Study of susceptible and resistant populations of Sinapis arvensis and Rapistrum rugosum to ALS-inhibiting herbicides

Abstract

Twenty one populations of wild mustard (Sinapis arvensis L.) from winter cereal crops of Phiotida, Pieria, Chalkidiki, Larissa and Thessaloniki counties were initially evaluated for cross-resistance to ALS-inhibiting herbicides tribenuron and imazamox. The 18 out of the 21 populations were resistant to tribenuron, while 15 had cross-resistance to both tribenuron and imazamox. Four populations showed an evolving resistance to these herbicides, whereas all populations were susceptible to the recommended rate of MCPA used as alternative chemical option. Τhe calculated GR50 values of tribenuron [the herbicide rate (g ai/ha) required to reduce the fresh weight of resistant plants by 50%] for the 18 resistant populations ranged from 29.2 to 594.7 g ai/ha, while the respective GR50 imazamox values for the 15 resistant populations ranged from 41.3 to 900.4 g ai/ha. Regarding susceptible populations, the GR50 value was not evaluated for tribenuron as the lowest dose reduced fresh weight of this population by more than 50%, whereas the corresponding value for imazamox was 0.5-4.3 g ai/ha. The sequence of the als gene revealed that there was a point mutation at the Trp574 site that resulted in replacement by Leu in the ALS enzyme, which was also confirmed by the use of HRM analysis. The in vitro activity of the ALS enzyme showed I50 values (herbicide concentration required for a 50% decrease in ALS activity) ranging from 19.11 to 217.45 μM of tribenuron, whereas the corresponding value for the susceptible population was 0.98 to 1.17 μM. These results strongly support that the cross-resistance of S. arvensis populations was due to a point mutation of the als gene, resulting in a less sensitive ALS enzyme. The experiments conducted to investigate the growth rate of five populations S. arvensis (4 resistant and one sensitive) originating from different counties of Greece indicated that the resistance trait did not have any significant effect on dry weight and seed production. The additional experiments to study genetic parameters of these five populations, using ISSR molecular markers, confirmed the differentiation between the five populations. The evaluation of 10 putative resistant Rapistrum rugosum populations along with two susceptible population originating from Greece showed that one (P1) out of 10 putative resistant populations was cross-resistant to tribenuron and imazamox, while another population (P4) was resistant to tribenuron only. All populations were susceptible to MCPA applied at the recommended rate. Gene sequencing of als revealed that the the P4 population had a point mutation at Pro197 by His providing resistance to tribenuron, whereas the P1 had a Trp574 by Leu point mutation conferring cross-resistance to both tribenuron and imazamox. The in vitro activity of the ALS enzyme indicated I50 tribenuron values ranging from 66.68 to 137.01 μM, whereas the respective value for the S populations ranged from 0.29 to 0.54 μM. These results strongly support that two R. rugosum populations evolved resistance to ALS-inhibiting herbicides due different point mutations in their als gene.Σε πειράµατα φυτοδοχείων αξιολογήθηκαν αρχικώς 21 πληθυσµοί άγριου σιναπιού (Sinapis arvensis L.) από καλλιέργειες χειµερινών σιτηρών των Νομών Φθιώτιδας, Πιερίας, Χαλκιδικής, Λάρισας και Θεσσαλονίκης για πιθανή εξέλιξη διασταυρωτής ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα tribenuron και imazamox. Οι 18 από τους 21 πληθυσμούς ήταν ανθεκτικοί στο ζιζανιοκτόνο tribenuron, ενώ οι 15 είχαν διασταυρωτή ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα tribenuron και imazamox. Σε τέσσερις πληθυσμούς διαπιστώθηκε ανθεκτικότητα σε εξελισσόμενη μορφή (στάδιο) στα δύο ζιζανιοκτόνα. Όλοι οι πληθυσμοί ήταν ευαίσθητοι στη συνιστώμενη δόση του ζιζανιοκτόνου MCPA. Οι υπολογισθείσες GR50 τιμές (η δόση του ζιζανιοκτόνου που απαιτείται για µείωση του χλωρού βάρους των ανθεκτικών φυτών κατά 50%) από τα πειράµατα έντασης της ανθεκτικότητας για τους 18 ανθεκτικούς πληθυσμούς στο tribenuron κυμάνθηκαν από 2,92 έως 59,47 g δ.ο./στρ, ενώ το αντίστοιχο εύρος των GR50 τιμών για τους 15 ανθεκτικούς πληθυσμούς στο imazamox ήταν 4,13-90,04 g δ.ο./στρ. Η GR50 τιμή tribenuron για τους ευαίσθητους πληθυσμούς δεν εκτιμήθηκε διότι η χαμηλότερη δόση του μείωσε το νωπό βάρος τους κατά >50%, ενώ η αντίστοιχη GR50 τιμή για το imazamox ήταν 0,05-0,43 g δ.ο./στρ. Η αλληλούχηση του γονιδίου als αποκάλυψε σημειακή μετάλλαξη που οδήγησε στην αντικατάσταση του αμινοξέος Trp574 από Leu στο ένζυμο ALS, η οποία επιβεβαιώθηκε και με την HRM ανάλυση. Η in vitro δράση του ενζύμου ALS έδειξε I50 τιμές (συγκέντρωση ζιζανιοκτόνου που απαιτείται για 50% μείωση της δράσης του ενζύμου ALS) που κυμάνθηκαν από 19,11 έως 217,45 μΜ για το tribenuron, ενώ η αντίστοιχη τιμή για τον ευαίσθητο πληθυσμό ήταν 0,98-1,17 μΜ. Τα αποτελέσματα αυτά τεκμαίρουν ότι η διασταυρωτή ανθεκτικότητα των πληθυσμών S. arvensis οφειλόταν σε σημειακή μετάλλαξη του γονιδίου als που είχε ως συνέπεια την κωδικοποίηση λιγότερο ευαίσθητου ενζύμου ALS στα ζιζανιοκτόνα tribenuron και imazamox.Τα πειράματα διερεύνησης του ρυθμού ανάπτυξης πέντε πληθυσμών S. arvensis (4 ανθεκτικοί και ένας ευαίσθητος) από διαφορετικές περιοχές της Ελλάδος έδειξαν ότι το νωπό βάρος και η παραγωγή σπόρου των ανθεκτικών πληθυσμών δεν διέφερε σημαντικά από εκείνα του ευαίσθητου πληθυσμού. Η μελέτη της γενετικής σύστασης των πέντε πληθυσμών με ανάλυση μοριακών δεικτών ISSR επιβεβαίωσε τη διαφοροποίηση των πληθυσμών ως προς τον τόπο προέλευσης, ανθεκτικότητας. Με βάση τα πειράματα μελέτης δέκα δυνητικώς ανθεκτικών και δύο ευαίσθητων πληθυσμών ράπιστρου (Rapistrum rugosum) για ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα tribenuron και imazamox διαπιστώθηκε ότι ένας από τους 10 δυνητικώς ανθεκτικούς πληθυσμούς εμφάνισε διασταυρωτή ανθεκτικότητα στα δύο ζιζανιοκτόνα, ενώ ένας άλλος πληθυσμός ήταν ανθεκτικός μόνο στο tribenuron και όχι στο imazamox. Όλοι οι πληθυσμοί ήταν ευαίσθητοι στη συνιστώμενη δόση του MCPA. Η αλληλούχηση τμήματος του γονιδίου als στον ένα πληθυσμό, αποκάλυψε σημειακή μετάλλαξη στο κωδικόνιο Pro197 που προσδίδει ανθεκτικότητα στο tribenuron, ενώ στον άλλο διαπιστώθηκε σημειακή μετάλλαξη στο κωδικόνιο Trp574 που προσδίδει διασταυρωτή ανθεκτικότητα στο tribenuron και το imazamox. Οι Ι50 τιμές του ενζύμου ALS στην παρουσία του tribenuron κυμάνθηκαν για τους ανθεκτικούς πληθυσμούς από 66,68 έως 137,01 μΜ, ενώ η αντίστοιχη τιμή για τους ευαίσθητους πληθυσμούς κυμάνθηκε από 0,29 έως 0,54 μΜ. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι δύο πληθυσμοί R. rugosum εξέλιξαν ανθεκτικότητα σε δύο ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS εξαιτίας διαφορετικών σημειακών μεταλλάξεων στο γονίδιο als