Bestemmelse av hCG-isoformer i urin : Bruk av immunoaffinitet og LC-MS som analyseverktøy

Abstract

En LC-MS-metode for bestemmelse av de ulike hCG-isoformer i urin ble utviklet. For å kunne utføre slike analyser ble en ”bottom-up”-strategi valgt der proteinene blir spaltet ved hjelp av trypsin. Ved hjelp av MS/MS, BLAST og ProteinProspector ble følgende tryptiske produkter identifisert som spesifikke for hCG og dets isoformer (signaturpeptider): VLQGVLPALPQVVCNYR (T5) for hCG og hCGβ, GVNPVVSYAVALSCQCALCR (T9) for hCG og hCGβ, LQGVLPALPQVVCNYR (nT5(45-60)) for hCGn og hCGβn, VLPALPQVVCNYR (nT5(48-60)) for hCGn og hCGβn og GVNPVVSYAVALSCQCAL (cfT9) for hCGβcf. Disse peptidene ble i arbeidet bestemt ved LC-MS i SIM-modus på følgende m/z-verdier: T5 (m/z: 964,0 og 643,0), T9 (m/z: 1114,0 og 743,0), nT5(45-60) (m/z: 914,5 og 610,0), nT5(48-60) (m/z: 765,4 og 510,6) og cfT9 (m/z: 955,5 og 639,3). For å rense opp samt oppkonsentrere signaturpeptidene ble en SPE-metode optimalisert. Følgende SPE-betingelser viste seg å være optimale: - Sorbent: C8-materiale - Vaskeløsninger: 5 % MeCN i 20 mM FA og/eller 15 % MeCN i vann - Elueringsløsning: 80 % MeCN i 0,1 % TFA Isoformene til hCG ble bestemt i urin enten ved å trypsinere direkte (in-solution) eller ved å rense opp med immunaffinitetsekstraksjon (in-well) før trypsinering, separasjon og deteksjon. De to prosedyrene ble sammenliknet og det viste at begge tilnærmingene var gjennomførbare. Begge metodene ble benyttet på urin fra gravide og følgende signaturpeptider ble identifisert ved analysene: - in-well: T5, T9 og cfT9 - in-solution: T5 (metoden ble utført med høy temperatur for denaturering som viste seg å ikke være optimal for in-solution proteolyse av urin