Die Rolle von Chemerin in Leberzellen und dem hepatozellulären Karzinom

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eine der häufigsten Krebserkrankungen weltweit. Die Prognose ist meist schlecht, da es in vielen Fällen erst sehr spät diagnostiziert wird. In den meisten Fällen entwickelt sich ein HCC auf dem Boden einer Leberzirrhose, bedingt durch eine Hepatitis-B- oder Hepatitis-C-Infektion, übermäßigen Alkoholkonsum oder eine nicht-alkoholische Fettlebererkrankung. Chemerin ist ein multifunktionales Adipokin, das vorranging im Fettgewebe und in der Leber gebildet wird. Nach C-terminaler Prozessierung durch extrazelluläre Proteasen entstehen unterschiedliche Chemerin-Isoformen, die aufgrund ihrer Aktivität klassifiziert wurden. Bei Krebserkrankungen zeigte Chemerin sowohl Tumor-inhibierende als auch tumorfördernde Eigenschaften. Für das HCC wurde eine protektive Wirkung des hochaktiven murinen Chemerin-156 nachgewiesen. Daher war es von Interesse herauszufinden, ob und inwiefern verschiedene Isoformen von Chemerin in der Leber und im hepatozellulären Karzinom wirken. Es wurden zwei inaktive (Chemerin-163 und -155) und zwei aktive humane Chemerin-Isoformen (Chemerin-157 und -156) und ihre jeweiligen murinen Homologe untersucht. Nach Expression dieser rekombinanten Proteine durch die Hepatom-Zelllinien HepG2, Huh7 und Hepa1-6 wurden die Zytotoxizität, die Proliferation und Zellviabilität, die Migration und der Lipidmetabolismus analysiert. Chemerin wirkte nicht zytotoxisch und beeinflusste die Proliferation von Hepatom-Zellen nur in geringem Maß. Die Migration von HepG2-Zellen und Hepa1-6-Zellen wurde durch das aktive Chemerin-157 bzw. das murine Homolog Chemerin-156 supprimiert. Das Verhältnis von Cholesterinestern zu freiem Cholesterin wurde durch Chemerin-156 vermindert. Die Sekretion des HCC-Tumormarkers α-Fetoprotein (AFP) wurde durch Chemerin nicht beeinflusst. Des Weiteren wurde das Zytokinprofil der Chemerin-exprimierenden Leberzellen untersucht und dabei festgestellt, dass in den humanen Zelllinien insbesondere die kürzeren Chemerin-Isoformen anti-inflammatorisch wirkten und die Sekretion der Zytokine IL-8, Osteopontin und CCL20 supprimiert wurde. In Hepa1-6-Zellen hatten die aktiven Chemerin-Isoformen eher proinflammatorische Effekte. Da Chemerin als Chemokin fungiert und Makrophagen, natürliche Killerzellen und Neutrophile chemotaktisch anlockt, wurden die sezernierten Zytokine nach Stimulation von humanen PBMC und murinen Makrophagen mit Zellkulturüberständen von Chemerin-exprimierenden Hepatom-Zelllinien untersucht. In den humanen Immunzellen zeigte vor allem Chemerin-155 anti-inflammatorische Effekte. Die Sekretion der inflammatorischen Zytokine IL-6, IL-8 und TNF wurde in murinen Makrophagen durch alle Chemerin-Isoformen, aber insbesondere durch Chemerin-154 supprimiert. Daraus wurde geschlossen, dass die als inaktiv geltende Isoform Chemerin-155/154 anti-inflammatorisch auf Immunzellen wirkt. Chemerin ist im Serum von Patienten mit kolorektalem Karzinom (CRC) hochreguliert und in Patienten mit HCC vermindert. Aus diesem Grund sollte untersucht werden, ob sich Chemerin als Marker zur Differentialdiagnose kolorektaler Lebermetastasen und primärer Lebertumore eignet. Das Serum-Chemerin wurde in 36 CRC-Patienten, 32 HCC-Patienten und 49 Patienten ohne Tumorerkrankungen gemessen. Die Chemerin-Konzentrationen waren in allen drei Gruppen vergleichbar. In der Krebspatienten-Kohorte wiesen Patienten mit Hypertonie, Hypercholesterinämie oder Hyperurikämie erhöhtes Serum-Chemerin auf. Chemerin korrelierte nicht mit den Tumormarkern carcinoembryonic antigen, carbohydrate antigen 19-9 oder AFP. Es war auch nicht mit den Stadien der Lebersteatose, -fibrose, der Ent-zündung oder der Tumor-Node-Metastasis-Klassifikation assoziiert. Daraus wurde geschlossen, dass sich Serum-Chemerin nicht als diagnostischer Marker zur Unterscheidung von primären Lebertumoren und CRC-Lebermetastasen eignet

Die Bedeutung patientenindividueller Antigene bei der T-Zell-Antwort gegen kolorektale Tumore

T cell responses in cancer patients correlate with improved prognosis. This effect can partially be attributed to cytotoxic T cells that recognize tumor antigens on cancer cells. Hence, the induction or improvement of such therapeutic tumor antigen-specific T cell responses is a major goal of tumor immunotherapy. So far the target-antigens of relevant prognostic T cell responses are unknown. In this thesis a systematic analysis was performed to identify those antigens that are able to elicit spontaneous T cell responses in patients with colorectal carcinoma. Those responses against the newly identified antigens were then compared, in a larger patient cohort, to T cell responses against established “canonical” tumor antigens that are commonly used for immunotherapy. The establishment of the proteome-based technology PF2D (Protein fractionation in two dimensions) in our group allowed the identification of protein fractions out of lysates from primary and metastatic tumor tissue that were capable to elicit strong T cell responses in ELISpot assays. With mass spectrometry and further ELISpot tests we could identify 21 so far unknown tumor-associated antigens. We could show that the T cell response was directed against different antigens in primary tumors or liver metastasis. Some of the identified antigens were selectively overexpressed on tumor stem cells. Additionally in the blood of these patients there was a higher frequency of T cells specific for the newly identified TAA in comparison with canonical TAA, that have been described in the past. In part two of this thesis we could show that patients suffering from colorectal cancer are able to induce spontaneous T cell responses against mutated forms of tumor-associated antigens. These patients harbor higher frequencies of T cells in the blood that are specific for the mutated forms compared to the corresponding wildtyp antigens and they show an increased immune response. This work shows that classical tumor-associated antigens play a minor role in the immune response against tumors. Patient-individual antigens, a result of the unique tumor development in every patient, are highly immunogenic and serve as better targets for immune monitoring and directed T cell therapies

Charakterisierung des Immunzellinfiltrates beim Kolonkarzinom

Das kolorektale Karzinom ist der zweithäufigste bösartige Tumor in Deutschland und die zweithäufigste Todesursache maligner Erkrankungen. Die Kenntnis des immunzellulären Infiltrates sowie immunsuppressiver Moleküle und damit verbundener neuer Prognosemarker spielen für die Entwicklung immuntherapeutischer Ansätze sowie als zusätzliche Entscheidungshilfen für eine stadiengerechte Behandlung eine wesentliche Rolle. Ziel dieser Promotionsarbeit war die Charakterisierung des Immunzellinfiltrates hinsichtlich der Suppression immunkompetenter Zellen und die biologische Auswirkung dieser Suppression in Abhängigkeit von klinisch-pathologischen Parametern beim kolorektalen Karzinom mit und ohne Lymphknotenmetastasen und in Lebermetastasen von Patienten mit primärem kolorektalem Karzinom. In der vorliegenden Arbeit wurden 47 Resektionspräparate von Patienten mit kolorektalem Karzinom (N0 und N2 Tumoren, 24 Frauen, 23 Männer, Alter 48 bis 86 Jahre, Durchschnittsalter 66,2 Jahre) sowie 21 Resektionspräparate von Patienten mit Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms (8 Frauen, 13 Männer, Alter 45 bis 79 Jahre, Durchschnittsalter 64 Jahre) histologisch untersucht. Dazu wurden die T-Zellen auf die Marker CD4, CD8, CD3-ε und CD3-ξ untersucht, weiterhin wurden B-Lymphozyten, natürliche Killerzellen, neutrophile Granulozyten, dendritische Zellen und Makrophagen mit immunhistochemischen Methoden markiert. Zusätzlich wurde die Expression der löslichen Form des Fas-Liganden und der MHC-I-Moleküle im Hinblick auf mögliche Tumorescapemechanismen untersucht. Einen weiteren Aspekt dieser Promotionsarbeit stellte der Vergleich unserer Ergebnisse mit denjenigen des Pankreaskarzinoms dar, die von einer weiteren Arbeitsgruppe in unserem Labor parallel gewonnen wurden. Die Ergebnisse unserer Arbeit bestätigen, daß das Immunsystem der Patienten bezüglich der Abwehr des Tumors eingeschränkt ist: das immunzelluläre Infiltrat der N0-Tumoren unterschied sich nicht signifikant von N2-Tumoren; am häufigsten fanden sich CD4+ und CD8+ Lymphozyten, gefolgt von neutrophilen Granulozyten und deutlich weniger NK-Zellen. Makrophagen und BLymphozyten waren selten, dendritische Zellen nur ausnahmsweise vorhanden. Insgesamt waren die Immunzellen bevorzugt im Tumorstroma und weniger in den Tumorzellbereichen lokalisiert. Dendritische Zellen konnten vereinzelt im Tumorstroma und kaum in unmittelbarer Nähe von Tumorzellen nachgewiesen werden. Eine Infiltration von Makrophagen in die Tumorzellbereiche fehlte fast vollständig, war im umgebenden Tumorstroma aber sehr viel stärker ausgeprägt. Dieses „Gefangen-sein“ der Immunzellen im Tumorstroma wird als „Trapping“ bezeichnet. Auch Lymphozyten, NK-Zellen und neutrophile Granulozyten zeigten das Phänomen des „Immunzelltrappings“. Ähnliche Ergebnisse lieferten die Untersuchungen am Pankreaskarzinom. Die schlechtere Abwehrlage von Kolonkarzinompatienten mit Fernmetastasen spiegelte sich im immunzellulären Infiltrat wieder: In den Lebermetastasen zeigte sich ein signifikant niedrigeres Infiltrat an T-Zellen, NK-Zellen, neutrophilen Granulozyten und Makrophagen im Vergleich zu den fernmetastasenfreien Kolonkarzinomen. Allerdings fanden sich B-Lymphozyten als Zellen der Th2-Antwort ebenso signifikant häufiger wie HLA-unabhängige NK-Zellen, die knapp ein Drittel der Zellpopulation stellten. Professionelle Zellen der Antigenpräsentation fehlten fast vollständig. Die Anzahl an Makrophagen in den fernmetastasenfreien Kolonkarzinomen war im Vergleich zu den Lebermetastasen besonders hoch. In den duktalen Pankreaskarzinomen stieg dagegen der relative Anteil der Makrophagen am Gesamtinfiltrat mit zunehmendem Tumorstadium an. Interessante Ergebnisse lieferte der Vergleich des Neutrophileninfiltrates zwischen den Geschlechtern: Es fällt ein statistisch signifikantes fünffach höheres Neutrophilen-Infiltrat im Tumorstroma der Lebermetastasen weiblicher Patienten auf, verglichen mit dem männlicher Patienten. Ein sexueller Dimorphismus ist bei verschiedenen Krankheitsbildern bereits bekannt, für Tumorerkrankungen ist dieses Gebiet jedoch noch sehr unzureichend untersucht, könnte jedoch interessante Aufschlüsse hinsichtlich der Tumorimmunität liefern. Es ist bekannt, dass durch so genannte Tumorescapemechanismen der Tumor in der Lage ist, sich einer erfolgreichen Immunantwort zu entziehen. Interessant war in diesem Zusammenhang ein genereller signifikanter Verlust aktivierter T-Lymphozyten (gemessen an der Expression der ξ-Kette des T-Zellrezeptors) in den Kolonkarzinomen. Ebenso war ein signifikant geringeres Infiltrat aktivierter T-Lymphozyten in den Lebermetastasen und den Kolonkarzinomen mit Lymphknotenmetastasen, verglichen mit den metastasenfreien Tumoren, festzustellen. Einen signifikanten Überlebensvorteil zeigten Patienten mit einem hohen Anteil aktivierter T-Lymphozyten, Patienten mit niedrigem Infiltrat zeigten eine signifikant kürzere Überlebenszeit. Damit konnte der Verlust der CD3ξ-Kette als neuer negativer Prognosemarker für das Kolonkarzinom herausgearbeitet werden. Bei den Patienten mit Papillenkarzinomen war der Anteil funktionell aktiver zytotoxischer TLymphozyten doppelt so hoch wie der in den prognostisch schlechteren duktalen Pankreaskarzinomen. Diese Ergebnisse bieten Erfolg versprechende Ansatzpunkte für immuntherapeutische Konzepte, die vor allem auf eine Wiederherstellung der T-Zellfunktion gerichtet sein müssen. Von der Mehrheit der Kolonkarzinome wurde die selten untersuchte Form des löslichen Fas-Liganden exprimiert. Die Expression in den Tumorzellbereichen der Lebermetastasen war signifikant stärker als in metastasenfreien Kolonkarzinomen. Dies könnte eine vermehrte Induktion von Fas-induzierter Apoptose immunkompetenter Zellen in den Lebermetastasen und damit eine vermehrte lokale Immunsuppression bedeuten. In einigen Präparaten konnte der Eindruck einer Sezernierung des sFas-Liganden durch die Tumorzellen gewonnen werden, was einen weiteren immunsuppressiven Mechanismus des Tumors darstellen könnte. Die Untersuchungen der duktalen Pankreaskarzinome zeigten ebenfalls eine Expression des Fas-Liganden auf dem überwiegenden Anteil der Tumorzellen. Jedoch exprimierten nur 10-50% der Tumorzellen in Papillenkarzinomen sFas-Ligand. Dies könnte eine Erklärung für die bessere Prognose von Papillenkarzinomen gegenüber duktalen Pankreaskarzinomen sein. In der Literatur wird die Herabregulierung der MHC-I-Moleküle als ein weiterer Tumorescapemechanismus beschrieben. In den von uns untersuchten Präparaten war dieser Mechanismus gering ausgeprägt, in wenigen Fällen war ein Verlust der MHC-I-Moleküle zu erkennen. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen kolorektalen Karzinomen ohne Fernmetastasen und den untersuchten Lebermetastasen, ebenso korrelierte die MHC-IExpression nicht mit der Überlebenszeit der Patienten. Vermutlich spielt dieser Escapemechanismus für das kolorektale Karzinom nur eine geringe Rolle. Generell zeigen die Ergebnisse unserer Arbeit, sowie die Ergebnisse der untersuchten Pankreaskarzinome die enge Verknüpfung zwischen Immunitätslage des Patienten und der Tumorausprägung sowie dem Überleben: Die lokale Immunsuppression durch maligne Zellen ist signifikant mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Dies bietet Erfolg versprechende Ansatzpunkte für immuntherapeutische Konzepte, die vor allem auf eine Wiederherstellung der T-Zellfunktion und Aktivierung der Antigenpräsentation gerichtet sein müssen

UGT1A Regulation der Leber und des Verdauungstraktes im humanisierten transgenen Mausmodell

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Die Rolle der DNA-Bindungskooperativität für die p53-vermittelte Tumorsuppression im Lungentumor-Xenograft-Modell

p53 wird wegen seiner herausragenden Rolle als Tumorsuppressor auch als Wächter des Genoms bezeichnet: als Transkriptionsfaktor reguliert es die Expression zahlreicher Gene und nimmt hierdurch Einfluss auf die Zellproliferation. Bei zellulärem Stress, wie zum Beispiel bei DNA-Schädigung oder Aktivierung von Onkogenen, steigt der Spiegel von p53 in der Zelle rasch an. Mögliche Konsequenzen sind ein transienter Zellzyklusarrest, der eine DNAReparatur ermöglicht, die Seneszenz, ein irreversibler Zellzyklusarrest, oder die Apoptose, der programmierte Zelltod. Durch diese Maÿnahmen wird die Proliferation der Zelle vorerst gestoppt und der Organismus vor Generierung und Vermehrung von Krebszellen geschützt. Wie genau die Entscheidung zwischen transientem Zellzyklusarrest, Seneszenz und Apoptose getroffen wird, ist bis heute nicht abschließend geklärt. p53 bindet als Tetramer kooperativ an die DNA, was bedeutet, dass die Bindung des kompletten p53-Tetramers an die DNA stärker ist als die Summe der Bindungen der vier einzelnen p53-Monomere. Die Stabilität der Bindung zwischen den einzelnen p53-Molekülen beeinflusst die Auswahl der Target-Gene entscheidend und korreliert mit dem Ausmaÿ der induzierten Apoptose. Um den Einfluss der DNA-Bindungskooperativität von p53 auf die Tumorsuppression zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit unterschiedlich stark kooperative p53-Mutanten stabil in eine p53-negative Lungenkarzinomzelllinie transfiziert. Im Lungentumor-Xenograft-Modell konnte gezeigt werden, dass sich bei höherer DNA-Bindungskooperativität von p53 signifikant weniger Tumore entwickeln. Eine zusätzliche Chemotherapie mit Doxorubicin vermochte die Tumormasse nochmals zu reduzieren. Diese Ergebnisse belegen eindrucksvoll die Abhängigkeit der Tumorsuppression sowie der Chemosensibilität von der DNA-Bindungskooperativität von p53. Interessanterweise war keine konstitutive Aktivität von p53 notwendig, sondern eine konditionelle Aktivierung ausschlieÿlich in der letzten Behandlungswoche führte zu einem gleichwertigen tumorsuppressiven Effekt. Dieses Wissen um die Effekte der DNA-Bindungskooperativität ist therapeutisch hoch interessant, da Substanzen, die die Kooperativität erhöhen und somit die Apoptoserate steigern, zur Behandlung von Tumorerkrankungen eingesetzt werden könnten. Alternativ könnte eine transiente Absenkung der Kooperativit ät der gesunden Körperzellen bei Chemotherapie die Nebenwirkungsrate senken