Regulación de la expresión génica de miostatina inducida por IGF-1 mediada por el factor de transcripción CREB durante la diferenciación de los mioblastos.

Abstract

Tesis (Magíster en Biotecnología)La miogénesis es el proceso encargado de la determinación y formación de las células del tejido muscular. El programa miogénico involucra varios pasos como la proliferación y diferenciación de las células musculares, etapas que son reguladas por señales extracelulares como el factor de crecimiento análogo a insulina 1 (IGF-1) y Miostatina. IGF-1 es un regulador positivo de la proliferación y diferenciación muscular, mientras que Miostatina regula negativamente estos procesos. IGF-1 ejerce sus funciones activando vías de señalización como MAPK, PI3K/Akt o PLCγ/IP3 que regulan la actividad de factores de transcripción pro-miogénicos como CREB. Análisis in silico de la región promotora de miostatina revelaron regiones conservadas para la unión del factor de transcripción CREB, sugiriendo fuertemente que la expresión de miostatina puede ser regulada por la vía de señalización IGF-1-CREB. Considerando estos antecedentes, se postuló la siguiente hipótesis de trabajo: durante la diferenciación de los mioblastos, IGF-1 regula la expresión génica de miostatina mediante la activación del factor de transcripción CREB. Para corroborar esta hipótesis, se estudió el efecto de diversas concentraciones de IGF-1 (fisiológicas, subfisiológicas y suprafisiológicas) en la activación de CREB y en la regulación de la expresión génica de miostatina, mediante las técnicas western blot, vector reportero y RT-qPCR. Adicionalmente mediante la utilización de inhibidores farmacológicos específicos se logró diseccionar las vías de señalización que participan en la activación de CREB así como la expresión de miostatina. Complementariamente se utilizó RNA interferente pequeño para CREB para evaluar su efecto en la expresión génica de miostatina. Los resultados sugieren que IGF-1 induce la activación de CREB así como la expresión génica de miostatina a través de variadas vías de señalización entre las que destacan la MAPKs y PI3K/PLCγ/IP3. Esta última involucrada en la liberación de calcio y posiblemente en la activación de proteínas dependientes de calcio como PKC y CaMK. En conclusión, IGF-1 regula la diferenciación de los mioblastos activando diversas vías de señalización que convergen en la activación de CREB e inducen la expresión génica de miostatina, un regulador negativo de la diferenciación de mioblastos. La información obtenida de este proyecto contribuirá significativamente a ampliar el conocimiento acerca de la miogénesis y desarrollo muscular, teniendo aplicaciones potenciales en el campo de la biotecnología biomédica.Myogenesis is the process responsible of the determination and formation of muscle tissue cells. The myogenic program involves several steps as the proliferation and differentiation of muscle cells, steps wich are regulated by extracellular signals as insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and Myostatin. IGF-1 is a positive regulator of muscle proliferation and differentiation, whereas Myostatin negatively regulates these processes. IGF-1 exerts its functions activating signaling pathways as MAPK, PI3K/Akt or PLCγ/IP3 that regulate the activity of pro-myogenic transcription factors as CREB. In silico analysis of myostatin promoter region revealed conserved regions for binding of transcription factor CREB, strongly suggesting that myostatin expression can be regulated for the signaling pathway IGF-1-CREB. Considering this background, it was postulated the following working hypothesis: during myoblasts differentiation, IGF-1 regulates myostatin gene expression through activation of transcription factor CREB. To test this hypothesis, it was studied the effect of various concentrations of IGF-1 (subphysiological, physiological and supraphysiological) in the activation of CREB and regulation of myostatin gene expression, through western blot, reporter vector and RT-qPCR techniques. Further by utilizing specific pharmacological inhibitors was achieved dissect the signaling pathways that participate in the activation of CREB as well as the myostatin gene expression. Additionally small interfering RNA for CREB was used to evaluate their effect on myostatin gene expression. The results suggest that IGF-1 induces the activation of CREB as well as myostatin gene expression through various signaling pathway among wich stand MAPKs and PI3K/PLCγ/IP3 signaling pathways. The latter involved in calcium release and possibly the activation of calcium-dependent proteins as PKC and CaMK. In conclusion, IGF-1 regulates myoblasts differentiation activating of different signaling pathways converging in the activation of CREB and inducing myostatin gene expression, a negative regulator of myoblasts differentiation. The information obtained in this project will contribute significantly to broadening knowledge about myogenesis and muscle development, with potential applications to biomedical field of biotechnology