal cells and in wheat protoplasts. Stable genetic transformation was carried out via ballistic gene transfer (wheat) or Agrobacterium-mediated introduction of T-DNA (barley) to immature embryos. The subsequently regenerated plants were examined for the presence of T-DNA and induced mutations. In wheat, regenerated mutant plants were generatively propagated by selfing, crossing and the application of haploid technology, and a collection of individuals carrying various mutated alleles including combinations of mutated homoeologous alleles was deployed. Resulting plants with one or two mutant Bh/Wfzp homoeoalleles were T-DNA-free and showed phenotypic modifications in ear phenotype, grain size, grain number and partially in roots. The presence of three mutant Bh/Wfzp homoeoalleles typically led to very drastic changes in the ears, which formed supernumerary spikelets and were also branching, which was associated with a great loss in fertility. Overall, the importance of the transcription factor BH/WFZP for the development of the spike and the grains as well as for the roots was further elucidated in the present investigation. The mutations in Spl14 induced in barley led to delayed generative development and in some cases to the reactivation of lateral spikelet formation. In addition, the ears were shortened and formed fewer grains. The mutations produced in Spl17 did not affect generative development, but did affect ear length and grain formation. Plants carrying double mutations in Spl14 and Spl17 showed a drastic aggravation of the spl14 phenotype, with generative development severely disrupted so that no ears could be formed. This suggests that SPL14 exerts a major function in early generative development and SPL17 acts as a co-factor

Etablierung einer Mehltauresistenz in Weizen durch Suppression von MLO

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Pyramidisierung von QTL im Hinblick auf eine Verbesserung der Barley yellow dwarf virus Toleranz der Gerste und genetische Analyse der Toleranz gegenüber Wheat dwarf virus

Das blattlausübertragene Barley yellow dwarf virus (BYDV) und das zikadenübertragene Wheat dwarf virus (WDV) gehören zu den wirtschaftlich wichtigsten Pathogenen im Gerstenanbau, deren Bedeutung infolge der globalen Erwärmung zukünftig weiter steigen wird. Ziel der Arbeit war es einerseits, durch die markergestützte Kombination (Pyramidisierung) der in der Gerste gegen BYDV bekannten Toleranzallele Ryd2, Ryd3 und dem QTL auf Chromosom 2HL der Sorte 'Post' Erkenntnisse über die additive Wirkung dieser Loci zu gewinnen und andererseits die in der Sorte 'Post' nachgewiesene WDV-Toleranz genetisch zu analysieren. Für die Pyramidisierung der Toleranzallele gegen BYDV wurden DH-Linien aus einer Winter- und einer Sommergerstenkreuzung (ohne QTL 2H) erstellt. Diese wurden mit den für die entsprechenden Loci bekannten molekularen Markern genotypisiert und hinsichtlich ihres Toleranzverhaltens (Wuchs- und Ertragsparameter, Viruskonzentration) nach Inokulation mit BYDV-PAV in zweijährigen Feldversuchen an vier Standorten charakterisiert. In beiden Populationen führte die Kombination von Ryd2 und Ryd3 zu einer signifikanten Verringerung des Virusgehaltes (Virusextinktion, DAS-ELISA) und einer deutlich verringerten Infektionsrate gegenüber den genotypisch anfälligen Linien (ryd2/ryd3) und solchen mit den entsprechenden einzelnen positiven Allelen und damit zu einer quantitativen Resistenz gegenüber BYDV. Darüber hinaus konnte in DH-Linien der Sommergerstenkreuzung für die Kombination aus Ryd2 und Ryd3 eine höhere Leistung bei den Ertragsparametern wie dem relativen Kornertrag pro Pflanze, gegenüber den anderen Genotypen nachgewiesen werden. Der QTL auf Chromosom 2H hatte allgemein nur eine geringe Toleranzwirkung. Zur Aufklärung der WDV-Toleranz der Sorte 'Post' wurden zwei DH-Populationen der Kreuzung 'Post' (tolerant) x 'Vixen' (anfällig) zur Phänotypisierung im Feldversuch mit Hilfe von virustragenden Zikaden (Psammotettix alienus) inokuliert und ihre Toleranz durch Wuchs- und Ertragsmerkmale ermittelt. In QTL-Analysen mit den entsprechenden genetischen Kopplungskarten wurden QTL auf den Chromosomen 1H, 2H, 3H und 4H detektiert. Der QTL auf Chromosom 4H ist dabei in beiden Populationen übereinstimmend für die Symptomausprägung und die relative Halmlänge im Bereich des SSR-Markers HVM3 zu finden und erklärt bis zu 32 % der phänotypischen Varianz für diese Merkmale.Barley yellow dwarf virus (BYDV) and Wheat dwarf virus (WDV) are economically important pathogens of barley which may become even more important due to global warming. In barley several loci conferring tolerance to BYDV are known, e. g. Ryd2, Ryd3 and a QTL (quantitative trait locus) on chromosome 2H. One aim of the present study was to get information whether the level of tolerance against BYDV in barley can be improved by combining these loci. Another objective was to analyse the tolerance of the cultivar 'Post' to WDV. For combining the above mentioned tolerance loci against BYDV a winter and a spring barley population of doubled haploid (DH) lines was genotyped by molecular markers for the presence of the susceptibility or the resistance encoding allele at respective loci (Ryd2, Ryd3, QTL on chromosome 2H) and were tested for their level of BYDV-tolerance after inoculation with viruliferous (BYDV-PAV) aphids in two-years field trials at four locations. In DH-lines carrying the combination Ryd2 and Ryd3 a significant reduction of the virus titre and a much lower infection rate were detected compared to lines carrying only one or none of these genes. Furthermore, spring barley DH-lines with this allele combination also showed a significantly higher relative grain yield compared to lines carrying only Ryd2 or Ryd3. Overall these results show that the combination of Ryd2 and Ryd3 leads to quantitative resistance against BYDV-PAV. For analysis of the tolerance to WDV detected in the cultivar 'Post' two DH-line populations of the cross 'Post' (tolerant) x 'Vixen'  (susceptible) were phenotyped in field trails after inoculation with WDV carrying leafhoppers (Psammotettix alienus). QTL were detected on chromosome 1H, 2H, 3H and 4H. The most important one is the QTL for symptom score and relative plant height on chromosome 4H, which was detected at the position of the SSR-marker HVM3 in both populations and explained up to 32 % of the phenotypic variance

Pyramidisierung von QTL im Hinblick auf eine Verbesserung der Barley yellow dwarf virus Toleranz der Gerste und genetische Analyse der Toleranz gegenüber Wheat dwarf virus

Durch die markergestützte Kombination der in der Gerste gegenüber der Gerstengelbverzwergung (Barley yellow dwarf virus) bekannten Toleranzallele Ryd2, Ryd3 und dem QTL auf Chromosom 2HL der Sorte `Post´ konnte eine quantitative Resistenz erreicht werden, welche sich in einer signifikanten Verringerung des Virusgehaltes und der Infektionsrate bei den untersuchten doppelhaploiden Linien zeigte. Andererseits wurden QTL für die in der Sorte `Post´ nachgewiesene Toleranz gegenüber der Weizenverzwergung (Wheat dwarf virus) mittels QTL-Analysen auf den Chromosomen 1H, 2H, 3H und 4H detektiert

Gezielte Mutagenese mit Cas-Endonukleasen zur Etablierung von Bymovirus-Resistenzen in Gerste

Seit der neolithischen Revolution haben Domestikation und Pflanzenzüchtung die vom Menschen angebauten Pflanzen grundlegend verändert - aus Wildpflanzen wurden Kulturpflanzen. Insbesondere ab dem 19. Jahrhundert intensivierten die ersten Pflanzenzüchterinnen und -züchter ihre Arbeit zur Verbesserung von Kulturpflanzen. Mit der aufkommenden wissenschaftlichen Disziplin der Genetik wuchs das Verständnis dafür, wie Eigenschaften vererbt und verändert werden. Die moderne Genomik mit der Sequenzierung von Pangenomen und leistungsfähiger Bioinformatik trägt wesentlich dazu bei, die genetischen Grundlagen dieser Eigenschaften und die Bedeutung genetischer Veränderungen immer besser zu verstehen. Mit der Genomeditierung steht heute ein Methodenset zur Verfügung, um Gene von Kulturpflanzen gezielt zu verändern, sowohl für die wissenschaftliche Untersuchung von Genfunktionen als auch für die züchterische Verbesserung von Pflanzen. Insbesondere die vom mikrobiellen Immunsystem CRISPR-Cas abgeleiteten Cas-Endonukleasen haben sich dabei als nützliches und praktikables Werkzeug erwiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde die CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9 zur gezielten Mutagenese zweier bekannter Anfälligkeitsgene der Gerste gegen die Gelbmosaikvirose eingesetzt. Die Gelbmosaikvirose ist eine der bedeutendsten Krankheiten der Gerste (Hordeum vulgare L.) in Europa und Asien. Sie wird von den beiden Bymoviren Gerstengelbmosaikvirus (Barley Yellow Mosaic Virus, BaYMV) und Mildes Gerstenmosaikvirus (Barley Mild Mosaic Virus, BaMMV) verursacht. Mit Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E (EIF4E) und Protein Disulfide Isomerase-Like 5-1 (PDIL5-1) sind zwei Anfälligkeitsgene der Gerste bekannt, für die resistenzvermittelnde Allele beschrieben wurden. Derzeit sind fast alle Wintergerstensorten in Europa resistent gegen BaYMV und BaMMV, jedoch basieren diese Resistenzen fast ausschließlich auf den EIF4E-Allelen rym4 und rym5. Doch diese Resistenzen wurden bereits von angepassten Virusstämmen gebrochen, sodass ein Bedarf an neuen Resistenzvarianten und -mechanismen besteht. Ziel dieser Arbeit war es daher, neue resistenzvermittelnde Allele von EIF4E zu generieren sowie die in Gerstenlandrassen beschriebenen, resistenzvermittelnden Allele von PDIL5-1 in anfälligen Genotypen zur reproduzieren. Dafür wurden beide Gene mittels Cas9 gezielt mutiert, wobei erfolgreich verschiedene Knockout- und Basenmutationen in PDIL5-1 sowie Knockout-Mutationen in EIF4E induziert werden konnten. Die Nachkommenschaften der Primärmutanten wurden manuell mit BaMMV infiziert und sowohl die Knockout-Mutationen in EIF4E und PDIL5-1 als auch die Basensubstitutionen in PDIL5-1 führten zur Resistenz gegen das Virus. Im Gegensatz zu PDIL5-1 ging der Knockout von EIF4E jedoch mit einer Reduktion des Kornertrags einher. Aus diesem Grund wurde für dieses Kandidatengen zusätzlich die Baseneditierung in Wintergerste etabliert. Mihilfe von Cas9-Derivaten, die gezielt C-zu-T- und A-zu-G-Basen-substitutionen induzieren, wurden so insgesamt zehn neue Allele von EIF4E erzeugt, die in nachfolgenden Arbeiten auf ihre resistenzvermittelnden Eigenschaften überprüft werden können. Die vorliegende Arbeit liefert konkrete Beispiele dafür, wie mithilfe der Genomeditierung Pflanzenforschung und -züchtung, insbesondere im Hinblick auf Krankheitsresistenzen, verbessert werden können. Mit den Methoden der gezielten Mutagenese ist es möglich, Genvarianten für vorteilhafte Eigenschaften, die in der Kulturpflanzenvielfalt (z.B. in Genbanken) mithilfe der Hochdurchsatzsequenzierung und modernen Methoden der Genetik immer schneller gefunden werden, für die Pflanzenzüchtung nutzbar zu machen. Damit kann ein wesentlicher Beitrag für eine nachhaltigere Landwirtschaft geleistet werden.Since the Neolithic Revolution, domestication and plant breeding have extensively changed the shape of the plants cultivated by humans - wild plants became crop plants. Especially from the 19th century onwards, the first plant breeders intensified their work on crop plant improvement and with genetics as an emerging scientific discipline, they increasingly understood how traits are inherited and modified. Modern genomics, with sequencing of pangenomes and powerful bioinformatics, is playing a major role in helping understand the genetic basis of these traits and the significance of genetic changes. With gene editing, a whole suite of methods is now available to specifically modify genes of crop plants. In particular, CRISPR-associated (Cas) endonucleases derived from the microbial CRISPR-Cas immune system have been proven to be a useful and practical tool. In the present work, the Cas9 endonuclease was used for targeted mutagenesis of two previously known susceptibility genes of barley against the barley yellow mosaic disease. Caused by the Barley yellow mosaic virus (BaYMV) and the Barley mild mosaic virus (BaMMV), the barley yellow mosaic disease is one of the most important viral diseases of barley (Hordeum vulgare L.) in Europe and Asia. With the Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E (EIF4E) and the Protein Disulfide Isomerase-Like 5-1 (PDIL5-1), two susceptibility genes of barley are known for which resistance-conferring alleles have already been described. Currently, almost all winter barley varieties in Europe are resistant to BaYMV and BaMMV, but this resistance is based almost exclusively on the EIF4E alleles rym4 and rym5. However, this resistance has already been overcome by some adapted virus strains, which is why there is an urgent need for new resistance variants and mechanisms. Therefore, the aim of this work was to generate new resistance-mediating alleles of EIF4E and to reproduce in susceptible genotypes the resistance-mediating alleles of PDIL5-1 that have been described in barley landraces. For this purpose, both genes were specifically mutated using Cas9, successfully inducing different knockout and base mutations in PDIL5-1 as well as knockout mutations in EIF4E. The progeny of the primary mutants was mechanically infected with BaMMV and both the Knockout mutations in EIF4E and PDIL5-1 and the base substitutions in PDIL5-1 resulted in resistance to the virus. However, unlike PDIL5-1, knockout of EIF4E was accompanied by a reduction in grain yield. For this reason, base editing was established in winter barley for this candidate gene. Using Cas9 derivatives that specifically induce C-to-T and A-to-G base substitutions, a total of ten new alleles of EIF4E were generated which can be tested for their resistance-mediating properties in subsequent work. The present work provides concrete examples of how gene editing can be used to improve plant research and plant breeding, especially with regard to disease resistance. With the methods of targeted mutagenesis, it is possible to deploy beneficial gene variants which are being found ever faster by taking advantage of the crop diversity (e.g. in gene banks) and with the help of high-throughput sequencing and modern methods of genetics. This is expected to make a significant contribution to more sustainable agriculture