Der Polycomb Repressive Complex 2 und der Einfluss seiner Histonmodifikation H3K27me3 auf die TBXT- und HOX-Genexpression in Chordomen

Abstract

Chordome sind sehr seltene, langsam wachsende Knochentumoren, die hauptsächlich entlang der Wirbelsäule entstehen. Für das Wachstum dieser Tumoren ist der Transkriptionsfaktor Brachyury (codiert durch das TBXT-Gen) essenziell. Dieser stellt ein wichtiges Protein in der Entwicklung des Notochords dar und ist in nahezu allen Chordomen nachweisbar. Die Therapie besteht in der chirurgischen En-bloc Resektion und möglicher anschließender Radiatio. Eine effiziente systemische Therapie konnte bisher noch nicht etabliert werden. Der Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) katalysiert über Zwischenstufen die Trimethylierung am Lysinrest 27 des Histons H3 (H3K27me3). Diese Modifikation wirkt unterdrückend auf die Expression der unter diesem Einfluss stehenden Gene und ist wichtig für die regelrechte Genexpression während der Embryonalentwicklung. Zielgene stellen unter anderem Tumorsuppressorgene wie CDKN2A (Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 2A) oder die HOX-Gene dar. Der PRC2 wurde aufgrund seiner Wirkung auf die Genexpression sowohl in einer tumorfördernden, als auch einer tumorhemmenden Rolle beschrieben. Einen Gegenspieler stellen die Demethylasen UTX (Ubiquitously Transcribed X Chromosome Tetratricopeptide Repeat Protein) und JMJD3 (Jumonji Domain Containing 3) dar, die spezifisch H3K27me3 demethylieren und damit fördernd auf die Genexpression wirken. Da Brachyury einen spezifischen Angriffspunkt in der Chordomtherapie darstellt, sollte im Rahmen dieser Arbeit unter anderem festgestellt werden, ob es sich durch die Veränderung der H3K27me3-Menge beeinflussen lässt und ob es sich bei den HOX-Genen auch in Chordomen um Zielgene des PRC2 handelt. Zunächst wurde gezeigt, dass die drei essenziellen Hauptkomponenten des PRC2 EZH2 (Enhancer of Zeste Homolog 2), SUZ12 (Suppressor of Zeste 12 Homolog) und EED (Embryonic Ectoderm Development) in den sieben untersuchten Chordomzelllinien sowohl auf mRNA- als auch Proteinebene, am stärksten in der sakralen Linie MUG-Chor1, nachweisbar waren. Außerdem konnte eine nukleäre Lokalisation der drei Komponenten beobachtet werden, sowie Hinweise auf Unterschiede in deren Menge im Hinblick auf die Ursprungslokalisationen der Linien. Die Inhibitionsversuche zur Beeinflussung der H3K27me3-Menge wurden an den Linien MUG-Chor1, U-CH1, UM-Chor1 und U-CHCF365 durchgeführt. Auf GSK-J4, einem Inhibitor der Demethylasen UTX und JMJD3, reagierten die Linien MUG-Chor1 und UM-Chor1 mit der erwarteten Erhöhung von H3K27me3, während es in der Linie U-CHCF365 zu keiner Veränderung kam. Im Hinblick auf eine veränderte Genexpression zeigte U-CH1 eine Verminderung der HOXA7-, HOXA10- und HOXB7-Genexpression, die sich auf Proteinebene allerdings nicht widerspiegelte. In den drei untersuchten Linien MUG-Chor1, U-CH1 und UM-Chor1 kam es zu einer deutlich verminderten TBXT-Genexpression, die sich allerdings sich in keiner Weise auf die Brachyuryproteinmenge auswirkte. In hohen Konzentrationen führte der Inhibitor zu einem Absterben der vier Chordomzelllinien, sowie auch von primären Fibroblasten, die sogar sensibler auf die Substanz reagierten. Zu einer Verminderung der H3K27me3-Menge in allen vier Linien kam es unter Behandlung mit EED226, einem spezifischen Inhibitor des PRC2. Allerdings hatte diese kaum Effekt auf die HOX- oder TBXT-Expression. Es fanden sich lediglich in den Linien UM-Chor1 und U-CHCF365 bei Betrachtung von HOXA9 und HOXA10 eine erwartete verstärkte Expression, bzw. Hinweise darauf. Konsistent mit dem fehlenden Effekt auf die TBXT-Expression blieb die Brachyuryproteinmenge nach Inkubation mit dem Inhibitor unverändert. Eine leichte Verminderung der Viabilität unter der Behandlung konnte nur in der Linie U-CHCF365 sowie in primären Fibroblasten beobachtet werden. Somit konnte der in der Literatur beschriebene Effekt einer Inhibition der Demethylasen und der damit einhergehenden Veränderung von H3K27me3 auf die Brachyuryproteinmenge nicht bestätigt werden. Außerdem scheint es sich bei den HOX-Genen in Chordomen ebenfalls nicht um reine PRC2-Zielgene zu handeln. Die Veränderung der Genexpression über epigenetische Histonmodifikationen ist ein hoch komplexer Prozess, der viele weitere Faktoren und Modifikationen beinhaltet, die sich gegenseitig beeinflussen. Um Brachyury auf dieser Ebene anzielen zu können bedarf es dementsprechend weiterer Untersuchungen in diesem System. Der zweite Teil der Arbeit beschreibt die Etablierung und Vorbereitung neuer Chordomzelllinien. Zum einen wurde mit der Kultivierung zweier Chordomproben aus verschiedenen Lokalisationen eines großen sakralen Chordoms, sowie der Aufarbeitung dessen vorheriger Biopsie die Basis eines Modells geschaffen, die Heterogenität innerhalb eines Tumors darzustellen. Zum anderen wurde die Etablierung der Linie U-CH21, der ersten Linie eines Chordoms der Halswirbelsäule, abgeschlossen. Diese stellt damit ein weiteres Modell zur Verfügung, Unterschiede der Tumorentität im Hinblick auf die Ursprungslokalisation darzustellen