“Notame”: Workflow for non-targeted LC-MS metabolic profiling

Metabolomics analysis generates vast arrays of data, necessitating comprehensive workflows involving expertise in analytics, biochemistry and bioinformatics in order to provide coherent and high-quality data that enable discovery of robust and biologically significant metabolic findings. In this protocol article, we introduce notame, an analytical workflow for non-targeted metabolic profiling approaches, utilizing liquid chromatography-mass spectrometry analysis. We provide an overview of lab protocols and statistical methods that we commonly practice for the analysis of nutritional metabolomics data. The paper is divided into three main sections: the first and second sections introducing the background and the study designs available for metabolomics research and the third section describing in detail the steps of the main methods and protocols used to produce, preprocess and statistically analyze metabolomics data and, finally, to identify and interpret the compounds that have emerged as interesting. © 2020 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland

“Notame”: Workflow for non-targeted LC-MS metabolic profiling

Metabolomics analysis generates vast arrays of data, necessitating comprehensive workflows involving expertise in analytics, biochemistry and bioinformatics in order to provide coherent and high-quality data that enable discovery of robust and biologically significant metabolic findings. In this protocol article, we introduce notame, an analytical workflow for non-targeted metabolic profiling approaches, utilizing liquid chromatography-mass spectrometry analysis. We provide an overview of lab protocols and statistical methods that we commonly practice for the analysis of nutritional metabolomics data. The paper is divided into three main sections: the first and second sections introducing the background and the study designs available for metabolomics research and the third section describing in detail the steps of the main methods and protocols used to produce, preprocess and statistically analyze metabolomics data and, finally, to identify and interpret the compounds that have emerged as interesting

Multiomic interpretation of fungus-infected ant metabolomes during manipulated summit disease

Camponotus floridanus ants show altered behaviors followed by a fatal summiting phenotype when infected with manipulating Ophiocordyceps camponoti-floridani fungi. Host summiting as a strategy to increase transmission is also observed with parasite taxa beyond fungi, including aquatic and terrestrial helminths and baculoviruses. The drastic phenotypic changes can sometimes reflect significant molecular changes in gene expression and metabolite concentrations measured in manipulated hosts. Nevertheless, the underlying mechanisms still need to be fully characterized. To investigate the small molecules producing summiting behavior, we infected C. floridanus ants with O. camponoti-floridani and sampled their heads for LC-MS/MS when we observed the characteristic summiting phenotype. We link this metabolomic data with our previous genomic and transcriptomic data to propose mechanisms that underlie manipulated summiting behavior in "zombie ants." This "multiomic" evidence points toward the dysregulation of neurotransmitter levels and neuronal signaling. We propose that these processes are altered during infection and manipulation based on (1) differential expression of neurotransmitter synthesis and receptor genes, (2) altered abundance of metabolites and neurotransmitters (or their precursors) with known behavioral effects in ants and other insects, and (3) possible suppression of a connected immunity pathway. We additionally report signals for metabolic activity during manipulation related to primary metabolism, detoxification, and anti-stress protectants. Taken together, these findings suggest that host manipulation is likely a multi-faceted phenomenon, with key processes changing at multiple levels of molecular organization

Evaluating and improving true and false positive annotations in non-targeted (nano)ESI-DIMS and U(H)PLC-MS based clinical and environmental metabolomics

Interest in the chemical exposome is increasing due to mounting evidence of the ubiquity of chemicals in the environment. Metabolomics informs on biological perturbations in response to stressors, including chemicals. Metabolomics and exposomics can therefore find utility in chemical risk assessment. However, since exposomics, the study of all non-genetic exposures an organism experiences from conception to death, is still emerging, the chemical coverage, detection reproducibility, and limitations of non-targeted analysis (NTA) methods applied are unknown. Moreover, all NTA methods face challenges in providing confident identification of analytes. The current strategy for confident identification is through fragmentation. However, good quality fragmentation requires sufficient ion intensities, yet it is known that ~70% of metabolites are too low intensity to give good quality fragmentation spectra, whilst chemicals found in biological samples are about ~1,000 times lower in concentration than endogenous metabolites. As such, they seldom yield good quality spectra for confident spectral matching. This means a large proportion of NTA rely on MS1 data annotation, yet there have been comparatively few investigations into how annotation parameters affect accuracy of annotations. To characterise NTA chemical coverage, reproducibility, and limitations, direct infusion mass spectrometry (DIMS) and liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) were applied for analysis of chemical mixtures (standards in solvent, fortified serum, house-dust, and wristband extracts) as part of a global ring trial called the US Environmental Protection Agency’s (EPA) Non-Targeted Analysis Collaborative Trial (ENTACT). Initially, sample compositions were unrevealed, and annotation was achieved by matching against a suspect screening reference list with 4,462 chemicals (ToxCast library) based on m/z only for both techniques. The second time around, sample compositions were revealed, and this knowledge was used to create small databases containing only chemicals revealed to be in each sample for the DIMS methods, and retention time (RT) databases containing only chemicals detected using the LC-MS methods, against which to match. True and false positive rates (TPR and FPR) were calculated to evaluate method performance. To fill the knowledge gap about how annotation parameters affect accuracy of MS1 annotations, a software called Birmingham mEtabolite Annotation for Mass Spectrometry (BEAMS) was used to annotate four LC-MS datasets (serum), varying all parameters used in the annotation steps to ascertain which parameters impacted annotation the most through calculation of TPR and FPR. For both techniques (DIMS and LC-MS, respectively), using the ToxCast library for annotation, lower sample complexity yielded higher TPRs of (48-74% and 0-94% for analysis of standard mixtures in a clean solvent matrix), which were reduced by increasing sample complexity. LCMS methods yielded higher TPRs than DIMS methods. However, both techniques resulted in high FPRs (254-879% and 650-2031%), which increased with increasing sample complexity. The use of smaller tailored databases during annotation for DIMS and RT databases for LC-MS reduced FPRs (0-24% and 23-130%). However, for LC-MS methods, the TPR of annotation also decreased (0-74%) since RT databases created were incomplete, containing only chemicals that had been detected repeatedly in three MS1 injections. For DIMS methods, annotation against smaller databases increased the TPR (53-84%). Optimisation of BEAMS parameters showed that using RT similarity and correlation analysis to group degenerate features, the maximum RT difference parameter had no big impact on the total annotations achieved. However, tighter correlation thresholds reduced the total number of annotations, including both TPRs and FPRs. Mass error tolerances also affected the number of annotations achieved, with tolerances between 0.5-3ppm reducing both true and false positive annotations, with the former highest between 3-10ppm. Finally, the reference lists used for annotation of degenerate features (adducts, isotopes, and neutral losses) TPRs and FPRs of annotation, with longer, more accurate lists created based on each dataset increasing true positive annotation for the positive ion mode datasets relative to shorter default lists. However, these results also demonstrated the pitfalls of using longer reference lists, as TPRs of annotation were reduced for some negative ion mode datasets. Chemicals in environmental and biological samples can be screened for using both DIMS and LC-MS, yielding high TPRs. However, these techniques do not offer 100% TPRs, therefore new methods are required to increase chemical coverage. The use of smaller tailored reference lists and RT databases for annotation can reduce occurrence of false positive annotations but exemplifies the challenges in creating such small databases. BEAMS optimisations show which parameters affect MS1 data annotation, reduce FPR and maximise TPR. Although these results are specific to datasets and instruments applied herein, they are relevant to anyone using such approaches to group degenerate features, they can be used to guide selection of appropriate annotation parameters. Continued efforts into maximising MS1 data annotation are required

Multiomic Hypotheses Underlying Behavioral Manipulation of Camponotus floridanus ants by Ophiocordyceps camponoti-floridani fungi

Parasitic manipulation of host behavior lies at the intersection of disease, animal behavior, and coevolutionary processes. In many of these interactions, the underpinning biology is brought into sharp focus as they are obligate relationships, under strong selection to bring about specific changes in host behavior that determine if the parasite will transmit or die. However, experimental and molecular techniques to understand these interactions are still developing and identification of the mechanisms of manipulation is a primary goal in the field. As such, we investigated host-parasite interactions between Camponotus floridanus (Florida carpenter ant) and Ophiocordyceps camponoti-floridani (Florida zombie ant fungus) from multiple molecular perspectives. By combining genome, gene expression, protein-interaction, and metabolite data from multiple experiments, we analyzed parasitic manipulation in a multiomic framework. We considered the most robust hypotheses of how parasitic manipulation occurs to be those supported by multiomic data. Two major avenues of parasitic influence on host behavior appear to be direct interference with neurotransmission and dysregulation of core cellular pathways that affect behaviors. For example, heightened expression of host dopamine synthesis enzyme genes, predicted binding of secreted parasite proteins to dopamine receptors, and reduced dopamine precursor abundance during displays of manipulated behavior all correlate the dysregulation of dopaminergic processes to manipulation phenotypes. We discuss numerous possible hypotheses, many with multiomic support, some without. We predict that modification of host behavior is a complex and multi-layered process that integrates multiple mechanisms we propose here

Entkopplung von Wachstum und Überproduktion von Chemikalien in Escherichia coli

Das Metabolic Engineering ermöglicht es, mikrobielle Stämme zu konstruieren, die Chemikalien effektiv überproduzieren. Allerdings nutzen die Produktionsstämme Substrate nicht nur für die Überproduktion von Chemikalien sondern auch um zu wachsen. Also besteht ein trade-off zwischen der Produktion und dem Wachstum, der zu sub-optimaler Produktionsleistung führen kann. Eine Lösung dafür ist die Entkopplung des Zellwachstums von der Überproduktion mittels Zwei-Phasen-Bioprozessen. Nach einer ersten Phase, in der Zellen wachsen ohne zu produzieren, wird das Wachstum in der zweiten Phase gestoppt und die Produktion gestartet. Bei der Kreierung eines Zwei-Phasen-Bioprozesses gibt es zwei zentrale Herausforderungen: (1) Der mikrobielle Stoffwechsel und das Zellwachstum müssen dynamisch kontrolliert werden, um einen Übergang zwischen den beiden Prozess-Phasen zu erzielen. (2) Die Stoffwechselaktivität und Produktionsraten sind in nicht-wachsenden Zellen typischerweise niedrig, was durch genetische Modifikationen korrigiert werden muss. Für beide Herausforderungen ist die genaue Kenntnis über die Metabolitkonzentrationen in den modifizierten Stämmen kritisch, um entscheiden zu können, welche genetischen Modifikationen zum Erfolg führen. Daher werden quantitative und Hochdurchsatz-Massenspektrometrie-Methoden entwickelt, die es ermöglichen Metabolitkonzentrationen in einer großen Anzahl an modifizierten Stämmen in kurzer Zeit zu untersuchen. Eine der schnellsten Methoden ist die flow-injection Massenspektrometrie. In dieser Arbeit untersuchen wir Aspekte der dynamischen Kontrolle des Stoffwechsels und Wachstums, der metabolischen Aktivität in nicht-wachsenden Zellen und der flow-injection Massenspektrometrie. Es ist wichtig all diese Aspekte zu untersuchen, um besser zu verstehen, wie das Zellwachstum und die Überproduktion von Chemikalien entkoppelt werden kann. Das Kapitel 1 dient als Einleitung in das Metabolic Engineering, die Massenspektrometrie-basierte Metabolomik, und Zwei-Phasen-Bioprozessen. Das Kapitel 2 ist ein kurze Abhandlung über metabolische Netzwerke. Die flow-injection Massenspektrometrie (FI-MS) ist eine Metabolomik-Methode, die hunderte Metabolite detektieren kann und Messzeiten im Sekundenbereich hat. Allerdings werden Metabolite vor einer Messung mit FI-MS nicht durch chromatographische Methoden aufgetrennt. Dadurch erreichen alle Metabolite das Massenspektrometer zur gleichen Zeit. Das kann zu negativen Effekten führen, wie zum Beispiel Metabolit-Modifikationen in der Ionenquelle und falschen Annotation. Mit dem Kapitel 3, stellen wir eine systematische Untersuchung von Metabolit-Modifikationen in der Ionenquelle während der Messungen mittels FI-MS vor. Dabei war die Nutzung von 160 authentischen Metabolitstandards, die wir einer Metabolitextrakt-Probe hinzugegeben haben, zentral für unsere Analyse. Mittels einer Netzwerk-Analyse und Informationen über Metabolit-Fragmentierung konnten wir zeigen, dass Metabolit-Modifikationen in der Ionenquelle abundant sind und sogar sequentielle Mehrfachmodifikationen vorkommen. Mit unserem Analyse-Ansatz konnten wir einen großen Anteil dieser Modifikationen erklären. Die hier vorgestellten Daten sind eine wertvolle Ressource und sind hilfreich, um falsche Annotationen zu vermeiden. Temperatur-sensitive Proteine haben Aminosäure-Substitutionen, die eine Aktivität bei niedrigen Temperaturen erlauben. Bei höheren Temperaturen, bei denen Wildtyp-Proteine noch aktiv sind, sind Temperatur-sensitive Proteine hingegen inaktiv. Als Teil dieser Arbeit haben wir untersucht, ob Temperatur-sensitive Proteine als Hilfsmittel für das Metabolic Engineering nützlich sind und eine dynamische Kontrolle des Zellwachstums und Stoffwechsels ermöglichen. Ein Ziel war es Temperatur-sensitive Proteine zu nutzen, um Zwei-Phasen-Bioprozesse zu kreieren. Dadurch, dass es schwierig sein kann Temperatur-sensitive Mutanten zu finden, lag ein Fokus unserer Arbeit auf der Entwicklung von Hochdurchsatzverfahren zur Erzeugung von Temperatur-sensitiven Mutanten. Mit dem Kapitel 4, stellen wir eine Hochdurchsatz-Methode zur Anreicherung von Temperatur-sensitiven Mutanten eines einzelnen essentiellen Genes in Escherichia coli vor. Die Methode verbindet einen Einzelzell-Wachstumsraten-Sensor, der auf einem TIMER-Protein basiert, mit Fluoreszens-aktivierter Zellsortierung. Dies hat es uns ermöglicht, Millionen von Zellen zu screenen und Temperatur-sensitive Mutanten der Argininosuccinat Synthetase ArgG anzureichern. Wir konnten zeigen, dass ArgG ähnlich wie ein Ventil für Stoffwechselwege funktionieren kann, und, dass es uns ermöglicht das Wachstum graduell mittels der Temperatur zu steuern. Gleichzeitig erlaubt es auch die Überproduktion von Citrullin, das das Substrat der ArgG-katalysierten Reaktion ist. Mittels Temperatur-sensitivem ArgG, haben wir einen Zwei-Phasen-Bioprozess kreiert, mit dem innerhalb von 45 Stunden 3 g/L Citrullin in 1 L-Bioreaktoren hergestellt werden konnte. Anschließend zu der Studie über Temperatur-Sensitivität als Hilfsmittel für das Metabolic Engineering, beschreiben wir in Kapitel 5 eine Methode, um Temperatur-sensitive Mutanten in vielen unterschiedlichen Genen zu erzeugen und zu identifizieren. Wir haben eine CRISPR/Cas9-basierte Methode zur Genomeditierung adaptiert und einen angepassten Designansatz genutzt, um eine gepoolte Sammlung von 15.120 E. coli Stämmen zu erzeugen. Jeder dieser Stämme hat eine Mutation, die eine einzelne Aminosäure-Substitution in einem von 346 essentiellen Proteinen hervorruft. In kompetitiven Fitness-Untersuchungen bei zwei unterschiedlichen Temperaturen haben wir die Abundanz einzelner Stämme mit Hilfe von deep sequencing der Plasmid-basierten barcodes verfolgt. Das hat es uns ermöglicht, 1.045 Temperatur-sensitive Kandidaten zu identifizieren. Nachdem wir 92 Stämme isoliert hatten, konnten wir die Funktion von 42 Temperatur-sensitiven Enzymen als metabolische Ventile mittels FI-MS bestätigen. Als letzten Schritt haben wir sieben Temperatur-sensitive Stämme für die Überproduktion von Chemikalien in Zwei-Phasen-Prozessen genutzt. Das enforced ATP wasting (erzwungene ATP-Verschwendung) ist ein vielversprechender Ansatz, um hohe metabolische Aktivitäten während des Wachstum-Stopps zu erzielen. Mit Kapitel 6 stellen wir eine Studie zu dem enforced ATP wasting in E. coli vor. Die Überexpression von ATPase führte unter anaeroben Bedingungen und Stickstofflimitierung zu stark erhöhten Glukose-Aufnahmeraten. Fermentationsprodukte akkumulierten bis die Glukose im Medium erschöpft war. Wir haben an der ersten Studie zum enforced ATP wasting angeknüpft und untersucht, wie der Energiestoffwechsel durch unterschiedliche Expressionsstärken der ATPase beeinflusst wird (Kapitel 7). Mit steigender ATPase-Expressionsstärke stieg auch die Glukose-Aufnahmerate bis zu einem kritischen Punkt. Eine weitere Erhöhung der Expressionsstärke über diesen kritischen Punkt hinweg führte zu einem rapiden Abfall in der Glukose-Aufnahmerate, sogar unter das Niveau eines Wildtyp-Stamms. Wir konnten zeigen, dass dieser Effekt auf ein Enzym in der oberen Glykolyse zurückzuführen ist: die Phosphofructokinase,welcheATP als Substrat hat und die durch ADP allosterisch aktiviert wird. Diese Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis des Energiestoffwechsels in E. coli bei. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse auch, dass enforced ATP wasting sehr effektiv ist, um die Glukose-Aufnahmeraten in nicht-wachsenden Zellen deutlich zu steigern. Das macht enforced ATP wasting zu einem sehr nützlichen Mittel für das Metabolic Engineering