A Toolbox of Genetically Encoded FRET-Based Biosensors for Rapid l-Lysine Analysis

Background: The fast development of microbial production strains for basic and fine chemicals is increasingly carried out in small scale cultivation systems to allow for higher throughput. Such parallelized systems create a need for new rapid online detection systems to quantify the respective target compound. In this regard, biosensors, especially genetically encoded Förster resonance energy transfer (FRET)-based biosensors, offer tremendous opportunities. As a proof-of-concept, we have created a toolbox of FRET-based biosensors for the ratiometric determination of l-lysine in fermentation broth. Methods: The sensor toolbox was constructed based on a sensor that consists of an optimized central lysine-/arginine-/ornithine-binding protein (LAO-BP) flanked by two fluorescent proteins (enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), Citrine). Further sensor variants with altered affinity and sensitivity were obtained by circular permutation of the binding protein as well as the introduction of flexible and rigid linkers between the fluorescent proteins and the LAO-BP, respectively. Results: The sensor prototype was applied to monitor the extracellular l-lysine concentration of the l-lysine producing Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) strain DM1933 in a BioLector® microscale cultivation device. The results matched well with data obtained by HPLC analysis and the Ninhydrin assay, demonstrating the high potential of FRET-based biosensors for high-throughput microbial bioprocess optimization

Simulation and Analysis of Protein-Fluorophore Systems for Comparison with Fluorescence Spectroscopy Data

Proteine sind die Grundbausteine des Lebens auf molekularer Ebene und wichtig für viele biologische Funktionen wie den Transport von Molekülen, Zellbewegungen oder die Katalyse von chemischen Reaktionen. So transportiert das Protein Hämoglobin beispielsweise den Sauerstoff im menschlichen Blut. Störungen der Proteinfunktionen können schwere degenerative Krankheiten wie zum Beispiel die Parkinson-, Huntington- oder Alzheimer-Krankheit verursachen. Das Verständnis von Proteinfunktionen, ihrer Struktur und Dynamik ist daher ein wichtiges Forschungsgebiet in Biologie, Pharmakologie und Medizin. Da Proteine aufgrund ihrer geringen Größe nicht mit Lichtmikroskopie beobachtet werden können, verwendet man stattdessen indirekte Methoden. Eine dieser Methoden macht sich den Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zunutze, um damit Proteindynamik und andere molekulare Prozesse in vitro und in vivo zu untersuchen. Die Methode wird außerdem auch in Biosensoren zur Messung der Konzentrationen von kleinen Biomolekülen wie zum Beispiel Glukose eingesetzt. Die dabei verwendeten Systeme aus Proteinen und Fluorophoren unterliegen physikalischen Prozessen wie Molekulardynamik und Photophysik. Da man diese Mechanismen nicht direkt beobachten kann, ist die Funktionsweise vieler Systeme noch nicht vollständig verstanden. Molekulare Simulationen können diese experimentellen Messungen ergänzen. Sie ermöglichen einen Einblick in molekulare Systeme und ihre Funktion auf atomarer Ebene. Die bisherigen Modellierungsmethoden für Protein-Fluorophor-Systeme sind größtenteils Näherungen, die nur für spezielle Anwendungen verwendbar sind oder zu rechenaufwändig um alle relevanten Bewegungen zu modellieren. Diese Arbeit stellt eine neue Methode für die Simulation der Dynamik in Protein-Fluorophor-Systemen vor. Sie basiert auf recheneffizienten vereinfachten Molekulardynamiksimulationen. Mit nur wenigen Parametern bietet die Methode eine realistische Beschreibung des Systems, die quantitativ mit Experimenten übereinstimmt. Sie ermöglicht den direkten Vergleich von Simulationen mit experimentellen Daten und somit eine bessere Planung und Interpretation von Experimenten. Gleichzeitig liefert sie Informationen über die zugrundeliegende Dynamik der Systeme. Diese Arbeit präsentiert ein systematisches Simulationsprotokoll für die Modellierung von Protein-Fluorophor-Systemen in silico, welches für die Erforschung von vielen biologisch relevanten Anwendungen verwendet werden kann. Sie zeigt wie Experimente und Simulationen einander ergänzen, um neue Einblicke in Dynamik und Funktion von Biomolekülen zu erhalten