PEA PROTEIN-BASED CAPSULES FOR DELIVERY OF PROBIOTICS IN ANIMAL FEED

Probiotics have been used as a prophylactic antibiotic alternative to improve health and growth performance in animals. However, the selection of probiotic strains is limited due to the lack of stability during storage, processing and passage through the upper gastrointestinal tract. In the current study, pea protein isolate-alginate based capsules (PPC) were made by extrusion and their efficacy to improve probiotic viability during storage, feed processing and delivery to the distal intestine were investigated. Encapsulation protected against loss of Bifidobacterium adolescentis viability during freeze-drying compared to non-encapsulated bacteria. Capsules also improved the viability of freeze-dried B. adolescentis during long-term (335 d) storage at -80 °C. In contrast, encapsulation did not improve viability of B. adolescentis or Lactobacillus reuteri when stored above 0 ºC. Loss of viability during short duration (up to 180 s) heat challenge (up to 90 °C) was reduced by encapsulation. Encapsulation also protected against loss of viability during heat challenge up to 90 °C with a pressure of 95 MPa for 30 s, however, encapsulation did not protect bacteria added to feed and subject to commercial pelleting. A naturally selected antibiotic resistant L. reuteri, was selected to facilitate strain-specific tracking of viable bacteria in the gastrointestinal tract. Supplementation of pigs with encapsulated antibiotic resistant L. reuteri in feed did not increase bacterial counts in upper tract compared with non-encapsulated bacteria, however, the counts of viable antibiotic resistant L. reuteri in the distal gastrointestinal tract and feces of pigs was increased. In conclusion, pea protein isolate-alginate based encapsulation improved bacteria viability during freeze-drying and provided limited benefit during cold storage of sensitive bacteria. Improved resistance to environmental challenge (heat and pressure) was observed, but was insufficient to protect against conditions found during commercial feed pelleting. Encapsulation may improve the shelf life of probiotic bacteria during cold storage and this work is the first work to show improved delivery of bacteria to the distal digestive tract of the pig. However, post-pellet application technologies and improved methods of viability protection during storage above 0 ºC are required to broaden the commercial application of probiotics in the feed industry

Enteric Biopolymer Composite Coatings to Enhance the Viability of Powdered Probiotics During Preparation, Storage, and Simulated Digestions

Due to suppressed metabolisms, powdered probiotics are generally more stable and more convenient for applications than the liquid form, but much work is needed to improve viability of powdered probiotics during processing, storage, and digestions. The goal of this dissertation was to fabricate delivery systems with an enteric biopolymer coating and a core of powdered probiotic ingredients. The principle of preparing powdered probiotics was to directly mix a concentrated cell suspension with hygroscopic food ingredient powders. Amorphous spray-dried lactose (SDL) was first studied to prepared powdered Lactobacillus salivarius NRRL B-30514 in chapter 2. A smaller amount of cell suspension resulted in reduced water activity and lower hypertonic stress and therefore greater viable bacterial counts initially and during subsequent 6-month storage. The suspension: lactose ratio remarkably affected the lactose crystallinity and physiological states of L. salivarius. In chapter 3, milk protein concentrate (MPC) was mixed with SDL at different mass ratios before mixing with the cell suspension. MPC was suggested to preferentially absorb water in cell suspensions, which inhibited the hydration of SDL and thus lowered the hypertonic pressure to the adhered cells. To further improve probiotics viability, amorphous sucrose prepared by co-spray drying with whey protein isolate (WPI) was studied in chapter 4 to utilize the synergistic protection effects of WPI and sucrose. The WPI-Sucrose-probiotics powders (WSPP) with a higher amount of amorphous sucrose showed higher probiotics viability before and after 30-day storage and heating. In order to deliver powdered probiotics, modified rice protein (MRP)-ammonium shellac (NH4SL) enteric composite coatings were studied in Chapter 5 and interactions between MRP and NH4SL were studied. MRP and NH4SL formed complexes to enable suspension of MRP to form smooth films with improved mechanical and enteric properties. A higher content of MRP preserved films better at gastric conditions, and the resultant coating significantly improved the viability of enclosed WSPP pellets after 30-day ambient storage, heating at 80 ºC for 20 min, and during simulated gastrointestinal digestions. The novel, simple and cost-effective approaches studied in the present dissertation to prepare powdered probiotic ingredients are significant to manufacturing solid probiotics-containing products

The Preservative Efficacy of Antimicrobial Proteins and Metabolites from Microorganisms, Animals and Plants as Potential Alternative to Chemical Food Preservation: A Review

Food is a source of nutrients and energy for humans and animals. Though food is assumed to be safe for consumption, it is highly susceptible for microbial contamination responsible for health risks and economic loss. This requires the mechanism that keep food fresh and safe for extended period of time. So far, in human history various physical and chemical methods have been employed to extend shelf life. Unfortunately, these methods are found to have a lot of drawbacks that pose problem on the quality and safety of the product beyond consumer need. Biological preservation using microbial, plant and animal derived metabolites and antimicrobial peptides has recently got considerable attention as the safest way of extending shelf life of food with no adverse effects on product quality. The antimicrobial efficiency of antimicrobial peptides and metabolites have been found to significantly inhibit the growth of potent food borne pathogens and spoilage microorganisms. However, the efficacy of biological antimicrobial agents for food preservation is potentiated by combined application with fewer chemical preservatives with smart formulation of a series of hurdle called hurdle technology. In this review, reports on the efficacy of antimicrobial peptides and metabolites of microbes, plants and animals in preserving various food stuffs are well reviewed during independent application and as part of hurdle system. Keywords: Biological preservation, Food, Food quality, Hurdle technology, Microbial/plant/animal metabolites DOI: 10.7176/FSQM/87-05 Publication date:May 31st 201

Use of silica supports for enhancing the stability of folates and developing antimicrobial agents

Tesis por compendioThe present PhD thesis, entitled "Use of silica supports for enhancing the stability of folates and developing antimicrobial agents", focuses on the development and evaluation of new smart systems based on the use of silica nano- and microparticles as inorganic supports for the encapsulation or immobilization of two compounds types of interest to the food industry: vitamins and antimicrobials. The first chapter shows the effect of encapsulation of folic acid and 5-formyltetrahydrofolate in mesoporous silica microparticles functionalized with polyamines on the bioaccessibility and stability of both vitamers. The use of this hybrid organic-inorganic support allows the modification of the delivery of the vitamin dependent on the pH of the medium (inhibition of the release at an acidic pH, e.g. stomach, controlled release at a neutral pH, e.g. intestine) in in vitro systems. Also, the mesoporous support can protect the vitamin against degradation after exposure to external agents, such as pH, temperature or light. Furthermore, the incorporation of encapsulated folic acid into fruit juices (apple and orange) allowed us to study the modulating and protective capability of the delivery system in a real food matrix. This study has demonstrated that the amine-functionalized support is able to not only maintain folic acid inside pores after its incorporation into juices and to properly modify the delivery of the vitamin after simulated in vitro digestion, but to also protect the vitamin after the simulating the processing and storage of juices. The second chapter describes development of different antimicrobial agents based on the combination of organic active compounds with diverse silica materials. To this end, two different methodologies were used: encapsulation of the antimicrobial agent in the pores of mesoporous silica particles, and immobilization of the active compound on the surface of silica particles. The effect of encapsulation on the enhancement of the antimicrobial properties of a compound was studied by evaluating the antimicrobial activity of free and MCM-41 nanoparticles encapsulated caprylic acid against diverse pathogen food-borne bacteria. The results of the in vitro bacterial susceptibility assays and the determination of cellular damage by microscopy showed that the nanodevice maintains antimicrobial properties in relation to the free caprylic acid. The effect of the immobilization of an active compound on the surface of a support on the improvement of its antimicrobial properties was studied with two types of different molecules: polyamines (used as a molecular gate in the folates delivery system) and essential oils. In both cases, immobilization of the bioactive compound increased the antimicrobial effect of free molecules between 1- and 100-fold in the in vitro assays and in real food systems (fruit juices and pasteurized milk), in which immobilized compounds had a bacteriostatic effect during storage, while the equivalent free compound concentrations allowed microbial growth. In summary, it is concluded that the present thesis has evaluated the versatility of silicon oxide particles to solve two of the biggest problems in the food industry: alteration of active compounds during food processing and current antimicrobial systems losing of efficacy. Thus the developed devices may be used as alternative methods to traditional encapsulation systems or traditional food safety treatments.La presente tesis doctoral que lleva por título "Uso de soportes de sílice para la mejora de la estabilidad de los folatos y el desarrollo de agentes antimicrobianos", se centra en el desarrollo y evaluación de nuevos sistemas inteligentes basados en el uso de nano- y micropartículas de sílice como soporte inorgánico para la encapsulación o inmovilización de dos tipos de compuestos de interés para la industria alimentaria: vitaminas y antimicrobianos. El primer capítulo muestra el efecto de la encapsulación de ácido fólico y 5-formiltretahidrofolato en micropartículas mesoporosas de sílice funcionalizadas con poliaminas sobre la bioaccessibilidad y estabilidad de ambos vitámeros. Por una parte, el uso de este soporte híbrido orgánico-inorgánico permite modular la liberación de la vitamina en función del pH del medio (inhibición de la liberación a pH ácido -estómago- y liberación controlada a pH neutro -intestino-) en sistemas in vitro. Así mismo, el soporte mesoporoso es capaz de proteger a la vitamina frente a la degradación tras la exposición a diversos agentes externos, como el pH, la temperatura o la luz. Además, la incorporación de ácido fólico encapsulado a zumos de frutas (manzana y naranja) ha permitido estudiar la capacidad moduladora y protectora del sistema de liberación en una matriz alimentaria real. Este estudio ha demostrado que el soporte funcionalizado con poliaminas no sólo es capaz de mantener el ácido fólico en el interior de los poros tras la incorporación a los zumos y modular correctamente la liberación del mismo tras la simulación de una digestión in vitro, sino que también es capaz de proteger la vitamina tras la simulación del procesado y almacenamiento de los zumos. En el segundo capítulo se describe el desarrollo de diferentes agentes antimicrobianos, basados en la combinación de compuestos activos orgánicos con diversos materiales de sílice. Para ello, se emplearon dos metodologías diferentes: la encapsulación del agente antimicrobiano en los poros de las partículas mesoporosas de sílice, y la inmovilización del compuesto activo sobre la superficie de las partículas de sílice. El efecto de la encapsulación sobre la mejora de las propiedades antimicrobianas de un compuesto se estudió determinando la actividad antimicrobiana de ácido caprílico libre y encapsulado en nanopartículas mesoporosas tipo MCM-41 frente a diversas bacterias patógenas presentes en alimentos. Los resultados de los ensayos in vitro de susceptibilidad bacteriana y la determinación del daño celular mediante microscopia mostraron que el nanodispositivo mantiene las propiedades antimicrobianas respecto al ácido caprílico libre. El efecto de la inmovilización de un compuesto activo sobre la superficie de un soporte en la mejora de sus propiedades antimicrobianas se estudió con dos tipos de moléculas diferentes: poliaminas (usadas como puerta molecular en el sistema de liberación de folatos) y aceites esenciales. En ambos casos la inmovilización del compuesto bioactivo incrementó entre 1-100 veces el poder antimicrobiano de las moléculas libres tanto en ensayos in vitro, como en ensayos en alimentos reales (zumos de frutas y leche pasteurizada) donde se comprobó que los compuestos inmovilizados tienen un efecto bacteriostático a lo largo del período de almacenamiento mientras que concentraciones equivalentes de compuesto libre permiten el crecimiento del microorganismo. En resumen, se puede concluir que en la presente tesis se ha evaluado la versatilidad de los sólidos de óxido de silicio para solventar dos de los grandes problemas de la industria alimentaria: alteración de compuestos bioactivos durante el procesado del alimento y la pérdida de la eficacia de los sistemas antimicrobianos actuales. Así, los dispositivos desarrollados podrían ser usados como métodos alternativos a los sistemas tradicionales de encapsulación o los tratamientos tradicionaLa present tesi doctoral, que porta per títol "Ús de suports de sílice per a la millora de l'estabilitat dels folats i el desenvolupament d'agents antimicrobians", es centra en el desenvolupament i avaluació de nous sistemes intel·ligents basats en l'ús de nano- i micropartícules de sílice com a suport inorgànic per a l'encapsulació o immobilització de dos tipus de compostos d'interès per a la indústria alimentària: vitamines i antimicrobians. El primer capítol mostra l'efecte de l'encapsulació d'àcid fòlic i 5-formiltretahidrofolat en micropartícules mesoporoses de sílice funcionalitzades amb poliamines sobre la bioaccessibilitat i estabilitat d'ambdós vitàmers. D'una banda, l'ús d'aquest suport híbrid orgànic-inorgànic permet modular l'alliberament de la vitamina en funció del pH del medi (inhibició de l'alliberament a pH àcid -estómac- i alliberament controlat a pH neutre -intestí-) en sistemes in vitro. Així mateix, el suport mesoporós és capaç de protegir a la vitamina enfront de la degradació després de l'exposició a diversos agents externs, com el pH, la temperatura o la llum. A més, la incorporació d'àcid fòlic encapsulat a sucs de fruites (poma i taronja) ha permès estudiar la capacitat moduladora i protectora del sistema d'alliberament en una matriu alimentària real. Aquest estudi ha demostrat que el suport funcionalitzat amb poliamines no sols és capaç de mantindre l'àcid fòlic a l'interior dels porus després de la incorporació als sucs i modular correctament l'alliberament del mateix després de la simulació d'una digestió in vitro, sinó que també és capaç de protegir la vitamina després de la simulació del processat i emmagatzemament dels sucs. En el segon capítol es descriu el desenvolupament de diferents agents antimicrobians, basats en la combinació de compostos actius orgànics amb diversos materials de sílice. Per a això, es van emprar dues metodologies diferents: l'encapsulació de l'agent antimicrobià en els porus de les partícules mesoporoses de sílice, i la immobilització del compost actiu sobre la superfície de les partícules de sílice. L'efecte de l'encapsulació sobre la millora de les propietats antimicrobianes d'un compost es va estudiar determinant l'activitat antimicrobiana d'àcid caprílic lliure i encapsulat en nanopartícules mesoporoses tipus MCM-41 enfront de diversos bacteris patògens presents en aliments. Els resultats dels assajos in vitro de susceptibilitat bacteriana i la determinació del dany cel·lular per mitjà de microscòpia van mostrar que el nanodispositiu manté les propietats antimicrobianes respecte a l'àcid caprílic lliure. L'efecte de la immobilització d'un compost actiu sobre la superfície d'un suport en la millora de les seues propietats antimicrobianes es va estudiar amb dues tipus de molècules diferents: poliamines (usades com a porta molecular en el sistema d'alliberament de folats) i olis essencials. En ambdós casos la immobilització del compost bioactiu va incrementar entre 1-100 vegades el poder antimicrobià de les molècules lliures tant en assajos in vitro, como en assajos en aliments reals (sucs de fruites i llet pasteuritzada) on es va comprovar que els compostos immobilitzats tenen un efecte bacteriostàtic al llarg del període d' emmagatzemament mentre que concentracions equivalents de compost lliure permeten el creixement del microorganisme. En resum, es pot concloure que en la present tesi s'ha avaluat la versatilitat dels sòlids d'òxid de silici per a resoldre dos dels grans problemes de la indústria alimentària: alteració de compostos bioactius durant el processat de l'aliment i la pèrdua de la eficàcia dels sistemes antimicrobians actuals. Així, els dispositius desenvolupats podrien ser usats com a mètodes alternatius als sistemes tradicionals d'encapsulació o els tractaments tradicionals per assegurar la innocuïtat dels aliments.Ruiz Rico, M. (2016). Use of silica supports for enhancing the stability of folates and developing antimicrobial agents [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/76805TESISCompendi

Tehnike minimalne obrade za proizvodnju i čuvanje hrane prilagođene individualnim potrebama

Tailor-made foods, also known as foods with programmable properties, are specialised systems with unique composition prepared by different methods, using the known mechanisms of action of their bioactive ingredients. The development of tailor-made foods involves the evaluation of individual components, including bioactive substances derived from waste products of other productions, such as essential oils. These components are evaluated both individually and in combination within food compositions to achieve specific functionalities. This review focuses on the application of minimal processing technologies for the production and preservation of tailor-made foods. It examines a range of approaches, including traditional and emerging technologies, as well as novel ingredients such as biomolecules from various sources and microorganisms. These approaches are combined according to the principles of hurdle technology to achieve effective synergistic effects that enhance food safety and extend the shelf life of tailor-made foods, while maintaining their functional properties. §Paper was presented at the 11th Central European Congress on Food and Nutrition CEFood2022, Čatež ob Savi, Slovenia, 27-30 September 2022Hrana prilagođena individualnim potrebama, poznata i kao hrana s prilagođenim svojstvima, je posebno pripremljena hrana jedinstvenog sastava, dobivena različitim metodama koje se zasnivaju na dobro poznatim mehanizmima djelovanja biološki aktivnih sastojaka. Razvoj takve hrane obuhvaća procjenu pojedinih sastojaka, uključujući biološki aktivnih spojeva izoliranih iz otpada nastalog u proizvodnji, poput eteričnih ulja. Ti su spojevi ispitani pojedinačno i u kombinaciji sa sastojcima hrane, u svrhu razvoja određenih funkcionalnih svojstava. U fokusu ovog revijalnog prikaza je primjena tehnika minimalne obrade za proizvodnju i čuvanje hrane prilagođene jedinstvenim potrebama. Razmotreni su različiti pristupi, uključujući tradicionalne i nove tehnologije, te novi sastojci, poput biomolekula što potječu iz različitih izvora i mikroorganizama. Ti su pristupi kombinirani na principu tehnologije preprekama, za uspješno postizanje sinergijskog učinka koji poboljšava sigurnost i produljuje vrijeme skladištenja hrane, dok istovremeno zadržava njezina funkcionalna svojstva

The application of isothermal microcalorimetry for studying mixed probiotic cultures

The main aim of this research was to explore the potential of the isothermal microcalorimeter to detect bacteria in mixed cultures; applied to investigate the antagonistic effect of commercial probiotics against pathogens and each other; and also the prebiotic potential of a substrate. Gastric tolerance of commercial probiotic products was also investigated with an improvement on current methods. An initial mixed culture study with Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Escherichia coli in the microcalorimeter showed that the microcalorimeter could detect their growth in mixed cultures; S. aureus was always outcompeted in growth. Antagonistic activity of probiotic strains, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidum or commercial probiotic products against P. aeruginosa, E. coli, S. aureus and the clinically important gut pathogen, Clostridium difficile was demonstrated in the microcalorimeter and was shown to be pH-dependent using neutralized and unmodified cell free culture supernatant (CFS) produced by the probiotic strains. But concentrated CFS of the probiotics also inhibited the pathogenic species in a non pH-dependent manner, likely due to specific antimicrobial substances or bacteriocins. The result also demonstrated that probiotic strains could compete with each other in growth when put together. The prebiotic potential of inulin was demonstrated with the microcalorimeter using faecal slurry and pure probiotic strains. Gastric tolerance assay of commercial probiotic products in porcine gastric fluid, SGF (acidified NaCl solution) and FaSSGF (acidified NaCl solution with biorelevant amounts of bile salt, pepsin and lecithin) mimicking the fed and fasted states showed significant differences between the products and fluids. In conclusion, the research showed that the microcalorimeter is a useful in vitro tool for detecting bacterial growth in mixed cultures and studying functional characteristics of probiotics and prebiotics; overcoming some of the limitations of the conventional methods

Antimicrobiens naturels d'origine bactérienne : contribution à l'étude de leur activité biologique, leur stabilité gastrointestinale et leur toxicité

Au cours des dernières décennies, les antimicrobiens naturels d'origine bactérienne, telles que les bactériocines et la reutérine, ont reçu une attention considérable entant que conservateurs alimentaires ou comme alternatives aux antibiotiques pour les secteurs humain et animal. L'approbation des bactériocines et de la reutérine entant que bio-conservateurs ou assainisseurs par les organismes réglementaires repose non seulement sur les preuves d'efficacité mais également sur des données crédibles de cytotoxicité et de comportement dans l'environnement gastro-intestinal. Bien que les activités antimicrobiennes des bactériocines et de la reutérine soient largement documentées dans la littérature, très peu de données sont disponibles sur leur biodisponibilité dans les matrices biologiques et sur leur toxicité pour les différentes applications. Par conséquent, l'objectif général de cette thèse est d'évaluer, à travers différents modèles in vitro, la stabilité gastro-intestinale, l'activité biologique et la toxicité des bactériocines et de la reutérine en vue de leur utilisation dans différentes applications alimentaire, médicale et vétérinaire. Le premier objectif spécifique était de produire, purifier et évaluer l'activité antimicrobienne des bactériocines et de la reutérine seules et en combinaison contre un large panel de organismes pathogènes et d'altération d'intérêt pour les différents secteurs. Cinq consortia synergiques différents ont été identifiés, dont trois -microcine J25 + l'acide citrique + l'acide lactique, microcine J25 + reutérine + acide citrique, et microcine J25 + reutérine + acide lactique- ont montré une activité significative contre Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport ATCC6962 (indice FIC = 0,5). Deux autres combinaisons- pédiocine PA-1 + acide citrique+ acide lactique, et reutérine + acide citrique + acide lactique- ont montré des effets partiellement synergiques contre Listeria ivanovii HPB28 (indice FIC = 0,75). Le deuxième objectif spécifique était d'évaluer la stabilité gastro-intestinale de la reutérine à l'aide d'un modèl simulant des conditions digestives chez l'humain ainsi que l'activité hémolytique et la cytotoxicité in vitro de la reutérine par dosage au rouge neutre et dosage colorimétrique à la lactate déshydrogénase (LDH) en utilisant la lignée cellulaire Caco-2. La reutérine s'est révélée biologiquement très stable los du transit gastro-intestinal. L'exposition des cellules Caco-2 à différentes concentrations de réutérine n'a montré aucun effet négatif sur la viabilité ni sur l'intégrité des cellules à des concentrations allant jusqu'à 1080 mM. De plus, aucune hémolyse n'a été observée sur les cellules sanguines exposées à des concentrations allant jusqu'à 270 mM de reutérine. En conséquence, cette étude nous a permis de démontrer que la réutérine peut être utilisée de façon très sécuritaire à des concentrations n'excédant pas 270 mM, dans différentes applications. Le troisième objectif était d'évaluer la stabilité gastro-intestinale et l'activité de la microcine J25, de la pédiocine PA-1, de la bactofencine A et de la nisine à l'aide de modèles in vitro. De plus, la cytotoxicité et l'activité hémolytique de ces bactériocine sont été étudiées sur des cellules Caco-2 et des érythrocytes de rat, respectivement. Nos résultats ont montré que la pédiocine PA-1, la bactofencine A et la nisine sont dégradées à différents niveaux lors du transit gastro-intestinal, tandis que la microcine J25 n'est que partiellement dégradée. D'autre part, les études réalisées sur les cellules Caco-2 n'ont montré aucun effet cytotoxique jusqu'à des concentrations de 400 µg/mL. L'étude sur les érythrocytes de rat a montré un effet, hémolytique significatif lorsque la pédiocine PA-1, la bactofencine A et la nisine sont utilisées à des concentrations supérieures à 50 µg/mL, tandis que la microcine J25 n'a montré aucun effet hémolytique Dans le quatrième objectif, la toxicité cutanée de la reutérine, de la microcine J25, de la pédiocine PA-1, de la bactofencine A et de la nisine Z a été étudiée in vitro en utilisant des tests de libération de rouge neutre et de LDH sur des cellules NHEK. Les potentiels de sensibilisation et d'irritation cutanée de ces mêmes bactériocine sont également été déterminés en utilisant respectivement le test h-CLAT et le modèle épidermique humain EpiDerm™. Les essais réalisés sur les cellules NHEK ont montré que l'exposition de ces cellules aux bactériocines et à la reutérine à des concentrations allant à 400 µg/mL et 80 mg/mL respectivement, n'a entrainé aucun effet cytoxique. De plus, la microcine J25 et la reutérine n'ont montré aucune sensibilisation cutanée à des concentrations allant à 100 µg/mL et 40 mg/mL, respectivement, tandis que la pédiocine PA-1, la bactofencine A et la nisine Z ontprovoqué une sensibilisation à des concentrations supérieures à 100 µg/mL. La viabilité des tissus n'a pas été affectée en présence de bactériocines et de reutérine à des concentrations allant jusqu'à 200 µg/mL et 40 mg/mL, respectivement. L'ensemble de ces résultats montre que certaines bactériocines et la reutérine pourraient être incorporées en toute sécurité comme ingrédient antimicrobien dans différentes préparations topiques destinées à des applications humaines et animales Finalement, le dernier chapitre de la thèse a été consacré au développement et à la caractérisation de différents hydrogels à activité antimicrobienne et ayant comme principe actif des bactériocines ou de la réutérine. La reutérine, la pédiocine PA-1 et la microcine J25 ont été incorporées dans des formules d'hydrogel développées à partir de biopolymères à base de chitosan (1,5% , 2,5%) ou de carboxymethle cellulose (CMC 3% , 5%). Les hydrogels développés ont été caractérisés en termes d'aspect général, de viscosité, d'activité antimicrobienne et de stabilité pendant lors de l'entreposage à température ambiante. Les résultats obtenus ont montré que le chitosane à 1,5 % et 2,5 % contenant de la microcine J25 ou de la pédiocine PA-1demontré une activité inhibitrice significative durant toute la période d'entreposage. L'effet inhibiteur de la microcine J25 et de la reutérine dans les hydrogels CMC 3% et 5% est resté inchangé tandis que la pédiocine ajouté aux hydrogels de CMC 3% et 5% a perdu son activité dès la première semaine. En termes de viscosité, l'ajout d'antimicrobiens aux hydrogels n'a pas affecté leur viscosité et toutes les formules sont restées stables pendant les quatre semaines d'entreposage. Les résultats obtenus montrent que les formules développées présentent un fort potentiel d'application dans les secteurs alimentaire, médical et vétérinaire. En conclusion, le travail décrit dans cette thèse a permis de générer des résultats uniques sur le comportement, l'activité biologique, la stabilité et la toxicité de plusieurs composés antimicrobiens d'origine bactérienne incluant différentes bactériocines et la reutérine. Différents modèles in vitro récents et protocoles expérimentaux ont alors été utilisés et adoptés pour notre étude. Les résultats obtenus sont très pertinents et sont indispensable dans les démarches d'homologation de ces composés naturels par les différents organismes règlementaires pour différentes applications que ce soit pour le secteur alimentaire, médicale et/ou vétérinaire. En conclusion, le travail décrit dans cette these a permis de générer des résultats uniques sur le comportement, l'activité biologique, la stabilité et la toxicité de plusieurs composés antimicrobiens d'origine bactérienne incluant différentes bactériocines et la reutérine. Différents modèles in vitro récents et protocoles expérimentaux ont alors été utilisés et adoptés pour notre étude. Les résultats obtenus sont très pertinents et sont indispensable dans les démarches d'homologation de ces composés naturels par les différents organismes règlementaires pour différentes applications que ce soit pour le secteur alimentaire, médicale et/ou vétérinaire.In recent decades, natural antimicrobials produced by bacteria, such as bacteriocins and reuterin, have received considerable attention as food preservatives or as alternatives to antibiotics for the human and animal sectors. Approval of bacteriocins and reuterin as bio-preservatives or sanitizers by regulatory agencies is based not only on evidence of efficacy but also on sufficient data on cytotoxicity and behavior in the gastrointestinal conditions. Although the antimicrobial activities of bacteriocins and reuterin have been widely studied, very little data is available on their behavior in biological matrices and their toxicity for different applications. Therefore, the general objective of this thesis was to evaluate the gastrointestinal stability, the biological activity, and the toxicity of bacteriocins and reuterin using different in vitro models for their intended use in food, medical, and veterinary applications. The first specific objective was to produce, purify and evaluate the antimicrobial activity of bacteriocins and reuterin alone and in combination against a wide range of pathogenic and spoilage organisms of interest to different sectors. Five different synergistic consortia were identified, of which three of them (microcin J25 + citric acid + lactic acid, microcin J25 + reuterin + citric acid, and microcine J25 + reuterin + lactic acid) showed significant activity against Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport ATCC 6962 (FIC index = 0.5). Two other combinations (pediocin PA-1 + citric acid + lactic acid, and reuterin + citric acid + lactic acid) showed partially synergistic effect against Listeria ivanovii HPB28 (FIC index = 0.75). The second specific objective was to evaluate the gastrointestinal stability of reuterin using an in vitro simulated digestion conditions in humans. Furthermore, the hemolytic activity, and in vitro cytotoxicity of reuterin using neutral red assay and lactate dehydrogenase (LDH) release assays were determined on assay on the Caco-2 cell line. Reuterin was observed to be very stable biologically during gastrointestinal transit. Moreover, exposure of Caco-2 cells to different concentrations of reuterin showed no negative effect on cell viability or membrane integrity at concentrations up to 1080 mM. In addition, no hemolysis was observed on erythrocytes exposed to concentrations up to 270 mM of reuterin. As a result, this study demonstrated that reuterin can be safely used at concentrations up to 270 mM, in various applications. The third objective was to assess the gastrointestinal stability and activity of microcin J25, pediocin PA-1, bactofencin A and nisin using in vitro models. In addition, the cytotoxicity and hemolytic activity of these bacteriocins were studied on Caco-2 cells and rat erythrocytes, respectively. According to the results, pediocin PA-1, bactofencin A and nisin were degraded at different levels during gastrointestinal transit, while microcin J25 was only partially degraded. Moreover, bacteriocins did not show cytotoxic effects on Caco-2 cells at concentrations up to 400 µg/mL. Finally, pediocin PA-1, bactofencin A, and nisin at concentrations higher than 50 µg/mL showed hemolytic potential, while microcin J25 did not cause hemolysis. In the fourth objective, the dermal toxicity of reuterin, microcin J25, pediocin PA-1, bactofencin A and nisin Z was studied in vitro using neutral red and LDH release assays on NHEK cells. The skin sensitization and irritation potentials of these bacteriocins and reuterin were also determined using the h-CLAT test and the human epidermal model EpiDerm ™, respectively. The results demonstrated that exposure of NHEK cells to these bacteriocins and reuterin at concentrations up to 400 µg/mL and 80 mg/mL, respectively, did not induce any cytotoxic effect. Inaddition, microcin J25 and reuterin showed no skin sensitization at concentrations up to 100 µg/mL and 40 mg/mL, respectively, while pediocin PA-1, bactofencin A and nisin Z caused sensitization at concentrations higher than 100 µg/mL. Tissue viability was not affected in the presence of bacteriocins and reuterin at concentrations up to 200 µg/mL and 40 mg/mL, respectively. Taken together, these results showed that certain bacteriocins and reuterin could be safely incorporated as an antimicrobial ingredient in various topical preparations intended for human and animal applications. Finally, the last chapter of the thesis was devoted to the development and characterization of different antimicrobial hydrogels based on bacteriocins or reuterin. Reuterin, pediocin PA-1, microcin J25 were incorporated into hydrogel formulations developed from biopolymers; chitosan (1.5%, 2.5%) or carboxymethyl cellulose (CMC, 3, 5%). The developed hydrogels were characterized in terms of general appearance, viscosity, antimicrobial activity, and stability during storage at room temperature. The results showed that the 1.5% and 2.5% chitosan containing microcin J25 or pediocin PA-1 have significant inhibitory activity throughout the storage period. The inhibitory effect of microcin J25 and reuterin in the 3% and 5% CMC hydrogels remained unchanged while the pediocin PA-1 added to the 3% and 5% CMC hydrogels totally lost its activity after one week. In terms of viscosity, the addition of antimicrobials to the hydrogels did not affect their viscosity and all formulations remained stable during the four weeks of storage. The results suggested that the formulas developed have great potential for application as sanitizer in the food, medical and veterinary sectors. In conclusion, this thesis has generated unique results on the gastrointestinal behavior, biological activity, stability, and toxicity of several bacterial drived antimicrobials including different bacteriocins and reuterin. Different in vitro models were adopted for this study. The results obtained are very relevant and are essential for the approval process of these natural compounds by the various regulatory agencies for different applications in food, medical or veterinary sector

Prebiotic-like effects of berry polyphenols on the gut microbiota : akkermansia muciniphila and its molecular adaptation mechanisms to phenolics

Les liens entre le microbiote intestinal, la diète et les désordres métaboliques sont maintenant établis. Les polyphénols des petits fruits affectent les bactéries pathogènes dans le côlon, et stimulent les bactéries symbiotiques, particulièrement Akkermansia muciniphila chez l'homme et dans des modèles murins. Cette bactérie muciphile contribue à l'homéostasie intestinale et induit une réponse immunitaire et métabolique bénéfique chez l'hôte. Cependant, on comprend mal comment les polyphénols peuvent sélectivement l'affecter et l'analyse traditionnelle métagénomique obtenue d'études in vivo n'offre qu'une image partielle des mécanismes impliqués. Cette thèse vise à évaluer, par des approches in vivo et in vitro, comment les polyphénols modifient le microbiote intestinal, la morphologie de l'épithélium du colon, la niche écologique d'Akkermansia, et par extension affectent le métabolisme de souris soumises à une diète obésogène. Une attention particulière a été portée à l'effet de ces composés sur la croissance d'A. muciniphila et les mécanismes moléculaires qu'ils induisent chez la bactérie. Dans un premier chapitre, l'effet des poudres de fruits canneberge et de bleuets riches en polyphénols et leurs fractions fibreuses a été étudié chez des souris soumises à une diète obésogène (HFHS) pendant 8 semaines afin d'évaluer lesquels des polyphénols ou des fibres sont responsables de l'effet prébiotique observé. Cette étude a démontré que ce sont surtout les polyphénols contenus dans les poudres de canneberges et de bleuets entiers qui sont responsables de l'action prébiotique, notamment en stimulant A. muciniphila. En effet, la poudre de canneberge comme celle de bleuets inhibent particulièrement les pathogènes induits par la diète HFHS. En outre, l'analyse de redondance fonctionnelle a révélé que la consommation de poudre de canneberge riche en polyphénols permettait au microbiote de souris obèses de retrouver les fonctions de celui de souris maigres. Ces souris présentaient un poids et une efficacité énergétique inférieurs à celui des souris non traitées. De plus, d'autres bactéries symbiotiques étaient favorisées par les poudres de fruits entiers : Muribaculaceae, Dubosiella newyorkensis et Eggerthellaceae. Fait intéressant, les fibres de canneberge inhibaient également les pathogènes, favorisaient des bactéries dégradant les polyphénols et réduisaient les triglycérides hépatiques chez les souris obèses. Ces résultats mettent en évidence le potentiel des polyphénols, même lorsqu'ils sont associés aux fibres, à atténuer les désordres métaboliques. Le deuxième chapitre s'intéresse à identifier les catégories de polyphénols impliquées dans l'accroissement du nombre de bactéries symbiotiques et particulièrement d'A. muciniphila. Les souris soumises à une diète obésogène ont été traitées avec un extrait de bleuet ou trois de leurs fractions polyphénoliques : F1, riches en anthocyanes et en acides phénoliques; F2, riche en oligomères de proanthocyanidines (PACs) ainsi qu'en flavonols; et F3 riches en polymères de PACs. Ces sous-fractions ont été administrées aux souris dans les mêmes concentrations que celles retrouvées dans l'extrait entier. Globalement, les fractions polyphénoliques ont restauré l'épaisseur de la couche de mucus, mais particulièrement les fractions riches en PACs ont significativement stimulé A. muciniphila, tout en améliorant la proportion de cellules caliciformes et le métabolisme du glucose chez les souris obèses. Enfin le dernier chapitre s'intéresse aux mécanismes par lesquels les polyphénols favorisent la croissance de A. muciniphila dans l'intestin. Des cultures d'A. muciniphila ont donc été effectuées dans des milieux enrichis en polyphénols afin d'évaluer les gènes impliqués dans le métabolisme cellulaire et dans la résistance aux antimicrobiens; les pompes à efflux non spécifiques, les polysaccharides capsulaires (CPS), les exopolysaccharides (EPS), les transporteurs de type ABC-2 et de resistance-nodulation-cell division (RND) ont joué un rôle crucial dans la résistance et l'adaptation de la bactérie aux polyphénols. La croissance d'A. muciniphila n'a pas été inhibée par l'extrait de canneberge entier ni par ses fractions polyphénoliques, mais elle a été stimulée par l'urolithine-A. Cette expérience in vitro a démontré que les polymères de PACs favorisent davantage les mécanismes d'adaptation antimicrobienne impliqués dans la protection des parois cellulaires et la régulation énergétique chez Akkermansia. Parallèlement à l'urolithine-A, les polymères de PACs ont induit la production du CPS et du EPS chez A. muciniphila. Ces CPS/EPS pourraient contribuer aux rôles immunomodulateur et anti-obésité d'A. muciniphila et par conséquent constituer des postbiotiques prometteurs. Cette thèse démontre la sélectivité des polyphénols, principalement des PACs, dans l'inhibition des pathogènes associés à l'obésité et dévoile les mécanismes moléculaires qui sous-tendent leurs effets prébiotiques sur A. muciniphila.The link between gut microbiota, diet and metabolic diseases is now established. Polyphenols from berries and other dietary sources have been shown to inhibit opportunistic pathogens and stimulate symbiotic bacteria, particularly Akkermansia muciniphila in humans and animals. A. muciniphila is a mucus-living bacterium shown to contribute to the intestinal homeostasis and to drive beneficial immune and metabolic response in the host. However, it is not yet known how polyphenols can selectively affect A. muciniphila from in vivo studies, since regular metagenomic analysis of the gut microbiota only provide a partial picture of the mechanisms involved. This thesis aims to determine, through in vivo and in vitro approaches, the prebiotic effect of polyphenols and how they affect the physiology and intestinal morphology and the ecological niche of Akkermansia in obesogenic diet-fed mice. Particularly, it focusses on the molecular capacity of A. muciniphila to induce defence mechanisms and adapt to distinct polyphenolic fractions. In the first chapter, in order to assess which constituent of berries was responsible for the prebiotic action, we compared the effect of the dietary supplementation with polyphenol-rich cranberry and blueberry fruit powders to their respective fibrous fractions (cell wall polysaccharides) of high-fat high-sucrose (HFHS) fed mice for 8-weeks. We demonstrated that the polyphenols from cranberry and blueberry fruit powders are mainly responsible for the selective prebiotic effects on A. muciniphila rather than their fibre-rich fractions. Both cranberry and blueberry whole fruit powders inhibited HFHS-induced pathobionts associated with obesity. A functional redundancy analysis revealed that the gut microbiota functions of obese mice were remarkably changed by polyphenol-rich whole cranberry powder, restoring it back to that observed in lean mice; that is, they presented lower body weight and energy efficiency as compared to untreated mice. Furthermore, other symbiotic bacteria were influenced by polyphenol-rich berry powders, notably Muribaculaceae, Dubosiella newyorkensis, and the polyphenol-degrading Eggerthellaceae; these mice presented a lower body weight and energy efficiency as compared to untreated mice. Surprisingly, cranberry fibrous fraction also inhibited pathobionts and promoted polyphenol-degrading families and reduced the hepatic triglycerides level in HFHS-fed mice. Altogether, these findings highlight the role of polyphenols associated with fibres, in attenuating obesity. The second chapter aimed to identity which polyphenolic category was mostly responsible for the prebiotic effect and the abundance of A. muciniphila. HFHS-fed mice were treated with a whole blueberry extract and with the three constitutive polyphenolic fractions: F1, rich in anthocyanins and phenolic acids, F2, rich in oligomeric proanthocyanidins (PACs) and flavonols, and F3 rich polymeric PACs. These sub-fractions were administered to mice at the same concentration as encountered in the whole extract. All in all, the polyphenolic fractions restored the mucus thickness, but the PAC-rich fractions besides stimulating A. muciniphila, increased the proportion of goblet cells and improved the glucose homeostasis in obese mice. Finally, the third chapter looks at the mechanisms by which polyphenols promote the growth of A. muciniphila. Growing assays of A. muciniphila were carried out in polyphenols enriched media in order to assess the expression of genes involved in cell metabolism and antimicrobial resistance. Genes coding for multidrug efflux pumps, capsular polysaccharide (CPS) family, exopolysaccharides (EPS), and ABC-2 type and resistance-nodulation-cell division (RND) transporters were shown to play a crucial role in allowing the bacteria to withstand the different cranberry polyphenolic fractions and adapt to the stress they caused. A. muciniphila growth was not inhibited by the whole cranberry extract neither by its polyphenolic fractions, but enhanced by the phenolic metabolite urolithin-A. Moreover, we showed that the polymeric PACs were triggering most intensively the antimicrobial adaptation mechanisms involved in cell-wall protection and energy management in A. muciniphila. Both of these fractions up-regulated CPS and EPS in A. muciniphila. CPS/EPS secretion in presence of polyphenols might represent promising post-biotic products, possibly involved in the immune modulatory and anti-obesity potential by A. muciniphila. Altogether, this thesis demonstrates for one of the first times that berry polyphenols and their PAC-rich fractions are responsible for the prebiotic-like effect on A. muciniphila, and the inhibition of specific pathobionts associated with obesity and unveils the molecular mechanisms underpinning the resilience of this bacterium to phenolics