Κλωνοποίηση και μοριακός χαρακτηρισμός της εκκρινόμενης νεξίνης (nexin) LdPIΒPnex με υποτομέα πρόσδεσης σε φωσφοϊνοσιτίδια, από το πρωτόζωο Leishmania donovani»

Τα παράσιτα του γένους Leishmania ανήκουν στα διμορφικά πρωτόζωα της οικογένειας των Trypanosomatidae (τάξη Kinetoplastidae) και απαντώνται σε δύο μορφές, την εξωκυττάρια προμαστιγωτή που βρίσκεται στο έντερο του αρθρόποδου ξενιστή (φλεβοτόμοι) και την ενδοκυττάρια αμαστιγωτή, μέσα σε τροποποιημένα φαγολυσοσώματα των φαγοκυττάρων του θηλαστικού ξενιστή. Όπως και τα υπόλοιπα ενδοκυττάρια παθογόνα, τα είδη Leishmania έχουν αναπτύξει στρατηγικές διαφυγής από τους αμυντικούς μηχανισμούς και επιβίωσης μέσα στα φαγοκύτταρα των θηλαστικών. Στις στρατηγικές αυτές περιλαμβάνεται η έκκριση από το παράσιτο μολυσματικών παραγόντων μέσα στο κυτοσόλιο των κυττάρων ξενιστών. Πρωτεομική ανάλυση των εκκρινόμενων μορίων στο θρεπτικό μέσο καλλιεργούμενων προμαστιγωτών παρασίτων από το είδος Leishmania donovani (L. donovani) (αιτιολογικός παράγοντας της θανατηφόρας νόσου της σπλαχνικής Λεϊσμανίωσης) ανέδειξε αρκετές πρωτεΐνες, οι οποίες εκκρίνονται στο εξωκυττάριο μικροπεριβάλλον πιθανόν μέσω εξωσωμάτων .Μια από τις εκκρινόμενες πρωτεΐνες (417 a.a. , 46,6 KDa) που ταυτοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη και κωδικοποιείται από το γονίδιο LdBPK_352470.1, υψηλά συντηρημένο στα είδη Leishmania, περιέχει μια PX δομική αλληλουχία πρόσδεσης σε φωσφοϊνοσιτίδια και δομικά χαρακτηριστικά που την κατατάσσουν στην οικογένεια πρωτεϊνών Νεξίνες διαλογής (Sorting Νexins). Οι τελευταίες αποτελούν μια ομάδα κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών, που προσδένονται στις μεμβράνες είτε μέσω της σύνδεσης τους με λιπίδια, είτε μέσω αλληλεπιδράσεων με μεμβρανικά πρωτεϊνικά συμπλέγματα.  Έχει δειχθεί, ότι μέλη της οικογένειας των Νεξινών συμμετέχουν σε ένα μεγάλο εύρος μονοπατιών διαλογής πρωτεϊνών και στους ενδοκυττάριους μηχανισμούς μετακίνησης μακρομορίων . Ονομάσαμε το προϊόν του γονιδίου LdBPK_352470.1, LdPIBPnex, από το ακρωνύμιο Leishmania donovani Phosphoinositide Binding Protein nexin. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζονται αποτελέσματα από : α) την κλωνοποίηση του γονιδίου LdBPK_352470.1 σε διαφορετικούς πλασμιδιακούς φορείς, β) την έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης LdPIBPnex σε βακτήρια και κύτταρα θηλαστικών, γ) τον εντοπισμό της ενδογενούς LdPIBPnex σε κύτταρα Leishmania και σε μολυσμένα μακροφάγα, χρησιμοποιώντας το ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα anti-LdPIBPnex που παράχθηκε στο εργαστήριο, δ) τον εμπλουτισμό της LdPIBPnex σε διαλυτά πρωτεϊνικά κλάσματα από αξενικά (καλλιεργημένα) προμαστιγωτά παράσιτα L. donovani και ε) την έκκριση της LdPIBPnex από καλλιέργεια προμαστιγωτών, στο εξωκυττάριο θρεπτικό μέσο. Από τις τρεις προσπάθειες κλωνοποίησης του γονιδίου ldpibpnex στα πλασμίδια pEGFP-N3, pGEX4T-1 και pLexsy-mCherry, επιτυχείς ήταν εκείνες στα δύο πρώτα. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pEGFP-ldpibpnex χρησιμοποιήθηκε για τον υποκυτταρικό εντοπισμό της LdPIBPnex σε επιθηλιακά κύτταρα θηλαστικών HeLa, με μικροσκοπία φθορισμού, όπου παρατηρώντας τον πράσινο φθορισμό της πρωτεΐνης GFP εντοπίσαμε την υβριδική πρωτεΐνη LdPIBPnex-GFP στo κυτταρόπλασμα, στη πλασματική μεμβράνη του επιμολυσμένου κυττάρου HeLa σε συνεντοπισμό με την F-ακτίνη του κυτταρικού φλοιού καθώς και σε περιοχή που θα αναμενόταν το δίκτυο Golgi, κοντά στον πυρήνα του επιθηλιακού κυττάρου. Όσον αφορά το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pGEX-ldpibpnex, θα χρησιμοποιηθεί σε μελλοντική μελέτη, για την ανάλυση της πρόσδεσης της LdPIBPnex σε φωσφοϊνοσιτίδια, καθώς και σε πρωτόκολλα ανοσοκατακρήμνισης προκειμένου να εντοπιστούν πιθανοί μοριακοί συνεργάτες της, στο παράσιτο και στα μακροφάγα. Παράλληλα με τον εντοπισμό της πρωτεΐνης στα κύτταρα HeLa, πραγματοποιήθηκαν και πειράματα υποκυτταρικού εντοπισμού της LdPIBPnex τόσο σε παράσιτα L. donovani, όσο και σε μολυσμένα, με το παράσιτο, μακροφάγα θηλαστικών. Χρησιμοποιώντας ειδικά πολυκλωνικά αντισώματα έναντι της LdPIBPnex με μικροσκοπία φθορισμού, εντοπίσαμε στην προμαστιγωτή μορφή του παρασίτου L. donovani επιτόπους της LdPIBPnex σε δομές που προσομοιάζουν μεμβρανικά κυστίδια, στο κυτταρικό σώμα του παρασίτου, στη θήκη του μαστιγίου καθώς και κατά μήκος του μαστιγίου. Τέλος σε μακροφάγα κύτταρα μολυσμένα με προμαστιγωτές μορφές L. donovani εντοπίσαμε με ανοσοφθορισμό επιτόπους της LdPIBPnex κυρίως στην επιφανειακή μεμβράνη των μολυσμένων κυττάρων, σε σημεία φαγοκυτταρικών φαινομένων παρασίτων. Μετά τα πειράματα εντοπισμού, επιβεβαιώσαμε την έκφραση της LdPIBPnex σε προμαστιγωτά παράσιτα L. donovani LG13 WT με πειράματα ανοσοστυπώματος Western και μελετήσαμε τα επίπεδα έκφρασης της, κατά τον κυτταρικό κύκλο αξενικής καλλιέργεας προμαστιγωτών. Παρατηρήσαμε ότι η LdPIBPnex εκφράζεται στη λογαριθμική και στατική φάση ανάπτυξης, με μία πιο έντονη έκφραση στην αρχή της λογαριθμικής φάσης (lag phase). Στη συνέχεια, θελήσαμε να επιβεβαιώσουμε την έκκριση της πρωτεΐνης LdPIBPnex σε αξενικές καλλιέργειες προμαστιγωτών μορφών στους 250C και στους 370C. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν την έκκριση της πρωτεΐνης στους 250C ενώ τα πειράματα στους 370C θα πρέπει να επαναληφθούν στο μέλλον. Τέλος, με κλασματοποίηση ολικού εκχυλίσματος προμαστιγωτών κυττάρων L. donovani με χρήση του απορρυπαντικού διγιτονίνη και περαιτέρω ανάλυση των κλασμάτων με SDS-PAGE και Western Blot ανιχνεύσαμε την LdPIBPnex στα κλάσματα που είναι εμπλουτισμένα σε διαλυτές πρωτεΐνες του παρασίτου.Leishmania are dimorphic protozoan parasites from the Trypanosomatidae family (kinetoplastid class) living as extracellular flagellated forms (promastigotes) in their sandfly vector gut and as intracellular aflagellated forms (amastigotes) inside modified phagolysomes of the mammalian host phagocytes. As other intracellular pathogens, Leishmania species have evolved strategies supporting invasion and persistence within the mammalian phagocytes. In some cases the underlying mechanisms involve export of virulence factors into the host cell cytosol. Proteomic analysis of the secretome of Leishmania donovani/L. donovani (causative agent of the fatal disease visceral Leishmaniasis/VL) revealed several proteins secreted in the extracellular medium of cultured promastigotes, possibly through an exosome-like route . One of these was the product of the LdBPK_352470.1 gene, highly conserved in Leishmania species, which encodes for a secreted protein of 417 a.a. (predicted MW 46,6 kDa) with a PX phosphoinositide binding domain and structural features classifying it in the Sorting Νexin protein family, a large group of cytoplasmic proteins that bind to membranes either through their lipid-binding PX domain  or through protein–protein interactions  with membrane-associated protein complexes. Members of the Νexin family are shown to participate in an increasing array of endosomal sorting and intracellular membrane traffic events . We named the LdBPK_352470.1 gene product LdPIBPnex, for Leishmania donovani Phosphoinositide Binding Protein nexin. Herein we present results from a) cloning of the LDBPK_352470.1 gene in different expression vectors b) expression of the recombinant LdPIBPnex protein in bacteria and mammalian cells, c) localization of the endogenous LdPIBPnex in Leishmania cells and infected macrophages using an anti-LdPIBPnex specific pAb that we generated, d) enrichment of LdPIBPnex in soluble protein fractions of L. donovani axenic (cultured) promastigotes and e) secretion in the promastigote culture extracellular medium. Cloning of the ldpibpnex gene into the pEGFP-N3, pGEX4T-1 and pLexsy-mCherry plasmids, was successful only in the first two cases. The recombinant pEGFP-ldpibpnex plasmid, was used in order to track the sub-cellular localization of LdPIBPnex-GFP in the mammallian epithelial HeLa cells, with fluorescence microscopy, by observing the green fluorescence of the EGFP protein. We localized LdPIBPnex-EGFP in the cytosol, and on the plasma membrane of the transfected HeLa cell where it colocalized with the cortical F-actin. It also showed a polarized perinuclear localization similar to the Golgi apparatus localization. Regarding the recombinant pGEX-ldpibpnex plasmid, it will be used in future studies to express the GST-LdPIBPnex recombinant protein in order to analyze biochemichaly its binding to Phosphoinositides and to identify LdPIBPnex partners in Leishmania and macrophage cell extracts by pull down assays. In parallel we localized LdPIBPnex epitopes in macrophages infected with L. donovani promastigotes at macrophage surface membrane site’s of phagocytic events. Regarding the localization of the protein in L. donovani promastigote cells, we detected LdPIBPnex in vesicle-like structures in the cell-body and the flagellum as well as near the flagellar pocket. The expression of LdPIBPnex in promastigote parasites was also confirmed biochemically using Western blot, while analysis of the expression levels of LdPIBPnex in axenic promastigote cultures, during the parasite’s growth stages showed that the protein is expressed as soluble both at the logarithmic and stationary phases of the promastigote growth in culture, with a higher expression detected at the lag phase. Next, we confirmed the secretion of LdPIBPnex in L. donovani promastigote cultures at 250C while the experiments for analysis of secretion at 370C will have to be repeated. Lastly, L. donovani promastigotes at the stationary phase of growth were fractionated by resuspension in buffers with containing gradually increasing concentration of the detergent digitonin and further analysis with SDS-PAGE and Western Blot. Using the anti-LdPIBPnex specific polyclonal Ab, we detected LdPIBPnex in the fractions, enriched in soluble parasitic proteins