Struktur-Funktion-Wechselwirkungen in lateral eingeschränkten Zellen

Die Zellform ist wichtig für die Ausübung der Zellfunktion und spielt darüberhinaus eine essenzielle Rolle bei der Entwicklung eines Zellhaufens zu einem mehrzelligen Organismus. Dabei wird die Zellform neben biochemischen auch von biophysikalischen Prozessen beeinflusst: Zellkräfte sind ebenso beteiligt wie räumliche Einschränkung. Der Umfang der Wechselwirkung zwischen Umgebung, Zellform und Zellfunktion ist jedoch im Detail oft unverstanden. Ziel dieser Arbeit war daher, eine umfassende Charakterisierung von Zellen in räumlicher Einschränkung durchzuführen, um Aussagen zur Beeinflussung von Zellmorphologie und der Kraftentwicklung zu gewinnen. In dieser Arbeit wurde die Reaktion humaner Primärzellen (HUVECs) auf laterale Einschränkung untersucht. Die Zellen wurden dafür sowohl auf Glas- als auch auf Hydrogel-Substraten kultiviert, die mittels Mikrokontaktdruck von Fibronektin mit Streifenmustern im Breitenbereich von 5μm bis 80μm strukturiert worden waren. Die Zellen wurden nach der Phase der initialen Adhäsion (> 1 h) hinsichtlich ihrer allgemeinen Morphologie, des Erscheinungsbildes ihres Aktinskeletts und ihres Zellzugkraftverhaltens quantitativ beschrieben. Zusätzlich erfolgten Lebendzellmessungen, um die Dynamik des Aktinskeletts und der Zellzugkräfte zu charakterisieren. Die laterale Einschränkung führte zur strukturellen und funktionellen Adaption der Zellen. Da die Zelllänge nur geringfügig von der Streifenbreite abhing, kam es durch die seitliche Einschränkung zu einer Flächenabnahme bei gleichzeitiger Erhöhung des Zellseitenverhältnisses, wovon auch der Zellkern betroffen war. Die Ausrichtung der Aktinfasern korrelierte stark mit der Zellelongation und Zellen auf schmalen Streifen zeigten ein geringer vernetztes Aktinskelett. Messungen der Aktindynamik ergaben einen einwärts gerichteten Transport von Stressfasern. Weiterhin wurde eine Abnahme der Zugkräfte mit zunehmender Einschränkung gemessen, während gleichzeitig eine Polarisierung der Zugkräfte stattfand. Das beobachtete Verhalten der struktur- und funktionsbezogenen Zellparameter konnte gut durch die laterale Einschränkung erklärt werden, sodass die vorliegende Arbeit zu einem besseren Verständnis der Zellanpassung an räumliche Einschränkung beitragen konnte.Proper cell shape is a precondition for the proper performance of specialized cells and changes of cell shape are paramount for the development from a cell cluster to an adult organism. Cell shape can be regulated biochemically and also biophysically, e. g., by involvement of cellular force generation and spatial confinement. However, the understanding of the interaction between exterior space, cellular form, and function is incomplete. Therefore, the aim of this thesis was to thoroughly characterize cells in spatial confinement in order to better understand how cell morphology and force generation can be linked. During the course of this work, the adaptation of human primary cells (HUVECs) to lateral constraints was investigated. Cells were seeded on both glass and hydrogel substrates which had been micropatterned with fibronectin by microcontact printing. The structures were composed of stripes with varying width (5–80 μm). After initial adhesion had taken place (> 1 h), cell morphology, actin cytoskeleton architecture, and cell traction forces were quantified. In addition, measurements were performed on live cells in order to better understand the dynamics of the actin cytoskeleton and the cell traction forces. Laterally confined cells showed both structural and functional changes. Because cell length was only weakly dependent on stripe width, cells in strong lateral confinement were highly elongated and had decreased spread areas, which also affected the nucleus. The orientation of actin fibers was strongly linked to cell elongation. In cells on narrow stripes, a reduced actin cytoskeleton was observed, i.e., with a lower degree of interconnectivity. Time resolved analysis revealed an inward transport of actin fibers. Furthermore, cell force generation was shown to be impaired on narrow stripes, most likely due to decreased cell spread area. At the same time, force polarization strongly increased in cells in strong lateral confinement. This study demonstrated how various cellular parameters, both linked to cell structure and function, are influenced by lateral confinement and by each other, thereby contributing to a better understanding of cell adaptation to spatial constraint

Strukturelle Analyse der Reninfreisetzung in juxtaglomerulären Epitheloidzellen von Cx40⁺⁺- und Cx40⁻⁻-Mäusen

Für das Renin-Angiotensin-Aldosteron System und damit für die Blutdruckregulie-rung im Organismus spielt Renin eine entscheidende Rolle. In den juxtaglomerulären Epitheloidzellen (JG-Zellen) der Niere wird Renin in elektronenmikroskopisch dichten Vesikeln gespeichert und über einen regulierten Freisetzungsmechanismus ausge-schüttet, wobei der intrazelluläre cAMP-Signalweg die Reninsekretion stimuliert und eine Erhöhung der extra- und intrazellulären Ca²⁺-Konzentration diese hemmt. Der genaue Exozytosemechanismus von Renin ist noch nicht vollständig geklärt. Neuere Studien weisen jedoch darauf hin, dass in JG-Zellen die Compound-Exozytose, bei der zu großen Speichernetzwerken fusionierte Vesikel die Sekretion erhöhen, für die Maximierung der Reninsekretionsrate (RSR) relevant sein könnte. Die JG-Zellen der Niere sind sowohl untereinander als auch mit benachbarten Zellen durch Gap Junctions verbunden, wobei JG-Zellen im adulten Organismus über-wiegend Connexin 40 (Cx40) exprimieren. Cx40-Knockout-Mäuse (Cx40⁻/⁻) weisen unter anderem einen Anstieg der Plasmareninkonzentration und daher Bluthoch-druck auf. Bei diesen Mäusen sind die JG-Zellen nicht mehr ausschließlich in der Media afferenter Arteriolen lokalisiert und der sogenannte Barorezeptorreflex, der durch einen Anstieg des intrarenalen Blutdrucks zur Abnahme der Reninexpression und -sekretion führt, ist nachweislich gestört. In Versuchen von Wagner et al. mit isoliert perfundierten Nieren (IPN) wurde festgestellt, dass die RSR bei Cx40-/--Mäusen unter Stimulation mit Isoproterenol (Iso), das zur Aktivierung des cAMP-Signalwegs führt, regulär ansteigt. Unter Stimulation mit Ethylenglycol-bis-(aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-tetraessigsäure (EGTA), welches die extrazelluläre Ca²⁺-Konzentration absenkt, findet eine Zunahme der RSR im Gegensatz zum Wildtyp jedoch nur in geringem Maße statt [1]. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, in welchem Ausmaß sich die Abwesenheit von Cx40 ultrastrukturell in der zwei- und dreidimensionalen Ebene auf die Reninsekretion und auf die Morphologie von Reninspeichervesikeln (RV) auswirkt. Im Zuge dieser Dissertation wurden dazu in IPN-Versuchen präparierte, unstimulierte und stimulierte Wildtyp- und Cx40-/--Mäuse ultrastrukturell analysiert. Zur pharma-kologischen Stimulation der Reninsekretion wurde 10 nM Iso bzw. 3,1 mM EGTA verwendet. Nach der Fixierung des Nierengewebes wurden 70 nm dünne Schnitte von JG-Zellen erstellt, in transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen (TEM-Aufnahmen) betrachtet und mittels eines Softwareprogrammes dreidimensional rekonstruiert. Im ersten Teil der Arbeit wurden JG-Zellausschnitte von Wildtyp-Mäusen betrachtet. Während die 16-minütige Stimulation mit 10 nM Iso im Vergleich zum unstimulierten Wildtyp die RV-Morphologie nur wenig beeinflusste, führte die 16-minütige Stimu-lation des Wildtyps mit 3,1 mM EGTA zur verstärkt irregulären Morphologie der RV, zur Verminderung und Inhomogenität der Elektronendichte mancher RV, zur Abnahme von der durchschnittlichen Vesikelvolumina und -oberflächen und zur Zunahme des Vernetzungsgrades der RV. Die Zunahme der RSR war bei beiden Stimulationsarten nahezu identisch. Diese Ergebnisse bestätigen Beobachtungen aus früheren Studien. Die verminderte Elektronendichte mancher RV im mit EGTA stimulierten Wildtyp könnte auf eine unvollständige Entleerung dieser RV und damit auf einen in JG-Zellen stattfindenden Kiss and Run-Mechanismus hindeuten, durch den Speichervesikel über kleine Fusionsporen mit der Zellmembran nur teilweise entleert werden. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurden JG-Zellausschnitte von Cx40-/--Mäusen betrachtet und mit dem Wildtyp verglichen. Der unstimulierte Cx40-/- wies neben einer leicht erhöhten RSR im Vergleich zum Wildtyp fast ausschließlich klassisch runde RV auf. Die RV-Morphologie des unstimulierten Cx40-/- bestätigt frühere Beschreibungen, dass die RV sich im Cx40-/- vermehrt klassisch rund präsentieren. Dies könnte darauf hindeuten, dass JG-Zellen durch extrazelluläre Signale zur Bildung von Speichernetzwerken angeregt werden und dieser Mechanismus bei Cx40-/--Mäusen beeinträchtigt ist. Nach der 16-minütigen Stimulation des Cx40-/- mit Iso wurde in den betrachteten Zellausschnitten im Vergleich zum mit Iso stimulierten Wildtyp eine stärker variierende Morphologie der RV festgestellt, wobei die Vernetzungsgrade der RV sich ähnelten. Die 16-minütige Stimulation des Cx40-/- mit EGTA führte im Vergleich zum mit EGTA stimulierten Wildtyp nicht zur Inhomogenität der RV-Elektronendichte, zu weniger ausgeprägten morphologischen Veränderungen und zur geringeren Abnahme der durchschnittlichen Vesikelvolumina und Vesikel-oberflächen. Während die RSR beim mit Iso stimulierten Knockout wie beim Wildtyp deutlich zunahm, fehlte dieser Anstieg unter dem Einfluss von EGTA beim Cx40-/- fast vollständig. Die Zellmorphologie beim mit EGTA stimulierten Cx40-/- steht in Einklang mit dem ausbleibenden Anstieg der RSR, der bereits von Wagner et al. beobachtet wurde, und mit deren Annahme, dass das Fehlen von Cx40 die Übertragung von Ca²⁺-Signalen beeinflusst [1]. Im dritten Teil der Arbeit wurden noch einmal gezielt Kontakte der RV mit der Zellmembran betrachtet. Mit Ausnahme des mit Iso stimulierten Cx40-/- wurden, unabhängig von der RSR, pro Zellausschnitt durchschnittlich zwei bis drei Kontakte von RV mit der Zellmembran beobachtet. Lediglich bei zwei der mit Iso stimulierten Cx40-/--Zellausschnitte wurden überdurchschnittlich viele Zellmembran-Kontakte festgestellt. Laut früheren Studien wird die Reninsekretion unter Stimulation mit Iso durch den direkten Kontakt zu Endothelzellen, der bei Cx40-/- aufgrund der veränderten Lokalisation der JG-Zellen nicht immer vorliegt, gedrosselt [2]. Zudem fördert die Stimulation des cAMP-Signalwegs in JG-Zellen die Größenzunahme sogenannter Readily Realeasable Pools, in denen sich bereits aktivierte Speicher-vesikel befinden, die rasch sezerniert werden können [3]. Beides könnte die hohe Anzahl an Zellmembran-Kontakten erklären, die im mit Iso stimulierten Cx40-/- fest-gestellt wurde. Der Sekretionsmechanismus von RV konnte in dieser Arbeit nicht abschließend geklärt werden. Die ultrastrukturellen Beobachtungen schlossen weder die klassisch regulierte Exozytose noch die Compound-Exozytose oder den Kiss and Run-Mechanismus als mögliche relevante Mechanismen aus. Denkbar wäre, dass die „klassische“ Exozytose die basale RSR aufrechterhält, während die Compound-Exozytose die Maximierung der RSR über ein gewisses Zeitintervall hinweg fördert. Dabei könnten unter Stimulation des cAMP-Signalweges bevorzugt die Ver-größerung der Readily Realeasable Pools und unter Hemmung der extra- und intrazellulären Ca²⁺-Konzentration der Kiss and Run-Mechanismus zum kontrollierten Anstieg der RSR beitragen. Folglich wäre davon auszugehen, dass die RV grundsätzlich zu allen aufgeführten Exozytose-Mechanismen befähigt sind

Vergleichende Untersuchung der regulierten Genexpression von integrierter und episomaler HIV-1 LTR

Erkenntnisse zur funktionalen Zellkernarchitektur wurden bisher überwiegend an fixierten Zellen durch in situ Methoden erlangt. Durch Etablierung eines Lebendzell-Systems sollte überprüft werden, ob es möglich ist, ein einzelnes Transgen auf DNA-Ebene zu visualisieren und es bei seiner transkriptionellen Aktivierung zu beobachten. Das hier entwickelte „Gene Positioning System“ (GePS) nutzt das Lac-Operator/Lac-Repressor-GFP-System („Gene Tag“) als visualisierende Komponente, um das Indikatorgen auf DNA-Ebene sichtbar zu machen. Das Indikatorgen selbst basiert auf der induzierbaren Transkriptionseinheit von HIV-1, die spezifisch durch das virale Protein Tat aktiviert werden kann und die Transkription eines Reportergens (DsRed) kontrolliert. Im transient transfizierten Status konnte das Indikatorgen als Episom durch Bindung des „Gene Tags“ als punktförmiges Signal im Kern detektiert werden. In den etablierten und charakterisierten Zelllinien HeLa-Indi war dies durch Bindung des „Gene Tags“ an 64 Lac-Repressor-Bindungsstellen eines einzelnen Transgens nicht möglich. Die Etablierung der stabilen Zelllinien und die transiente Expression ermöglichten einen direkten Vergleich der Transkription von der integrierten und episomalen HIV-1 LTR. In beiden Fällen konnte eine spezifische Transkriptionsaktivierung durch Tat auf Protein- und RNA-Ebene beobachtet werden. Auch eine Tat-unabhängige Basisaktivität in Form von Volllänge-Transkripten konnte immer nachgewiesen werden, die in verschiedenen Zelllinien und dem episomalen Indikatorgen aber zu keiner nachweisbaren Proteinexpression führte. Die induzierte Expression des Indikatorgens des „GePS“ konnte darüber hinaus in wichtigen HIV-1 Zielzellen (CD4 positive Lymphozyten) gezeigt werden. Des Weiteren konnten Erkenntnisse über die Tat-induzierte, von der HIV-1 LTR ausgehenden Transkription und der Zusammenhang zum Spleißen gewonnen werden. Durch quantitative PCR wurde deutlich, dass sowohl im epsiomalen als auch integrierten Status erst durch die gesteigerte Transkription das Spleißen der Indikatorgen-RNA induziert wird, das Spleißen also co-transkriptionell stattfindet. Tat selbst spielt bei der Rekrutierung von Spleißfaktoren nur eine indirekte Rolle, da durch die transkriptionsdefiziente Mutante Tat(K41A) kein Spleißen initiiert wird. Durch verschiedene methodische Ansätze wurde versucht, die Frage der Chromatinzusammensetzung von nicht replizierenden Episomen in menschlichen Zellen zu beantworten. Weder durch eine Colokalisations-Untersuchung noch eine Chromatin IP konnte jedoch eine spezifische Assoziation des episomalen Indikatorgens mit dem Histon H3 nachgewiesen werden. Eine Bindung von Proteinen an die Episomen konnte am Beispiel von p50, einer Untereinheit des Transkriptionsfaktors NFκB, gezeigt werden. Für die produktive Replikation der Retroviren ist die Integration der proviralen DNA ins Genom der Wirtszelle nötig, jedoch konnte für HIV gezeigt werden, dass nicht integrierte zirkuläre HIV-DNA in sich nicht teilenden Zellen persistiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Vermutung, dass nicht integrierte retrovirale DNA transkribiert werden kann und dadurch die exprimierten Proteine Bedeutung für den Lebenszyklus von HIV und durch ihre Persistenz Einfluss auf die Wirtszellen haben können

Substratabhängige Entwicklung der Zellzugkräfte während der initialen Zelladhäsion

Die Untersuchung von Zell-Material-Wechselwirkungen ist bedeutsam für die Entwicklung innovativer Biomaterialien, wobei aus biophysikalischer Sicht der Einfluss mechanischer Eigenschaften auf das Zellverhalten, d.h., die Mechanotransduktion, von besonderem Interesse ist. Für diese Dissertation wurden humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene zur Adhäsion auf Polyacrylamidhydrogele (PAA-Hydrogele) gegeben, die mit einer Maleinsäurecopolymer-Beschichtung versehen waren. Für Experimente unter veränderlichen Substrateigenschaften wurden die Steifigkeit der PAA-Hydrogele und die Ligandenaffinität der Beschichtung variiert. Der erste Teil der Dissertation umfasste die Charakterisierung der beschichteten PAA-Hydrogele. Dafür wurde der Elastizitätsmodul gemessen und die Adsorption von Fibronektin untersucht. Im zweiten Teil der Dissertation wurden die PAA-Hydrogele in der Zellzugkraftmikroskopie während der initialen Zelladhäsion (2 h) verwendet. Dabei stellte sich heraus, dass zwar die finale Zellfläche unabhängig von den Substratparametern war, aber die Ausbreitung von Zellen mit zunehmender Steifigkeit und Ligandenaffinität schneller ablief. Außerdem waren der Anstieg und die Plateauwerte der Zellzugkräfte auf steiferen Substraten größer. Die Steifigkeitsabhängigkeit lässt sich aus der Dehnungsversteifung des Aktinzytoskeletts unter Wirkung einer Spannung erklären. Eine Zunahme der Ligandenaffinität führte ebenfalls zu einer schnelleren Zunahme und größeren Plateauwerten von Gesamtzellzugkräften. Diese Beobachtung kann der Zunahme von Reibungskräften zugesprochen werden. Im letzten Teil der Dissertation sollten die biophysikalischen Ergebnisse durch die Untersuchung intrazellulärer Signalprozesse zusätzlich unterlegt werden. Dafür wurde die Entwicklung von Adhäsionsstellen durch eine immunzytochemische Färbung untersucht. Obwohl diese aufgrund der technischen Herausforderungen keine umfassenden Aussagen liefern konnte, deuteten sich einige Korrelationen, z.B. eine schnellere Entwicklung der Adhäsionsstellen auf steiferen Substraten, an. Die Ergebnisse der Dissertation ordnen sich in den aktuellen Forschungsstand zur Mechanotransduktion von Zellen ein und konnten in Bezug auf die Adhäsionsdynamik neue Erkenntnisse beisteuern. Vor allem der Stellenwert dissipativer Beiträge zu Zell-Substrat-Wechselwirkungen (z.B. Ligandenreibung) wurde unterstrichen. Diese sind in der Entwicklung neuer Biomaterialien mit spezifischen viskoelastischen Eigenschaften von besonderer Bedeutung.The investigation of cell-substrate-interactions is of great importance for the development of innovative biomaterials. The influence of thematerials mechanical properties on cells and their functions, i. e., the process of mechanotransduction, is of particular interest from a biophysical point of view. In this dissertation human umbilical cord vein endothelial cells were seeded onto polyacrylamide hydrogels which had been modified by a maleic acid copolymer coating. To tune the mechanical properties of the substrate the hydrogels’ stiffness and the affinity of the coatings to the adhesion ligand fibronectin were variied. The first part of the dissertation is concerned with the characterization of the coated polyacrylamide hydrogels. The hydrogels’ Young’s modulus was measured and the adsorption of fibronectin was investigated. In the second part of the dissertation these cell culture scaffolds were used for cell traction force microscopy during the first two hours of cell adhesion. Although maximum cell area was not influenced by substrate parameters, cell spreading was faster for higher stiffness and higher ligand affinity. Traction force increase as well as plateau forces were higher on stiff substrates. The dependence of the dynamics of area and traction force on stiffness and their respective magnitudes after saturation could be related to properties of the actin cytoskeleton under stress. The increase in ligand affinity also led to a faster increase and higher mean plateau values of the total cell force. This observation was assigned to increasing friction forces between ligands and polymer coating. In the last part of the dissertation possible correlations between cell traction forces and intracellular signalling processes were examined. The development of adhesion sites during early cell adhesion was investigated by immunocytochemical staining. Due to technical reasons no comprehensive investigation could be realized, but nevertheless some correlations were observed, such as a faster adhesion site formation with higher stiffness. The results of this dissertation add to the current state of research regarding mechanotransduction of cells and yield new findings regarding to cell adhesion dynamics. Most notably viscous contributions to cell-substrate-interactions (i.e., ligand friction) were shown to influence cell behavior. This highlights that a thorough understanding of viscous processes is of utmost significance for the development of new biomaterials with specific viscoelastic properties