La maturation des cellules dendritiques induite par les PAMP modifie leur habileté à transférer le VIH-1 aux lymphocytes T CD4+ quiescents

Les récepteurs de l'immunité innée jouent un rôle important lors de la réponse immunitaire innée, car ils sont la première barrière de reconnaissance d'un pathogène. Les cellules dendritiques ont la capacité de lier des motifs microbiens, un phénomène qui entraîne une cascade de signalisation menant à leur activation et à leur migration jusqu'aux organes lymphoïdes secondaires. Elles activent alors les lymphocytes T CD4+ quiescents. Lors de l'infection par le VIH-1, une forte concentration de produits microbiens se retrouve dans le sang et les tissus périphériques, un phénomène dû à la translocation microbienne et à la présence de co-infections. L'objectif de ce projet de maîtrise a donc été d'étudier la susceptibilité des cellules dendritiques (DC) au VIH-1 suivant la stimulation de différents récepteurs et d'étudier leur capacité à transférer le virus aux lymphocytes T CD4+ quiescents. Les résultats indiquent qu'une stimulation du TLR2 par le Pam3CSK4 et le zymosan augmente le transfert tardif du VIH-1 de tropisme X4. Les résultats démontrent également qu'une stimulation du TLR3 diminue le transfert viral pour les deux tropismes de VIH-1. Le transfert précoce du virus R5 est également augmenté à la suite de l'activation du TLR2

La protéine accessoire Vpu du VIH-1 inhibe l'activité antivirale des pDCs à travers un processus ILT7-dépendant

Viral protein U (Vpu) is an accessory protein of HIV‐1 that efficiently targets BST2/Tetherin, a cellular restriction factor that acts as molecular anchor impeding the release of various enveloped viruses from the cell surface. The recently discovered natural receptor of BST2 is ILT7, a molecule exclusively expressed at the surface of the professional type 1 interferon (IFN‐1) producing cells, plasmacytoid dendritic cells (pDCs). The interaction between BST2 and ILT7 has been reported to efficiently induce a repression of IFN­‐1 secretion by pDCs. Here, we investigated the impact of Vpu mediated antagonism of BST2, in regards to this newly described immune function of BST2. Using a system of CD4+ T cell lines infected with wild type or Vpu‐deficient HIV-­1 cultured with peripheral blood mononuclear cells or purified pDCs, we report that the presence of Vpu efficiently reduces IFN-­1 production from sensing pDCs. Furthermore, we observed that this Vpu effect is dependent on the availability of BST2 molecules at the surface of the infected cells, since the Vpu's immunoregulation is abrogated when blocking any potential BST2 trans interaction with anti­‐BST2 antibodies. Similarly, depleting ILT7 from pDCs by means of small interfering RNA treatment equally negates the downregulation of pDC IFN-­1 secretion by Vpu. Finally, the use of recombinant soluble ILT7 competes with pDC‐bound ILT7 for the free BST2 and similarly results in high IFN-­1 production, causing an identical phenotype. Overall, our results demonstrate that Vpu heightens ILT7 activation and subsequent repression of IFN‐1 production by pDCs in response to HIV­‐1 infected CD4+ T cells by promoting it's trans interaction with infected T cell bound BST2, through a yet uncharacterized mechanism. By allowing efficient particle release and restraining pDCs antiviral functions, Vpu exerts a double role on BST2 that seems crucial for the replication and dissemination of HIV‐1.La protéine accessoire U (Vpu) du VIH‐1 cible efficacement BST2/Tetherin, facteur de restriction restreignant la relâche de divers virus enveloppés à même la surface cellulaire. Le récepteur naturel de BST2 récemment découvert est ILT7, une protéine exclusivement exprimée à la surface des cellules produisant l'essentiel de l'interféron de type 1 (IFN-­1) lors d'infections virales, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs). L'interaction entre BST2 et ILT7 réprime la production d'IFN‐1 des pDCs. Considérant le potentiel immunorégulateur de BST2 récemment décrit, nous avons entrepris d'évaluer cet aspect de l'antagonisme de Vpu sur BST2. À l'aide d'un système de co­‐culture entre une lignée de cellules T CD4+ infectée avec un virus exprimant ou n'exprimant pas Vpu et les cellules mononucléées du sang périphérique ou de pDCs purifiés, nous avons observé que Vpu est responsable d'une atténuation majeure de la sécrétion d'interféron de type 1 (IFN-­1) produite en réponse aux cellules infectées. La présence de molécules de BST2 de surface libres est essentielle à ce processus, puisque le bloc de toute interaction en trans de BST2 par des anticorps polyclonaux α­‐BST2 abroge l'effet de Vpu. Similairement, Vpu ne peut exercer cet effet lorsque ILT7 est déplété dans les pDCs à l'aide de petits ARN interférents. Enfin, l'introduction de protéines recombinantes solubles d'ILT7 dans le système de co-culture semble prévenir l'effet inhibiteur de Vpu, suggérant que Vpu exploite l'interaction de BST2 avec ILT7 pour moduler la sécrétion d'IFN-­1 des pDCs. En conclusion, nos résultats démontrent que Vpu exerce un contrôle sophistiqué de la production d'IFN‐1 par les pDCs en réponse aux lymphocytes T CD4+ infectés par le VIH-­1. Il semble ainsi que l'action de Vpu favorise, par un mécanisme encore méconnu, l'activation d'ILT7 à travers BST2. En effet, cette fonction de Vpu semble tout aussi dépendante de BST2 que de l'ILT7. En favorisant la relâche virale et en menant à l'inhibition de la réponse antivirale des pDCs, la régulation ciblée de BST2 par Vpu est non seulement cruciale à la dissémination du virus, mais aussi à sa réplication

Interactions entre le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) et les hépatocytes : impact possible sur la pathogénèse virale?

Les avancées diérapeutiques, résultant de trois décennies d'intenses recherches, ont considérablement changé la physionomie de l'infection au virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Chez les patients recevant une thérapie antirétrovirale hautement active, les maladies du foie sont devenues la principale cause de décès hors-SIDA. Par ailleurs, des évidences croissantes démontrent que la muqueuse intestinale est le foyer majeur de la replication virale et par conséquent un site clé dans la pathogénèse de la maladie. Cette muqueuse est directement reliée au foie qui, par sa localisation au carrefour de la circulation sanguine générale et entérique, constitue l'organe clé de la filtration du sang en provenance des intestins. Dans cette étude, nous nous sommes donc intéressés au rôle du foie et plus particulièrement des hépatocytes, la cellule parenchymateuse hépatique, dans la padiogénèse de l'infection au VIH-1. Nous avons ainsi tenté de caractériser les interactions entre le VIH-1 et les hépatocytes. Dans un premier temps, nous avons fait état de la faible susceptibilité à l'infection par le VIH-1 d'une lignée hépatocytaire. Nous avons aussi démontré que la restriction principale à l'infection des hépatocytes est l'absence du récepteur CD4 et que cette restriction peut être contournée par l'utilisation du glycolipide GalCer par certaines souches virales pour permettre la fusion. Dans un second temps, nous avons mis en évidence la capacité des hépatocytes à transmettre en tram à des lymphocytes T CD4⁺ activés des particules virales liés à leur surface. Ce mode d'infection très efficace nécessite l'interaction de la molécule ICAM-1 exprimée sur les hépatocytes avec la molécule LFA-1 des lymphocytes T CD4⁺ activés. Cette émde présente un nouveau moyen pour le virus d'infecter très efficacement des sous populations de lymphocytes T CD4⁺ spécifiquement enrichies dans le foie. Globalement, les résultats de nos travaux associés aux connaissances croissantes sur l'immunité du foie nous conduisent à penser qu'il serait essentiel d'analyser l'impact des mécanismes immunitaires contrôlés par le foie sur le cercle vicieux de l'immunopatiiogénèse de l'infection au VIH-1

Optimisation d'une approche pour l'analyse de l'expression de gènes au niveau unicellulaire chez des sous-populations spécialisées de lymphocytes T CD4+ humaines

Chez les patients cancéreux, les cellules malignes sont souvent reconnues et détruites par les cellules T cytotoxiques du patient. C'est pourquoi, depuis plusieurs années, des recherches visent à produire des vaccins sensibilisant les cellules de l'immunité adaptative, afin de prévenir certains cancers. Bien que les vaccins ciblant les cellules T CD8+ (cytotoxiques) ont une efficacité in-vitro élevée, un vaccin pouvant cibler les cellules T CD8+ et CD4+ aurait une plus grande efficacité (1-3). En effet, les cellules T helper (CD4+) favorisent la production et la maintenance des cellules T CD8+ mémoires à longue durée de vie. Il existe un grand nombre de sous-types de cellules T CD4+ et leur action envers les cellules cancéreuses est différente. Par exemple, les lymphocytes Treg ont une activité pro-tumorale importante (4) et les lymphocytes Th1 ont une activité anti-tumorale (5). Cependant, le taux naturel des différents sous-types de cellules T CD4+ spécifiques aux antigènes tumoraux est variable. De plus, une certaine flexibilité des différents sous-types de cellules T CD4+ a été récemment démontrée (6). Celle-ci pourrait être ciblée par des protocoles de vaccination avec des antigènes tumoraux administrés conjointement à des adjuvants définis. Pour cela, il faut approfondir les connaissances sur le rôle des cellules T CD4+ spécifiques aux antigènes dans l'immunité anti-tumorale et connaître précisément la proportion des sous-types de cellules T CD4+ activées avant et après la vaccination. L'analyse des cellules T, par la cytométrie de flux, est très souvent limité par le besoin d'un nombre très élevé de cellules pour l'analyse de l'expression protéique. Or dans l'analyse des cellules T CD4+ spécifiques aux antigènes tumoraux cette technique n'est souvent pas applicable, car ces cellules sont présentes en très faible quantité dans le sang et dans les tissus tumoraux. C'est pourquoi, une approche basée sur l'analyse de la cellule T individuelle a été mise en place afin d'étudier l'expression du profil génétique des cellules T CD8+ et CD4+. (7,8) Méthode : Ce nouveau protocole (« single cell ») a été élaboré à partir d'une modification du protocole PCR-RT, qui permet la détection spécifique de l'ADN complémentaire (ADNc) après la transcription globale de l'ARN messager (ARNm) exprimé par une cellule T individuelle. Dans ce travail, nous optimisons cette nouvelle technique d'analyse pour les cellules T CD4+, en sélectionnant les meilleures amorces. Tout d'abord, des clones à profils fonctionnels connus sont générés par cytométrie de flux à partir de cellules T CD4+ d'un donneur sain. Pour cette étape d'optimisation des amorces, la spécificité des cellules T CD4+ n'est pas prise en considération. Il est, donc, possible d'étudier et de trier ces clones par cytométrie de flux. Ensuite, grâce au protocole « single cell », nous testons par PCR les amorces des différents facteurs spécifiques de chaque sous-type des T CD4+ sur des aliquotes issus d'une cellule provenant des clones générés. Nous sélectionnons les amorces dont la sensibilité, la spécificité ainsi que les valeurs prédictives positives et négatives des tests sont les meilleures. (9) Conclusion : Durant ce travail nous avons généré de l'ADNc de cellules T individuelles et sélectionné douze paires d'amorces pour l'identification des sous-types de cellules T CD4+ par la technique d'analyse PCR « single cell ». Les facteurs spécifiques aux cellules Th2 : IL-4, IL-5, IL-13, CRTh2, GATA3 ; les facteurs spécifiques aux cellules Th1 : TNFα, IL-2 ; les facteurs spécifiques aux cellules Treg : FOXP3, IL-2RA ; les facteurs spécifiques aux cellules Th17 : RORC, CCR6 et un facteur spécifique aux cellules naïves : CCR7. Ces amorces peuvent être utilisées dans le futur en combinaison avec des cellules antigènes-spécifiques triées par marquage des multimères pMHCII. Cette méthode permettra de comprendre le rôle ainsi que l'amplitude et la diversité fonctionnelle de la réponse de la cellule T CD4+ antigène-spécifique dans les cancers et dans d'autres maladies. Cela afin d'affiner les recherches en immunothérapie oncologique. (8

Implication du Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) dans la perturbation fonctionnelle de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien lors d'un sepsis expérimental

Le sepsis est l'une des principales causes de mortalité en Amérique du nord (taux de mortalité : 30 à 60%). Les patients en sepsis qui décèdent sont souvent en"insuffisance surrénalienne relative", caractérisée par leur incapacité de produire suffisamment de glucocorticoïdes (GC) après stimulation à l'ACTH et une dysfonction de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HHS). La sécrétion de GC est contrôlée par l'hormone adrénocorticotrope (ACTH), la vasopressine (AVP) et des cytokines comme le Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF), un puissant agent pro-inflammatoire. MIF inhibe les effets du cortisol et de l'AVP. Hypothèses : MIF est impliqué dans l'incapacité de la glande surrénale à répondre adéquatement au stress induit par le sepsis. Son action s'exerce au niveau hypophysaire, altérant la sécrétion d'ACTH ou directement au niveau de la glande surrénale, interférant avec l'action de l'ACTH et de l'AVP. Méthodes : Modèle de rat soumis à un sepsis subaigu endotoxinique (10 mg/kg de LPS 055: B5 E.coli, 18 « 2 hs, avec ou sans coinfusion d'anti-MIF) et cultures primaires de cellules corticosurrénaliennes. Résultats : Validation du modèle animal. Les signes cliniques, l'hypertrophie des glandes surrénales accompagnée de modifications de la structure cellulaire et tissulaire, l'augmentation des taux plasmatiques d'ACTH et de corticostérone, la dissociation ACTH/corticostérone et l'augmentation d'AVP valident le modèle. Impact du traitement anti-MIF. Bien qu'aucune amélioration clinique n'ait été observée, le traitement avec de l'anti-MIF restaure une structure des glandes surrénales proche de la normale chez les animaux en sepsis subaigu. Ceci confirme de façon indirecte que, dans ce contexte, le MIF contribue à modifier la structure de ces glandes avec des impacts fonctionnels potentiels. Validation du modèle cellulaire.Le traitement à l'ACTH (10[indice supérieur -8]M) des cellules fasciculées induit une augmentation de corticostérone et le LPS induit une hypertrophie des cellules. Présence de MIF et CD74. In vivo, les immunobuvardages confirment la présence de MIF et CD74 dans l'hypophyse et les glandes surrénales avec une diminution d'expression de MIF hypophysaire opposée à une augmentation au niveau surrénalien lors du sepsis. In vitro, l'immunofluorescence confirme la présence de MIF et CD74 dans les cellules fasciculées, avec une colocalisation après traitement au LPS (0.1 mg/ml). MIF active la voie de p42/44[indice supérieur mapk] confirmant la présence de son récepteur CD74, son co-récepteur CD44 dans la glande surrénale et leur fonctionnalité. Conclusion : Nos modèles valident l'implication de MIF dans la régulation de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien et sa fonction surrénalienne

Effet du VIP sur la modulation des réponses des cellules dendritiques

Les cellules dendritiques (CDs) sont des cellules présentatrices d'antigènes agissant comme messagers entre l'immunité innée et adaptative. Elles sont activées par des molécules endogènes : Danger-Associated Molecular Patterns (DAMPS) ou exogènes : Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPS). Ces molécules modulent l'expression des récepteurs à la surface des CDs, la production de cytokines et la libération d'exosomes dans le milieu extracellulaire. De plus, il est connu que le neuropeptide Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) réduit l'activation des CDs par des PAMPS. Mon projet vise à étudier si l'activation des CDs par des DAMPS peut aussi être régulée par le VIP. Les résultats obtenus montrent que des DAMPs (ex : cristaux d'urate monosodique) et des PAMPS (ex : Lipopolysaccharide : LPS) provoquent une activation des CDs qui est diminuée en présence de VIP. Nous observons également que ce peptide diminue la production de cytokines et la quantité d'exosomes dans le milieu extracellulaire en réponse aux cristaux d'urate monosodique. Le VIP régule l'activation des CDs par des DAMPS ainsi que la production d'exosomes

Modulation fonctionnelle des cellules dendritiques par les Neutrophil Extracellular Traps

Les polynucléaires neutrophiles (PN) sont des cellules essentielles au cours de la réponse immunitaire innée ; recrutés rapidement au site inflammatoire où ils participent à la phase aigüe, ils vont aussi contribuer à la résolution de l inflammation. Ils peuvent en effet moduler la réponse adaptative par interaction avec les lymphocytes (Ly) ou les cellules dendritiques (DC) via des médiateurs solubles ou des interactions cellulaires directes. Les Neutrophil Extracellular Traps (NETs) libérés par les PN activés pourraient jouer un rôle important dans ce contexte. Les NETs sont des filaments de chromatine décondensée associés à des protéines issues principalement des granulations et du cytoplasme. Ils sont essentiels dans la réponse anti-infectieuse mais semblent également impliqués dans la physiopathologie de certaines maladies auto-immunes et inflammatoires. L objectif de ce travail a été d évaluer les effets des NETs sur la maturation des DC dans un contexte inflammatoire au cours duquel les PN et les DC peuvent co-exister, assurant ainsi un pont entre immunité innée et immunité adaptative. La première partie de ce travail a consisté à développer un modèle de production, isolement et caractérisation des NETs issus de PN sanguins humains. L ionophore de calcium A23187 a été choisi pour induire les NETs et l'enzyme de restriction AluI a permis la récupération de fragments de NETs de taille hétérogène. Certains des composants de ces NETs sont quantifiables (ADN, élastase, histone 3 en particulier), et nous avons montré qu ils conservaient leurs capacités bactéricides in vitro. Ces échantillons de NETs constituent donc un outil biologique standardisé, permettant d évaluer leurs effets sur des cellules ou des tissus. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons mis en évidence que ces NETs purifiés régulaient négativement la maturation de moDC induites par le LPS (expression de HLA-DR, CD80, CD83, CD86 et production de TNFa, IL-12, IL-6, IL-23). De plus, les NETs diminuent la capacité de ces moDC à induire la prolifération des LyT, et leur polarisation est modulée en favorisant la production de cytokines de type Th2 (IL-5 et IL-13) aux dépens de cytokines de types Th1 (INFg) et Th17 (IL-17). De manière intéressante, la capacité de migration des moDC activées par le LPS n est pas modifiée en présence de NETs. En résumé, ces résultats suggèrent que les NETs pourraient jouer un rôle immunorégulateur sur la maturation des moDC dans des conditions inflammatoires. Les NETs produits par les PN activés pourraient ainsi participer à la régulation indispensable de la réponse inflammatoire.Polymorphonuclear neutrophils (PMN) are innate immune cells rapidly recruited to the inflammatory sites where they play a major role during the acute phase response but also contribute to resolution and repair. They can also modulate the adaptive response by interacting with lymphocytes (Ly) or dendritic cells (DC) via soluble mediators or cell-cell contacts. Activated PMN release Neutrophil Extracellular Traps (NETs) that could play a role in this context. NETs are decondensed chromatin fibers associated with granule and cytoplasmic proteins. As they are mainly involved in host defense against infection, they contribute to some autoimmune and inflammatory diseases. The aim of this work was to evaluate NET effects on DC maturation in an inflammatory context where PMN and DC co-exist, thus bridging innate and adaptive immunity. We first developed a model to induce, isolate and characterize NETs from human PMN. Calcium ionophore A23187 was chosen to induce NETs and the restriction enzyme AluI allowed the recovery of heterogeneous-sized fragments of NETs. Some of their components were quantified (DNA, elastase, histone 3, in particular) and we found that they retained their bactericidal activity. These NETs samples thus constitute a new and important biological tool to study their effects on immune cells or tissues. In the second part of this work, we found that isolated NETs were able to down-regulate LPS-induced moDC maturation as evidenced by the expressions of HLA-DR, CD80, CD83, CD86 and cytokine release (TNFa, Il-6, IL-12, Il-23). Moreover, the presence of NETs during moDC maturation lead to a decrease capacity of these moDC to induce T lymphocyte proliferation and modulated polarization by promoting the production of Th2 cytokines (IL-5 and IL-13) and decreasing Th1 cytokines (INFg) and Th17 (IL- 17). Interestingly, moDC migration capacity was not modified when moDC maturation was done in the presence of NETs. In summary, these data suggest that NETs could downregulate DC activation. NETs produced by activated PMN could thus participate to the regulation of inflammation.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Rôle du CD40 dans la mort cellulaire

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal