Von Plattformen zu miRNA-Biomarkern : Methoden zur miRNA-Molekulardiagnostik

An obvious way to improve human healthcare is to develop new and more effective drugs. Another opportunity is however to develop solutions that allow to utilize the available drugs better. This includes more accurate and early diagnosis of pathologies, improved therapy selection as well as digital and patient centric solutions in healthcare systems. Especially in molecular diagnostics new biomarkers have been developed and partially shown promising results in terms of improving patient care. In this work I describe the development of respective platform techniques, biomarkers and computational solutions during my PhD thesis. First, I briefly introduce the concept of a flexible microarray platform and assays, such as the MPEA assay, tailored for the fast and efficient quantification of miRNA signatures. Then, I describe how we made use of respective platforms along with computational solutions to improve the understanding of physiological and pathophysiological processes. Further, I present results on my efforts to develop new molecular diagnostic biomarkers based on circulating miRNAs. Here, my special focus was in cancer (most importantly lung cancer) and diseases affecting the Central Nervous System (most importantly Multiple Sclerosis, Alzheimer’s Disease and Parkinson’s Disease). Together with the supervisors of my thesis I was among the first researchers worldwide to recognize that small non-coding RNAs (most importantly microRNAs) measured from body fluids have a great potential as biomarkers. An obvious advantage to messenger RNAs is the small length of the molecules of only 17-22 nucleotides. This makes microRNAs stable in vivo but also in vitro. Finally, I will mention recent developments in patient care. The current trend is clearly the digitalization of central parts of healthcare. This affects all stakeholders in the healthcare system, most importantly medical doctors and patients. Especially patient empowerment and self-containment of medical data is becoming more important. Again, Multiple Sclerosis is used as an example. But also for physicians, computational tools have to be implemented to support them in making treatment decisions from highly complex data. In sum, my thesis describes the road from developing a molecular diagnostic platform over the research on biomarkers for detecting disease in time towards holistic computational solutions to improve patient care.Es ist offensichtlich, dass man Krankheiten besser behandeln kann, wenn man neue und effektivere Medikamente und Therapien entwickelt. Eine andere Möglichkeit ist es, Lösungen zu entwickeln, die es erlauben, vorhandene Medikamente besser einzusetzen. Das schließt die frühzeitige Diagnose von Erkrankungen, eine verbesserte Wahl der richtigen Therapie und die Entwicklung von patienten-zentrischen digitalisierten Lösungen mit ein. Insbesondere in der Molekulardiagnostik wurden neue vielversprechende Biomarker entwickelt. In dieser Arbeit führe ich meine Beiträge zur Entwicklung von Plattform Technologien zum Messen von Biomarkern aus, erläutere die Erforschung von Biomarkern selbst und beschreibe die Anwendung der dazugehörigen, computergestützten Methoden. Beginnen möchte ich mit einer Beschreibung der Entwicklung einer flexiblen Mikroarray Plattform und Assays, wie zum Beispiel des MPEA Assays, die maßgeschneidert für die schnelle und effiziente Quantifizierung von miRNA Biomarkern sind. Dann gehe ich darauf ein, wie wir Plattformen, Assays und computergestützte Lösungen eingesetzt haben, um physiologische und pathologische Prozesse besser zu verstehen. Außerdem präsentiere ich Resultate meiner Bemühung, neue molekulardiagnostische Biomarker basierend auf zirkulierenden miRNA Mustern zu entwickeln. Hierbei habe ich mich auf Krebs (vornehmlich Lungentumore) und Erkrankungen, die das Zentrale Nervensystem betreffen (Multiple Sklerose und die Alzheimer Erkrankung), konzentriert. Gemeinsam mit meinen Betreuern war ich unter den ersten Forschern weltweit, die das große Potenzial kleiner nicht-kodierender RNAs (am wichtigsten dabei microRNAs), die aus Blut gemessen werden können, erkannt haben. Ein offensichtlicher Vorteil gegenüber mRNA Biomarkern ist die kurze Länge von nur 17-22 Nukleotiden. Diese macht miRNAs sowohl in-vivo als auch in-vitro stabil. Letztlich gehe ich in meiner Arbeit auf momentane Entwicklungen in der Patientenversorgung ein. Ein klarer Trend ist die Digitalisierung zentraler Teile der Gesundheitsversorgung. Das betrifft alle Personen im Gesundheitswesen, allen voran Mediziner und Patienten. Selbstbestimmung des Patienten wird besonders wichtig werden. Hier dient mir wieder Multiple Sklerose als ein Beispiel. Auch für Ärzte müssen, angesichts der immer komplexeren Daten, computergestützte Lösungen entwickelt werden, die ihnen helfen, die richtige Therapieentscheidung zu treffen. Zusammenfassend halte ich fest, dass meine Arbeit den Weg von der Entwicklung einer molekulardiagnostischen Plattform über die Entwicklung von Biomarkern zur Frühdiagnose von Erkrankungen bis hin zu ganzheitlichen computergestützten Lösungen, die die Patientenversorgung verbessern, beschreibt

Reverse engineering signalling networks in cancer cells

Obwohl die Krebstherapie im letzten Jahrhundert große Fortschritte gemacht hat, bleibt die Resistenz gegen medikamentöse Behandlungen ein großes Hindernis im Kampf gegen den Krebs. In dieser Arbeit habe ich ein R-Paket namens STASNet entwickelt, das semi-quantitative Modelle der Signaltransduktion aus Signalisierungs-Störungsantwortdaten unter Verwendung von Least Square Modular Response Analysis-Modellen generiert. Um zu untersuchen, wie gut STASNet die Aktivität von Signalwegen quantifizieren kann, haben wir Perturbationsdaten von einem Paar isogener Darmkrebszelllinien mit und ohne SHP2-Knock-out, einem bekannten Resistenzmechanismus bei dieser Krebsart, verwendet. Ich habe dann untersucht die Resistenz gegen die MEK- und ALK-Hemmung beim Neuroblastom, einem pädiatrischen Krebs mit schlechter Prognose. Ein Wirkstoffscreening zeigte, dass der MEK-Inhibitor Selumetinib ein Panel von Neuroblastom-Zelllinien in drei sensitive und sechs resistente Zelllinien trennte, dass konnte nicht mit einzelnen molekularen Markern erklärt. STASNet-Modelle zeigten, dass die starke Resistenz gegen Selumetinib durch eine starke Rückkopplung von ERK auf MEK oder eine vielschichtige Rückkopplung sowohl auf MEK als auch auf IGF1R getrieben wurde. Aus dem Modell konnte eine kombinatorische Therapie abgeleitet werden, die auf MEK in Kombination mit entweder RAF oder IGF1R abzielt, je nach Art der in der Zelllinie vorhandenen Rückkopplungen. Schließlich ergab die Untersuchung der Wirkung von NF1-KO auf die Signalübertragung, dass der Verlust von NF1 den MAPK-Weg für die Liganden-induzierte Aktivierung hypersensibilisierte, aber das ERK-RAF-Rückkopplung störte. Die Erkenntnisse aus den in dieser Arbeit entwickelten Modellen werden somit dazu beitragen, personalisierte Kombinationen von Inhibitoren zu entwerfen, die als Zweitlinientherapie nach molekularer Untersuchung der Tumorreaktion auf die Erstbehandlung eingesetzt werden könnten.Cancer therapy has seen immense progress over the last century but resistance to drug treatments remains a major obstacle in the war against cancer. I developed an R package named STASNet to generate models of signal transduction from signalling perturbation-response data using Least Square Modular Response Analysis models. I used these models to study how differences in signal transduction relate to drug resistance and can be used to make predictions about resistance mechanisms and optimal treatments. To show how STASNet can accurately quantify the activity of signalling pathways, I used perturbation data from a pair of isogenic colon cancer cell line with and without SHP2 knock-out, a known resistance mechanism in this cancer type, which showed that MAPK signalling is more affected by SHP2 knock-out than PI3K signalling, confirming the role of SHP2 as a primary MAPK component. I investigated resistance to MEK and ALK inhibition in neuroblastoma, a pediatric cancer with a dismal prognosis. The MEK inhibitor Selumetinib separated a panel of neuroblastoma cell lines into three sensitive and six resistant cell lines that could not be explained with individual molecular markers. STASNet models trained on perturbation-response data from these cell lines revealed that the strong resistance to Selumetinib was driven by a strong feedback from ERK to MEK or a multi-layered feedback to both MEK and IGF1R. This was confirmed by phosphoproteomics and suggested a therapy targeting MEK in combination with either RAF or IGF1R depending on the type of feedback present in the cell line that was confirmed experimentally. Finally, studying the effect of NF1-KO on signalling revealed that the loss of NF1 hyper-sensitized the MAPK pathway to ligand-induced activation but disrupted the ERK-RAF feedback. Those insights to design personalized combinations of inhibitors that could be used as second line therapy after molecularly monitoring the tumor response to the initial treatment