Biosynthesis of lignans. Part I . Biosynthesis of Arctiin (3) and Phillyrin (5)

Lignans constitute a class of naturally occuring phenolic compounds, widely distributed in higher plants. They are formally composed of two phenylpropanoid units, stercospecifically joined at the /f-carbon atoms of their side chains. Their biosynthesis has as yet not been investigated. To sec, if these plant phenolics originate from simple phenylpropancs, various radioactively labelled, putative precursors were fed to Forsythia shoots. Chemically synthezised arylpropane derivatives, such as Ή/1 'C-glucoferulic acid, -glucoferulic aldehyde, and -coniferin were incorporated into the lignans arctiin (3) and phillyrin (5) while 3H-3,4-dimcthoxycinnamic acid was not incorporated. From these results i t may be concluded that the hydroxylated compounds are direct precursors of these dimeric phenylpropanes and are incorporated through a dimerisation step without degradation of the Q - Q skeleton

Regulation of biosynthesis and transport of strigolactones and their effect on plant development

Strigolactonen zijn van carotenoïden afkomstige signaalmoleculen, aanvankelijk geïdentificeerd als de kiemstimulantia voor wortelparasieten van de Orobanchaceae familie en pre-symbiotisch signaal voor arbusculaire mycorrhiza (AM) schimmels. Strigolactonen zijn aangetoond in de wortelextracten en exudaten van diverse plantensoorten. Recent zijn strigolactonen - of hun afgeleiden - geïdentificeerd als plantenhormoon betrokken bij de regulatie van de plantarchitectuur. Het lijkt erop dat strigolactonen vooral in de wortels worden geproduceerd, maar de exacte plaats van strigolacton biosynthese is onbekend. Niettemin is het waarschijnlijk dat strigolactonen vanuit de wortels naar de scheut worden getransporteerd waar zij hun remmende werking op okselknopuitgroei, in samenwerking met auxine en cytokinines, uitoefenen. Tot nu toe zijn strigolactonen in de scheut van planten niet of nauwelijks aangetoond. Ook de biosynthese van strigolactonen is nog niet volledig opgehelderd. Een onbekend carotenoid substraat wordt opeenvolgend geknipt door CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 7 (CCD7) en CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 8 (CCD8). Hiernaast, zijn twee enzymen, MORE AXILLARY GROWTH 1 (MAX1) and DWARF 27 (D27), betrokken bij de biosyntheses van strigolactonen, maar hun exacte rol is onbekend. In hoofdstuk 1, worden de wortelparasitaire planten van de Orobanchaceae familie en de problemen welke zij veroorzaken in de landbouw geïntroduceerd. Verder wordt de rol van strigolactonen in de levenscyclus van deze parasieten en in AM symbiose besproken. Daarnaast, wordt de recent ontdekte hormonale functie van strigolactonen in de plantarchitectuur, hun biosynthese, hormonale signalering en de twee gangbare theorieën over hoe strigolactonen een rol spelen bij apicale dominantie beschreven. Van 5-deoxystrigol wordt gedacht dat dit het eerste echte strigolacton afkomstig van de strigolacton biosynthese route is. Aangenomen wordt dat 5-deoxystrigol via een aantal - al dan niet enzymatische - stappen de precursor is voor alle andere bekende strigolactonen. In hoofdstuk 2, wordt de biosynthese van solanacol in de wortel van tomaat (Solanum lycopersicum) beschreven. Solanacol heeft een aromatische A-ring en daardoor is de biosyntheses van dit strigolactone via 5-deoxystrigol niet voor de hand liggend. Op basis van de aanwezigheid van andere strigolactonen in tomaat (orobanchol, orobanchyl acetate, twee 7-hydroxy-orobanchol isomeren, 7-oxo-orobanchol en vier didehydro-orobanchol isomeren) speculeren wij hoe solanacol door een series van enzymatische hydroxylatie-dehydroxylatie reacties, de migratie van een methyl groep en de introductie van dubbele bindingen van 5-deoxystrigol afgeleid kan zijn. In hoofdstuk 3bespreken we de klonering van een tomaat CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 8(SlCCD8) en demonsteren dat een reductie in CCD8 expressie leid tot een reductie van strigolactonen in de wortel extracten, exudaten en het xyleem sap. Alle lijnen tonen excessieve zijscheutgroei, zijn korter en hebben meer internodes. Ook demonstreren wij dat de sterkte van al deze fenotypes correleert met de concentratie orobanchol in het xyleem sap. Verder tonen we aan dat een milde reductie in strigolacton biosynthese en de gerelateerde secretie naar de rhizosphere voldoende is om parasitisme door Phelipanche ramosa met 90% te verminderen. Dit zonder de apicale dominantie of AM symbiose te sterk nadelig te beïnvloeden. Verder melden we enkele additionele fenotypes in de reproductieve ontwikkeling van tomaat (zoals kleinere bloemen, vruchten en zaden) - normaliter geassocieerd met gereduceerde auxine niveaus. We demonstreren verlaagde niveaus van vrij auxine in deze organen, wat er op wijst dat deze fenotypes mogelijk een consequentie zijn van het ontbreken van het regulerende effect van strigolactonen op het auxine niveau. Het goed beschreven plant hormoon abscissine zuur (ABA) is net als de strigolactonen afkomstig van de carotenoïden. Eerdere experimenten binnen onze groep wezen uit dat een mutatie in 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED) – een sleutel enzym betrokken bij de ABA biosyntheses – leidt tot een reductie in de strigolacton productie. Dit gaf aanleiding tot onderzoek naar de relatie tussen ABA en strigolactonen. De resultaten van dit onderzoek worden omschreven in hoofdstuk 4. Wij demonstreren dat applicatie van de carotenoid cleavage dioxygenase (CCD) inhibitor D2 het strigolacton niveau verlaagt, maar geen effect heeft op de ABA concentraties. Echter, in planten behandeld met abamineSG – een remmer van de 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenases (NCEDs) - en in de ABA deficiënte mutanten notabilis, sitiens en flacca (mutanten in twee verschillende enzymatische stappen van de ABA biosynthese), zijn de niveaus van zowel ABA als strigolactonen gereduceerd. Onze resultaten duiden op een correlatie tussen ABA niveaus en strigolacton biosynthese en wijzen op een mogelijke rol van ABA in de regulatie van strigolacton biosynthese. In hoofdstuk 5wordt de rol van twee GRAS-type transcriptie factoren (NSP1 en NSP2) in de regulatie van strigolacton biosynthese besproken. In peulvruchten hebben deze transcriptie factoren een essentiële rol in de door Rhizobium Nod factor geïnduceerde nodulatie. In dit hoofdstuk tonen we aan dat NSP1 en NSP2 ook vereist zijn voor de strigolactone biosynthese in Medicago truncatula (Medicago) enrijst. Hiervoor is Medicago opgezet als een modelplant voor stigolacton analyse. Ook tonen wij aan dat het strigolactonenmengsel van M. truncatulabestaat uit dedihydro-orobanchol (major) en orobanchol (minor). In dit werk identificeren we voor het eerst transcriptie factoren welke de biosynthese van strigolactonen reguleren. Wij tonen aan dat NSP1 de strigolacton biosynthese reguleert door middel van de regulatie van de expressie van D27. Een in vitro binding studie toont dat MtD27 eenprimair doel van MtNSP1 kan zijn. Verder tonen wij aan dat MtNSP2 essentieel is voor de conversie van orobanchol naar dedihydro-orobanchol. Het feit dat NSP1 en NSP2 vereist zijn voor strigolacton biosynthese in zowel rijst als Medicago - soorten die twee verschillende fylogenetische geslachten vertegenwoordigen welke ongeveer 150 miljoen jaar geleden ontstaan zijn – brengt ons tot de aanname dat de regulatie van de strigolacton biosynthese door NSP1 en NSP2 als een voorouderlijke functie in hogere planten is geconserveerd. In hoofdstuk 6bestuderen we strigolacton biosynthese in Arabidopsis thaliana (Arabidopsis). Strikte controle van de groeicondities en optimalisatie van de analytische protocollen voor strigolacton analyse maakte de detectie van orobanchol, orobanchyl acetaat en 5-deoxystrigol in Arabidopsis mogelijk. In dit hoofdstuk tonen wij aan dat de relatie tussen fosfaat tekort en de inductie van strigolacton biosynthes ook in deze soort aanwezig is. Dat is opmerkelijk omdat Arabidopsis geen AM symbiose aangaat in tegenstelling tot de meeste andere landplanten. Het ontbreken van AM symbiose in Arabidopsis is daarom mogelijk een verloren eigenschap. Wij speculeren dat de exudatie van strigolactonen naar de rhizosfeer – wat Arabidopsis zij het in lage hoeveelheden nog steeds doet - een overblijfsel is van deze voorouderlijke eigenschap welke door Arabidopsis verloren is. Echter, onze resultaten demonstreren dat de verhoging van de strigolacton biosynthese in Arabidopsis onder fosfaat tekort dient om de groei van de zijscheuten te verminderen onder deze suboptimale condities. Wij speculeren dat dit mogelijk een evolutionair voordeel schept welke de nieuwe stuwende kracht is voor het behoud van fosfaat-tekort geïnduceerde verhoging van de strigolacton biosynthese in Arabidopsis, aangezien AM symbiose niet meer aanwezig is.We tonen aan dat orobanchol getransporteerd wordt in het xyleem sap en dat de concentratie hiervan omhoog gaat onder fosfaat tekort. Verder leveren we analytisch bewijs dat MAX1 is vereist voor de biosynthese van orobanchol. Een nieuwe functie van strigolactonen in de regulatie van wortelarchitectuur in tomaat en Arabidopsis is recent ontdekt. In hoofdstuk 7tonen we dat een reductie in strigolacton biosynthese en/of perceptie - als vertoond in de max1,2,4 mutanten - leidt tot een reductie in de lengte van het primaire wortelmeristeem. We demonstreren dat toediening van het synthetische strigolacton GR24 dit fenotype in alle max mutanten - uitgezonderd de strigolacton ongevoelige mutant max2 – kan herstellen.De toediening van GR24 onder toereikende fosfaat condities reduceert het totale aantal laterale wortels per plant - hun ontwikkeling wordt gestopt in fase vijf van de laterale wortel primordium initiatie. Ook tonen wij aan dat hogere concentraties GR24 de initiatie van deze laterale wortel primordia compleet blokkeren wat leidt tot het instorten van het primaire wortelmeristeem.Echter, als GR24 samen met exogeen auxine (NAA) wordt toegediend heeft het een stimulerend effect op de laterale wortelontwikkeling en -uitgroei. Daaraan analoog, onder fosfaatbeperkende condities stimuleert de verhoging van endogene strigolacton niveaus (hoofdstuk 6) in wild type planten een snellere uitgroei van laterale wortel primordia vergeleken met de strigolacton-deficiënte mutanten. Verder demonstreren wij dat – onder toereikende fosfaat condities - GR24 toediening aan het wortelsysteem van Arabidopsis leidt tot een lagere auxineconcentratie in de bladeren. Gecombineerd wijzen deze resultaten erop dat strigolactonen lokale auxine gradiënten modificeren en zo invloed uitoefenen op de wortel architectuur. Daardoor zal het netto resultaat van de strigolactone werking op de ontwikkeling van het wortelstelsel afhangen van de auxine status van een plant. Wij denken dat een uiterst fijn gereguleerde balans tussen auxine en strigolactonen de basis vormt voor het mechanisme dat de wortel-scheut ratio van een plant reguleert, bijvoorbeeld onder fosfaat limiterende condities. Hoofdstuk 8is een samenvatting en discussie van de meest belangrijke resultaten verkregen gedurende het werk gepresenteerd in dit proefschrift. Er wordt getracht de nieuw verkregen kennis te integreren met de huidige kennis van strigolactonen. Zowel op het gebied van hun hormonale eigenschappen als hun rol als rhizosfeer signaal. In dit hoofdstuk word verder vooruit gekeken naar de perspectieven van het onderzoek aan strigolactonen. Speciale aandacht wordt besteed aan de relatie met het probleem van de parasitaire planten. </p

Erhöhung der Fettsäuresynthese von Regenbogenforellen durch Isoflavone

Der Einsatz von Fischöl als Futtermittelrohstoff ist durch die begrenzte Produktionsmenge bei gestiegener Nachfrage und einer damit einhergehenden Preiserhöhung zu einem limitierenden Faktor in der Aquakulturproduktion geworden. Auf Grund dessen werden vermehrt pflanzliche Öle als Substitut für Fischöl in der Fischernährung eingesetzt, was zu einer Senkung der Produktqualität der Fische durch niedrigere Gehalte an langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren (LC-PUFA, englisch: long-chain polyunsaturated fatty acids) führt. Ziel dieses Projekts war es deshalb, Möglichkeiten zur Steigerung der endogenen Biosynthese von LC-PUFA zu evaluieren, um die Gehalte an Eicosapentaensäure (20:5n-3, EPA) und Docosahexaensäure (22:6n-3, DHA) in der Regenbogenforelle zu erhöhen. Isoflavone sind bioaktive Substanzen, die über verschiedene Wirkmechanismen die Fettsäurebiosynthese beeinflussen können. Sie können als Liganden für Transkriptionsfaktoren fungieren, die zentral an der LC-PUFA Biosynthese beteiligt sind. Außerdem besitzen sie als Phytoöstrogene eine Strukturähnlichkeit zum Östrogen Estradiol. Da die Expression bestimmter Gene der LC-PUFA Synthese durch Östrogen beeinflusst werden kann, könnte dadurch ebenfalls der Gehalt an EPA und DHA im Fisch gesteigert werden. Deshalb sollten im Zellkulturmodell wirksame Isoflavon-Varianten identifiziert werden, die zu einer Erhöhung der EPA- und DHA-Spiegel beitragen könnten. Beispielsweise akkumulierte die α-Linolensäure (18:3n-3, ALA) im humanen in-vitro-Modell durch die Gabe von Genistein, jedoch sank der EPA-Gehalt signifikant ab und der DHA-Gehalt wurde nicht reguliert. Im Regenbogenforellen-Hepatozyten-Modell blieb die Fettsäuresynthese durch Genistein gänzlich unbeeinflusst. Im ersten in vivo Versuch sollten nun ebenfalls diejenigen Isoflavone und diätetischen Fettsäuremuster identifiziert werden, die einen positiven Einfluss auf die LC-PUFA-Gehalte in der Regenbogenforelle haben. Als zusätzliche Komponente, die LC-PUFA Biosynthese zu steigern, wurde das Öl der Pflanze Buglossoides arvensis in die Studien mit aufgenommen. Dieses Öl ist sowohl reich an ALA, als auch an Stearidonsäure (18:4n-3, SDA). SDA ist in den kommerziell verwendeten Pflanzenölen für die Fischernährung nicht vorhanden. Durch die direkte Bereitstellung von SDA über das Futtermittel sollte die Effizienz der Synthese gesteigert werden. Für den Versuch wurden nun verschiedene Isoflavone (Daidzein, Biochanin A, Formononetin, Equol and Genistein) mit drei verschiedenen Ölkompositionen kombiniert: Eine Mischung, basierend auf Fischöl und pflanzlichen Ölen, eine Mischung aus herkömmlichen pflanzlichen Ölen und eine Mischung aus herkömmlichen pflanzlichen Ölen und dem Öl der Pflanze Buglossoides arvensis. Zusätzlich gab es jeweils eine Diät dieser Ölmischungen ohne Additiv, die als Kontrolldiät verwendet wurde. In diesem Versuch zeigten alle Fische, die mit einer Equol- bzw. Genistein-Diät gefüttert wurden, einen leicht erhöhten DHA-Gehalt im Ganzkörperhomogenat im Vergleich zur jeweiligen Kontrollgruppe. Der Effekt der Substanzen auf die endogene Biosynthese konnte allerdings nicht durch molekularbiologische Methoden nachgewiesen werden, da die hepatischen mRNA Level der delta-6-Desaturase (fads2a(d6)) und der Carnitin Palmitoyltransferasen 1 a und c keine Veränderung im Vergleich zu den Werten der Kontrollgruppe aufwiesen, beziehungsweise sogar gegensätzlich beeinflusst wurden (fads2a(d6)). Insgesamt konnten die Fische, denen Diäten mit rein pflanzlichen Ölen verabreicht wurden, nicht die LC-PUFA Gehalte der Fische erreichen, die mit einer Fischöl-basierten Diät gefüttert wurden. Beim Vergleich der Kontrollgruppen zeigte sich, dass die Fische, die mit Buglossoides arvensis Öl gefüttert wurden, höhere EPA-Gehalte im Ganzkörperhomogenat aufwiesen, als diejenigen Fische, die mit den kommerziellen pflanzlichen Ölen gefüttert wurden. Der zweite Versuch wurde in zwei Teilversuche untergliedert. Im ersten Teil sollte eine weitere Steigerung der DHA-Gehalte in den Forellen erzielt werden, indem ihnen Diäten mit Equol und Genistein zu unterschiedlichen Konzentrationen verabreicht wurden. Die Substanzen wurden mit zwei verschiedenen Ölkompositionen kombiniert: Einerseits wurde eine Mischung aus herkömmlichen pflanzlichen Ölen verwendet, andererseits eine Mischung aus herkömmlichen pflanzlichen Ölen und dem Öl der Pflanze Buglossoides arvensis. In den Fischen, die eine Kombination aus rein pflanzlichen Ölen und Genistein bzw. Equol erhalten haben, wurden keine Effekte auf die Fettsäuremuster der Fischgewebe nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wiesen diejenigen Fische, die eine Kombination aus Buglossoides arvensis und Equol erhielten, im Vergleich zur Kontrollgruppe marginal erhöhte LC-PUFA-Gehalte in den Geweben auf. Dagegen gab es keine Erhöhung der LC-PUFA Gehalte in den Fischen, die mit den Genistein-Diäten gefüttert wurden. Im zweiten Teil des zweiten Versuchs sollte das Öl der Pflanze Buglossoides arvensis auf seine Eignung als Futtermittelrohstoff hin untersucht werden. Durch das besondere Fettsäuremuster dieses Öls sollte die Effizienz der LC-PUFA-Biosynthese gesteigert werden. Hierfür wurde eine Diät basierend auf einer Mischung aus Fischöl und pflanzlichen Ölen schrittweise mit diesem Öl substituiert. Die höchsten Gehalte dieses Öls führten zu einem Anstieg des EPA-Gehalts im Filet der Forellen, verglichen mit der Kontrollgruppe. Der DHA-Gehalt im Filet war nicht signifikant unterschiedlich zwischen den Fütterungsgruppen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die endogene Biosynthese von LC-PUFA in Regenbogenforellen sowohl durch ein bestimmtes Fettsäuremuster der Nahrung als auch durch bioaktive Substanzen, respektive deren Kombination gesteigert werden kann. Die Wirkung der Substanzen Equol und Genistein scheint allerdings abhängig von der verabreichten Dosis und des Fettsäuremusters des Futtermittels zu sein. Diesbezüglich ist noch Forschungsbedarf nötig. Dagegen ist die Wirkung des Öls der Pflanze Buglossoides arvensis auf die EPA Gehalte im Filet vorhanden und eine Steigerung von DHA scheint durch einen längeren Versuchszeitraum plausibel. Deshalb hat das Buglossoides arvensis Öl bzw. ein SDA-reiches Äquivalent ein höheres Potential zur Steigerung der LC-PUFA Biosynthese in Regenbogenforellen verglichen mit den hier untersuchten bioaktiven Substanzen

The formation of corydaline and related alkaloids in Corydalis cava in vivo and in vitro

Kein Inhaltsverz

Untersuchungen zur Topologie der Glycosylphosphatidylinositol-Biosynthese in Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulär lebendes, parasitisches Protozoon mit großer medizinischer Bedeutung vor allem in zwei Fällen: Zum einen bei Erstinfektion während einer Schwangerschaft, hier kann es zur Schädigung des Fötus kommen, zum anderen als opportunistischer Krankheitserreger bei immunsupprimierten Patienten (z. B. AIDS), hier kann eine Reaktivierung von Dauerstadien zum Tod führen. Einen Ansatzpunkt zur Bekämpfung der Parasiten stellt ein spezieller Stoffwechselweg dar, die Glycosylphosphatidylinositol- (GPI-) Biosynthese. GPIs bestehen aus einer konservierten hydrophilen Glycan-Grundstruktur, die durch Seitenketten modifiziert werden kann, und einem hydrophoben Inositol-Phospholipid. Wie bei einer Vielzahl anderer parasitärer Protozoen sind auch bei T. gondii die Hauptoberflächenproteine durch GPIs in der Zelloberfläche verankert, eine Blockierung der GPI-Biosynthese führt zum Absterben der Parasiten. Um bei therapeutischen Ansätzen jedoch nur die Parasiten zu bekämpfen und die in den Wirtszellen ebenfalls stattfindende GPI-Biosynthese nicht zu beeinflussen, sind detaillierte Kenntnisse über diesen Stoffwechselweg nötig. Es wurde ein System aus permeabilisierten Tachyzoiten von T. gondii entwickelt und erstmals die Verteilung von GPI-Ankervorläufern und weiterer GPI-Biosyntheseintermediate über die Membran des endoplasmatischen Reticulums (ER) untersucht. Durch hypotone Behandlung wird die Zellmembran effektiv permeabilisiert, das ER bleibt bei dieser Behandlung intakt. Dieses System wurde genutzt, um GPIs mit verschiedenen radioaktiven Vorläufermolekülen (Zuckernukleotiden) zu markieren. Die von permeabilisierten Toxoplasmen gebildeten GPI-Intermediate wurden anhand spezifischer enzymatischer Behandlungen und chemischer Hydrolysen charakterisiert und mit bereits bekannten Daten verglichen. Dabei wurde festgestellt, daß die hydrophilen Komponenten der GPI-Intermediate mit den beschriebenen Strukturen übereinstimmen. Außerdem konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, daß vor Einsetzen der Mannosylierungs-Schritte eine Acylierung am Inositol von GlcN-PI zu GlcN-(acyl)-PI erfolgt. Anschließend an die radioaktive Markierung der Glycolipide wurde mit Hilfe des Enzyms PI-PLC, das zwischen hydrophilem und hydrophobem Anteil der GPIs spaltet, die Orientierung der GPI-Biosyntheseintermediate in der ER-Membran untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sowohl frühe, als auch höher glycosylierte Intermediate und sogar GPI-Ankervorläufer zum überwiegenden Teil eine cytoplasmatische Orientierung in der ER-Membran aufweisen. Im Zusammenhang mit transienter Acylierung des Inositolringes scheint ein mehrfacher Wechsel der verschiedenen Intermediate über die ER-Membran ("flip-flop") möglich. Erstmals konnte hier gezeigt werden, daß derart große GPI-Ankervorläufer mit einer zusätzlichen hydrophilen Seitenkette, bestehend aus N-Acetyl-Galactosamina1-4Glucose, eine Lipid-Doppelmembran überqueren