Development of workflow for picornavirus genome sequence analysis

Picornaviruses are small, non-enveloped, icosahedral, positive stranded RNA viruses and among the most common human pathogens. Some of the clinically important genera for humans are Enterovirus, Hepatovirus, Parechovirus and Cardiovirus. The symptoms for tthe picornaviral infections range from mild, asymptomatic to fatal disease. Threats posed to human health by these viruses is observedd in the constant outbreaks of enteroviruses and parechoviruses in the different parts of the world. Next generation sequencing provides an efficient way to detect and identify known or novel micro-organisms. Advantages of NGS are rapid sequencing methods, high-throughput process and affordable costs. On the other hand, NGS also requires advanced technical and computational skills, and creates a bottleneck owing to necessity of standardization of bioinformatic tools. It is therefore imperative to optimize and determine parameters, which provide accuracy in every stage of NGS workflow. The aim of this thesis was to develop a rapid and straightforward, user-friendly workflow for the assembly and analysis of picornaviral genomes. Chipster platform was chosen as the primary test platform. The workflow involved use of automated analysis pipelines (VirusDetect and A5 assembly pipeline), and alternative approaches, which included pre-processing of raw data, and reference-mapping or de novo assembly (Velvet and SPAdes) of picornavirus sequences. Except for de novo assembly and validation and quality assessment of final outputs, all steps were performed in Chipster. Of these approaches, VirusDetect and reference-mapping were not successful. A5 pipeline for microbial genome assembly was found to be very suited for picornavirus identification. Velvet and SPAdes also performed well, but Velvet assembler was found to more computationally exhaustive and time consuming. Quality assessment suggested that performance of SPAdes was relatively better than the performance of A5 or Velvet. As A5 pipeline does not require any parameter settings, it can be used as initila identification and contig/scaffold generation method for picornaviral sequences. Together with implementation of de novo assembler(s) on Chipster platform a novel, user-friendly NGS workflow for picornavirus sequence assembly can be established

Caractérisation de l’importance clinique des rotavirus A et C dans la diarrhée des porcelets et leur excrétion jusqu’à l’âge adulte

Les rotavirus (RVs) sont une cause mondiale majeure de diarrhée néonatale chez une variété d’espèces animales, incluant le porc, ainsi que chez l’humain. Parmi les neuf sérogroupes de RVs (RVA à RVI) officiellement reconnus, les RVA sont considérés comme le groupe de RVs le plus important en raison de leur prévalence élevée et leur pathogénicité chez les humains ainsi que leur potentiel zoonotique fortement suspecté en lien avec le phénomène de réassortiment. Au Québec, aucune information récente n’est disponible concernant les souches de RVA en circulation chez l’espèce porcine. Par ailleurs, les RVC porcins ont été récemment étudiés dans plusieurs pays à travers le monde, révélant une implication potentielle de ces virus entériques dans les cas de diarrhées. Présentement, au Québec, les données de prévalence concernant les RVC chez le porc sont manquantes et leur caractérisation n’a pas été investiguée. La présente étude a donc évalué, sur une période de 29 mois, la prévalence et l’épidémiologie des RVA et RVC chez des porcs provenant de deux systèmes de production intégrée au Québec. Dans un premier système, l’importance clinique des RVs dans les élevages de maternité porcine a été évaluée et leur excrétion fécale jusqu’à l’âge de pré-abattage des porcs a été décrite. Pour le second système de production, la présence et la caractérisation des RVs en ferme d’engraissement porcin ont d’abord été étudiées. Par la suite, ces virus ont servi d’indicateurs de contamination virale entérique au sein de ce même système de production pré-abattage afin d’identifier des vecteurs et des réservoirs potentiels de transmission virale. Des analyses moléculaires basées sur la RT-PCR et le séquençage (Sanger et l’approche à haut débit) ont été utilisées pour détecter la présence des RVs et caractériser les génomes partiels et/ou complets afin de classifier les souches virales. Les résultats obtenus ont révélé la présence des RVA et RVC à tous les stades de production en ferme, avec une prédominance en période péri-sevrage. En maternité porcine, les RVC se sont révélés significativement associés au portrait clinique de diarrhée au niveau de la chambre (p=0.02), ce qui n’a pas été le cas pour les RVA. Les évaluations statistiques ont révélé une prévalence globale de 45.4% et 27.4% pour RVA et RVC chez le porcelet respectivement. Les analyses phylogénétiques ont démontré un changement fréquent des souches prédominantes de RVs d’un stade de production à l’autre. Dans le système de production pré-abattage, les résultats ont montré la contamination fréquente des fermes d’engraissement, des véhicules de transport animal et de la cour d’abattoir par les RVA. Une grande diversité génétique des souches de RVA a été décrite à travers les différents types d’environnements récoltés. Toutefois, des souches identiques de RVA ont pu être identifiées à partir d’échantillons de fermes, de la cour d’abattoir et des véhicules de transport d’animaux. Globalement, cette étude a permis de décrire la prévalence des RVA et RVC chez le porcelet au Québec et de caractériser les souches circulantes. Les résultats confirment l’importance des RVC comme agent causal de diarrhée chez les porcelets et décrivent, pour la première fois, des génomes complets de RVC porcins au Canada. Les résultats au niveau du système de pré-abattage suggèrent un rôle potentiel des abattoirs et des transporteurs d’animaux comme réservoirs et vecteurs de transmission pour les virus entériques. Ceux-ci pourraient contribuer à la propagation d’une contamination virale au sein d’un même système de production animale ou même entre différents systèmes.Rotaviruses (RVs) are a major global cause of neonatal diarrhea in a variety of animal species as well as humans. Among the nine officially recognized RV serogroups (RVA to RVI), RVA is considered to be the most important group due to their high prevalence and pathogenicity in humans and their zoonotic potential due to numerous evidence of reassortment events between human and animal strains, including swine. However, in Quebec, no recent information is available concerning the circulating strains of porcine RVA. Furthermore, RVC have been recently investigated in several countries across the world, revealing a potential involvement of these enteric viruses in swine diarrhea. Currently, in Quebec, data on prevalence of RVC in swine are lacking and characterisation of their strains has not been conducted. The present study evaluated the prevalence and epidemiology of RVA and RVC in swine from two integrated production systems in Quebec over a 29 month period. In a first system, the clinical importance of RVs in farrowing farms was investigated and dynamics of fecal excretion up to pre-slaughter age was described. For the second production system, the presence and characterization of RVs in fattening sites was first evaluated. Then, the dynamics of enteric viral contamination from this pre-slaughter system was investigated to identify potential vectors and reservoirs of viral transmission using porcine RVA as markers. Molecular analysis based on RT-PCR as well as Sanger and high-throughput sequencing were conducted to detect the presence of RVs and to characterize partial and/or complete viral genomes enabling classification of strains. Results revealed the presence of RVs throughout all stages of production on farm, with a predominance of these viruses surrounding the weaning period. In farrowing farms, RVC was found to be significantly associated to the clinical portrait of diarrhea (p=0.02) at the batch level, which was not the case for RVA. Statistical evaluations revealed an overall prevalence of 45.4% and 27.4% for RVA and RVC in piglets, respectively. Phylogenetic analysis of strains showed a frequent shift of predominant RV strains between production stages. In the pre-slaughter production system, the results revealed frequent contamination of fattening farms, livestock transportation vehicles and the abattoir yard by RVA. Although a large genetic diversity has been described throughout the different environmental sites collected, identical strains of RVA were identified from farm samples, the slaughter yard and the livestock transport vehicle. Overall, this study enabled the assessment of the current prevalence of porcine RVA and RVC in Quebec as well as the characterization of circulating strains. The results confirm the importance of RVC as a causative agent of diarrhea in piglets and describe, for the first time, complete porcine RVC genomes in Canada. Analysis from the pre-slaughter production system suggest a potential role for slaughterhouses and livestock transporters as reservoirs and vectors for enteric viruses, which may lead to the spread of viral contamination within an animal production system or even between different production systems