A Multimodal approach to investigate the use of Fusobacterium nucleatum and its associated microbiota as biomarkers for relapse in locally advanced rectal cancer

Els estudis han demostrat que els nivells elevats de Fusobacterium nucleatum (Fn) en teixits de càncer colorectal (CRC), en comparació amb la mucosa normal, estan vinculats a característiques clíniques i moleculars del tumor. En el càncer rectal localment avançat (LARC), la persistència de Fn després de la quimiorradioteràpia neoadjuvant (nCRT) s'associa a una menor activació de cèl·lules T citotòxiques i a una pitjor supervivència, cosa que suggereix que Fn i la seva microbiota associada podrien crear un microambient immunosupressor que influeix en l'eficàcia del tractament. Aquesta tesi analitza la microbiota intratumoral en LARC associada a Fn i la seva petjada metabòlica. En el 64% dels tumors analitzats es va detectar Fusobacterium, sent Fn l'espècie predominant. Aquests tumors presentaven una menor diversitat microbiana i una composició diferent, amb bacteris típics de la cavitat oral. A més, alguns gèneres coexistien amb Fn en una estructura tipus biofilm. Es va observar que diversos d'aquests microorganismes eren més presents en pacients que van recaure després de la nCRT. L'anàlisi metabolòmica va revelar metabòlits relacionats amb la carcinogènesi que podrien estar vinculats a gens bacterians, com la hipoxantina, la glicina i el lactat, connectats per primera vegada a la presència de Fn en el microambient tumoral.Estudios han mostrado que los niveles elevados de Fn en tejidos de CRC, en comparación con la mucosa normal, están vinculados con características clínicas y moleculares del tumor. En cáncer rectal localmente avanzado (LARC), la persistencia de Fn después de quimiorradioterapia (nCRT) se relaciona con una menor activación de células T citotóxicas y peor supervivencia, lo que sugiere que Fn y su microbiota asociada podrían generar un microambiente inmunosupresor que influye en la eficacia del tratamiento. La tesis analiza la microbiota intratumoral en LARC asociada a Fn y su huella metabólica. En un 64% de los tumores analizados se detectó Fusobacterium, siendo Fn la especie predominante. Estos tumores presentaban menor diversidad microbiana y una composición distinta, con bacterias típicas de la cavidad oral. Además, algunos géneros co-existían con Fn en una estructura tipo biofilm. Se observó que varios de estos microorganismos estaban más presentes en pacientes que recayeron después de nCRT. El análisis metabolómico reveló metabolitos relacionados con carcinogénesis que podrían estar vinculados a genes bacterianos, como hipoxantina, glicina y lactato, conectados por primera vez a la presencia de Fn en el microambiente tumoral.Studies have shown that elevated levels of Fusobacterium nucleatum (Fn) in colorectal cancer (CRC) tissues, compared to normal mucosa, are linked to clinical and molecular characteristics of the tumor. In locally advanced rectal cancer (LARC), the persistence of Fn after neoadjuvant chemoradiotherapy (nCRT) is associated with reduced cytotoxic T cell activation and poorer survival, suggesting that Fn and its associated microbiota may create an immunosuppressive microenvironment that influences treatment efficacy. This thesis analyzes the intratumoral microbiota in LARC associated with Fn and its metabolic footprint. In 64% of the tumors analyzed, Fusobacterium was detected, with Fn being the predominant species. These tumors exhibited reduced microbial diversity and a distinct composition, with bacteria typically found in the oral cavity. Moreover, some genera coexisted with Fn in a biofilm-like structure. Several of these microorganisms were more prevalent in patients who relapsed after nCRT. Metabolomic analysis revealed metabolites related to carcinogenesis that could be linked to bacterial genes, such as hypoxanthine, glycine, and lactate, connected for the first time to the presence of Fn in the tumor microenvironment

Novel Approaches in Aptamer-Based Diagnostics : Design, Stability, and Targeted SELEX Protocols

Disseny i desenvolupament de biosensors de flux lateral per a la detecció de biomarcadors de molècules petites mitjançant aptàmers i àcids nucleics. Estudi d'estabilitat de conjugats de nanopartícules ADN-or mitjançant diferents mètodes de conjugació i tampons d'emmagatzematge. Desenvolupament d'aptàmers mitjançant l'evolució sistemàtica de lligands per enriquiment exponencial (SELEX) contra molècules petites.Diseño y desarrollo de biosensores de flujo lateral para la detección de biomarcadores de moléculas pequeñas utilizando aptámeros y ácidos nucleicos. Estudio de estabilidad de conjugados de nanopartículas de oro y ADN utilizando diferentes métodos de conjugación y tampones de almacenamiento. Desarrollo de aptámeros mediante evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial (SELEX) frente a moléculas pequeñas.Design and development of lateral flow biosensors for the detection of small molecule biomarkers using aptamers and nucleic acids. Stability study of DNA-gold nanoparticle conjugates using different conjugation methods and storage buffers. Development of aptamers using systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) against small molecules

A new plant-based nanovesicle platform based on alkyl polyglucosides and β-sitosterol for topical delivery

Els sistemes d'alliberament controlat s'han utilitzat durant les últimes dècades per millorar l'eficàcia i la seguretat de fàrmacs i altres actius. Les vesícules són una de les opcions més populars com a sistemes d'alliberament per aplicacions farmacèutiques i productes de cura personal. Per superar les limitacions dels primers sistemes vesiculars, com els liposomes convencionals, la recerca ha portat a investigar noves composicions que poden incrementar l'estabilitat i la tolerabilitat de les formulacions vesiculars. Tot i això, aquesta recerca és un procés complex que depèn de diferents factors com els components que es fan servir, les interaccions entre ells o el medi dispersant. Aquesta Tesi Doctoral Industrial presenta el desenvolupament de nous sistemes vesiculars fent servir components d'origen vegetal, biocompatibles i biodegradables com a components de membrana, per aplicacions tòpiques en l'àmbit de la cura personal i la cosmètica. Els nous sistemes d'alliberament s'han preparat fent servir el procés DELOS, una metodologia basada en fluids comprimits que permet preparar formulacions en un sol pas, i que és robusta, escalable i amb un baix impacte mediambiental. Les vesícules s'han obtingut per l'auto-assemblatge del ß-sitosterol (Sit) amb tensioactius de la família dels alquil poliglucòsids, principalment el lauril glucòsid (LGL) i el lauril glucosa carboxilat (LGC). S'han desenvolupat diferents sistemes que s'han caracteritzat amb tècniques avançades com la dispersió dinàmica de llum, la microscòpia electrònica en condicions criogèniques o la dispersió de raig X. Amb l'objectiu d'avaluar el seu rol com a sistemes d'alliberament, diferents actius d'interès pel sector dermocosmètic s'han formulat amb les nanovesícules (NVs) formades per Sit, LGL i LGC. Molècules petites de caràcter hidrofòbic com l'α-tocoferol (vitamina-E), amb activitat antioxidant, i el 7-dehidrocolesterol, un precursor de la vitamina D, han estat carregades de forma eficient a les NVs. A part de les seves propietats fisicoquímiques, la funcionalitat dels actius després d'integrar-los a les NVs també es va avaluar, demostrant que la seva activitat es mantenia. Altrament, també s'han estudiat molècules com l'ascorbil glucòsid (vitamina-C) i la niacinamida (vitamina-B3), ambdues molècules petites de caràcter hidrofílic, o una proteïna com és el factor de creixement de fibroblasts bàsic, que és una biomolècula de més gran. En vistes de l'aplicació tòpica d'aquestes NVs, els prototips més prometedors han estat evaluats en termes de la seva funció biològica in vivo i ex vivo. En primer lloc, s'han dut a terme assajos de biocompatibilitat in vitro amb models d'epidermis humana reconstruïda, obtenint resultats positius per totes les formulacions avaluades i sense efectes irritants. En segon lloc, s'han realitzat estudis de retenció en pell ex vivo fent servir microscòpia d'excitació de dos fotons i NVs marcades amb el fluoròfor vermell Nil. Els resultats han demostrat una millora en la permeació a la pell del fluoròfor en comparació amb la molècula lliure. Finalment, en aquesta Tesi s'han explorat altres aplicacions més enllà de les cosmètiques. Com a prova de concepte, els sistemes vesiculars formats per Sit i LGL s'han modificat amb components acceptats per ús farmacèutic. En particular, dos derivats del colesterol s'han auto-assemblat amb el Sit i el LGL per formar noves NVs: un derivat amb una molècula del polímer PEG (colesterol-PEG600), i un segon derivat amb una amina terciària (DC-colesterol), per obtenir, respectivament, NVs estables no iòniques o catiòniques. Per completar la prova de concepte, l'habilitat d'integrar diferents fàrmacs s'ha estudiat amb les NVs amb DC-colesterol. S'han integrat el cannabidiol, el metotrexat i la hormona de creixement humana, cadascuna amb una estructura química i característiques diferents. En resum, els resultats obtinguts en aquesta Tesi presenten el desenvolupament satisfactori d'una plataforma versàtil de nanovesícules estables i homogènies obtingudes amb ingredients d'origen vental, per a aplicacions tòpiques en la indústria cosmètica farmacèutica.Los sistemas de liberación controlada se han usado durante las últimas décadas para mejorar la eficacia y seguridad de fármacos. Las vesículas son una de las opciones más populares como sistemas de liberación para aplicaciones farmacéuticas y productos de cuidado personal. Para superar las limitaciones de los primeros sistemas vesiculares, como los liposomas convencionales, la investigación ha llevado a encontrar nuevas composiciones que pueden incrementar la estabilidad y la tolerabilidad de las formulaciones de vesículas. No obstante, esta búsqueda es un proceso complejo que depende de distintos factores como los componentes utilizados, sus interacciones o el medio dispersante. Esta Tesis Doctoral Industrial presenta el desarrollo de nuevos sistemas vesiculares usando componentes de origen vegetal, biocompatibles y biodegradables, como componentes de membrana para aplicaciones tópicas en el ámbito del cuidado personal y la cosmética. Los nuevos sistemas de liberación controlada se han preparado usando el proceso DELOS, una metodología que permite obtener formulaciones en un solo paso y que está basada en fluidos comprimidos. Este proceso es robusto, escalable y con un impacto medioambiental bajo. Las vesículas se han formado por el autoensamblaje del β-sitosterol (Sit) y surfactantes de la familia de los alquil poliglucósidos, principalmente el lauril glucósido (LGL) y el lauril glucosa carboxilato (LGC). Se han desarrollado distintos sistemas que se han caracterizado mediante técnicas avanzadas como la dispersión dinámica de luz, la microscopia electrónica criogénica o la dispersión de rayos-X. Con el objetivo de evaluar su rol como sistemas de libración controlada, diferentes ingredientes activos de interés para el sector dermocosmético se han formulado con las nanovesículas (NVs) formadas por Sit, LGL y LGC. Moléculas pequeñas de carácter hidrofóbico como el α-tocoferol (vitamina-E), con actividad antioxidante, y el 7 dehidrocolesterol, (pre-vitamina D), han sido cargadas de forma eficiente en las NVs. Además de las propiedades fisicoquímicas, la funcionalidad de los activos después de integrarlos en las NVs también se evaluó, demostrando que su actividad se mantenía. También se han estudiado moléculas como el ascorbyl glucósido (vitamina-C) y la niacinamida (vitamina-B3), ambas moléculas pequeñas de carácter hidrofílico, o una proteína como el factor de crecimiento de fibroblastos básico, que es una biomolécula más grande. En vistas de la aplicación tópica de estas NVs, los prototipos más prometedores fueron evaluados en base a su función biológica. En primer lugar, se realizaron ensayos de biocompatibilidad in vitro con modelos de epidermis humana reconstruida, obteniendo resultados positivos para todas las formulaciones testeadas y sin efectos irritantes. En segundo lugar, se realizaron estudios de retención en piel ex vivo usando microscopia de excitación de dos fotones y NVs marcadas con el fluoróforo rojo Nilo. Los resultados demostraron una mejora en la permeación en la piel del fluoróforo en comparación a la molécula libre. Finalmente, en esta Tesis se exploraron otras aplicaciones más allá de las cosméticas. Como prueba de concepto, los sistemas vesiculares de Sit y LGL se modificaron con componentes aceptados para uso farmacéutico. En particular, dos derivados del colesterol se han auto-ensamblado con el Sit y el LGL para formar NVs: un derivado con una molécula del polímero PEG (colesterol-PEG600), y otro con una amina terciaria (DC-colesterol), para obtener, respectivamente, NVs estables no-iónicas o catiónicas. Para completar la prueba de concepto, se ha estudiado la integración de distintos fármacos en las NVs con DC-colesterol. Se han formulado el cannabidiol, el metotrexato y la hormona de crecimiento humana, cada una con una estructura química y características distintas. En resumen, los resultados obtenidos en esta Tesis presentan el desarrollo satisfactorio de una plataforma versátil de nanovesículas estables y homogéneas obtenidas con ingredientes de origen vegetal, para aplicaciones tópicas en la industria cosmética y farmacéutica.Delivery systems have been widely used in the last decades to enhance the efficacy and safety of drugs and active molecules. Vesicles are one of the most popular drug delivery options in pharmaceutical and healthcare applications. To overcome the limitations of the first vesicular systems, such as conventional liposomes, the research has led to finding novel compositions which increase the stability and tolerability of the vesicular formulations. Nonetheless, this search is a challenging process that depends on different factors such as the components used, the interactions between them or the dispersant media. This Industrial Thesis presents the development of new vesicular systems using plant based, biocompatible and biodegradable components as building blocks, for topical delivery in healthcare and cosmetic applications. The new delivery systems have been prepared using the DELOS process, a single-step methodology based on compressed fluids which is robust, scalable and with a low environmental impact. The vesicles were formed by the self-assembly of β-sitosterol (Sit) and alkyl polyglucoside surfactants, mainly lauryl glucoside (LGL) and lauryl glucose carboxylate (LGC). Different systems were developed and characterized by advanced techniques such as dynamic light scattering, cryo electron microscopy and small-angle X-ray scattering. With the objective to evaluate their role as delivery systems, several active ingredients of interest for dermocosmetic applications were formulated in the novel nanovesicles (NVs) of Sit, LGL and LGC. Small hydrophobic molecules like α-tocopherol (vitamin E), an antioxidant ingredient, and 7 dehydrocholesterol, a precursor of vitamin D, were efficiently loaded in the vesicles. Besides their physicochemical properties, the functionality of the payloads after formulation was also characterized proving that both maintained their activity once they were integrated in nanovesicles. Moreover, other types of active molecules were also tested as payloads, such as ascorbyl glucoside (vitamin C) and niacinamide (vitamin B3), both small hydrophilic molecules, and proteins such as basic fibroblast growth factor, which is a larger biomolecule. In view of their topical application, the most promising prototypes were assessed in terms of their biological performance. First, in vitro biocompatibility assays with reconstructed human epidermis showed positive results for all the systems tested, with non-irritant effects. Second, ex vivo skin retention studies using multiphoton microscopy and NVs labelled with the fluorophore Nile red demonstrated improved skin permeability of the poorly water soluble fluorophore in comparison with the free molecule. Finally, exploration of further applications beyond personal care and cosmetics were also evaluated in this Thesis. As a proof of concept, the vesicular systems based on Sit and LGL were tuned with components accepted for pharmaceutical usage. In particular, two derivatives of cholesterol were self-assembled with Sit and LGL to form nanovesicles: a PEG polymer moiety (cholesterol-PEG600) and an ionizable derivative with a tertiary amine (DC cholesterol), which allowed to obtain stable non-ionic or cationic systems, respectively. To complete the proof of concept, the ability to integrate different drug molecules was evaluated for NVs with DC-cholesterol. Cannabidiol, methotrexate and human growth hormone, each payload with different chemical structure and characteristics, were integrated. Overall, the results obtained in this Thesis point to the successful development of an attractive and versatile platform, based on stable and homogeneous nanovesicles composed of plant-derived ingredients, for topical delivery in dermocosmetic, healthcare and pharmaceutical industries

The challenges to the Rule of Law in the European Union. The cases of Poland and Hungary

L'estat de dret i la independència judicial, els temes principals de recerca de l'estudi, es defineixen a nivell de la UE i del Consell d'Europa a través d'instruments legals i jurisprudència dels dos Tribunals Europeus: el Tribunal Europeu de Drets Humans i el Tribunal de Justícia de la Unió Europea. Aquests conceptes estan ben integrats a la legislació nacional dels països d'estudi, a Polònia i Hongria. Les constitucions hongareses i poloneses contenen disposicions pertinents sobre l'organització dels tribunals, la separació i l'equilibri dels poders governamentals, la independència judicial, etc. Tot i això, després de certes reformes en el sector judicial dutes a terme pels governs polonès i hongarès, la conformitat d'aquestes garanties de la norma de la llei i la independència judicial amb les normes de la UE i del Consell d'Europa es van tornar qüestionables.El estado de derecho y la independencia judicial, los principales temas de investigación del estudio, se definen a nivel de la UE y del Consejo de Europa a través de instrumentos legales y jurisprudencia de los dos Tribunales Europeos: el Tribunal Europeo de Derechos Humanos y el Tribunal de Justicia de la Unión Europea. Estos conceptos están bien integrados en la legislación nacional de los países de estudio, en Polonia y Hungría. Las constituciones húngara y polaca contienen disposiciones pertinentes sobre la organización de los tribunales, la separación y el equilibrio de los poderes gubernamentales, la independencia judicial, etc. Sin embargo, después de ciertas reformas en el sector judicial llevadas a cabo por los gobiernos polaco y húngaro, la conformidad de estas garantías de la norma de la ley y la independencia judicial con las normas de la UE y del Consejo de Europa se volvieron cuestionables.The rule of law and judicial independence, the main research topics of the study are defined on the EU and the Council of Europe level through legal instruments and case law of the two European Courts- the European Court of Human Rights and the Court of Justice of the European Union. These concepts are well integrated into the national legislation of the countries of study, in Poland and Hungary. Hungarian and Polish Constitutions contain relevant provisions on the organization of courts, separation and balance of governmental powers, judicial independence etc. However, after certain reforms in the judicial sector carried out by the Polish and Hungarian governments, the conformity of these guarantees of the rule of law and judicial independence with the EU and Council of Europe standards became questionable

Metal based nanoparticles for electrocatalytic and photocatalytic hydrogen production

La creixent preocupació pel problema de l'escalfament global, causat principalment pel consum massiu de combustibles fòssils tradicionals, ha generat un gran interès en explorar fonts d'energia renovable i sostenible. La fotosíntesi artificial és un camp que, inspirat per la natura, té com a objectiu emmagatzemar l'energia solar en enllaços químics, convertint-se així en una alternativa viable per produir energia neta. En un dels possibles processos, la descomposició de l'aigua, l'aigua s'oxida per produir oxigen i es redueix per produir hidrogen en les dues semireaccions involucrades en el procés. No obstant això, totes dues reaccions són cinèticament lentes, per tant, es requereixen catalitzadors eficients. El Capítol 1 del manuscrit proporciona l'estat actual del problema de l'escalfament global i algunes estratègies corresponents per resoldre'l, destacant la importància dels catalitzadors, especialment els nanocatalitzadors, en la producció d'hidrogen com a combustible solar renovable. En el Capítol 2 es llisten els principals objectius d'aquesta tesi, que inclouen el disseny i la caracterització dels materials, així com les seves proves (foto)(electro)catalítiques. En el Capítol 3, es sintetitzen nanopartícules (NPs) de Pt o/ i Ru mono i bimetàl·liques utilitzant òxid de grafè reduït dopat amb nitrogen (NH2-rGO) com a suport, i s'estudia la seva activitat electrocatalítica i estabilitat cap a la reacció d'evolució d'hidrogen (HER). En el Capítol 4, s'utilitza un lligand piridínic (3-fenilpiridina) com a estabilitzador per preparar NPs de Ru mitjançant el mètode organometàlic. L'activitat electrocatalítica en HER de les nanopartícules de Ru obtingudes s'ha comparat amb les de nanopartícules de Ru estabilitzades amb 2-fenilpiridina i 4-fenilpiridina per investigar els efectes dels tres lligands diferents. S'han estudiat diferències en termes de morfologia, estat d'oxidació superficial, propietats electrocatalítiques i estabilitat. En el Capítol 5, s'han dipositat NPs metàl·liques (Pt, Ni o Cu) a la superfície de dues macroestructures covalents de triazina (CTF) diferents mitjançant un enfocament organometàlic per produir catalitzadors fotocatalítics per a la HER. S'ha investigat l'efecte de les NPs metàl·liques i l'estructura del CTF en el rendiment fotocatalític. En el Capítol 6, els punts quàntics de carboni N,S (N,S-CD) s'han utilitzat com a interfícies per incorporar NPs de Pt i punts quàntics de tipus core-shell CdSe@ZnS per construir una nanoestructura orgànico-inorgànica mitjançant una síntesi en "un sol pas". Els sistemes híbrids CD/QD/Pt obtinguts han revelat un potencial d'activitat catalítica multitasca no només en fotoelectrocatalisi (HER fotoelectrocatalítica) sinó també en sonocatàlisi (degradació sonocatàlitica de contaminants de l'aigua). Finalment, al Capítol 7 es presenten les principals conclusions d'aquest treball de doctorat.La creciente preocupación por el problema del calentamiento global, causado principalmente por el consumo masivo de combustibles fósiles, ha generado un gran interés en explorar fuentes de energía renovable y sostenible. La fotosíntesis artificial es un campo que, inspirado por la naturaleza, tiene como objetivo almacenar la energía solar en enlaces químicos, convirtiéndose así en una alternativa viable para producir energía limpia. En uno de los posibles procesos, la descomposición del agua, el agua se oxida para producir oxígeno y se reduce para producir hidrógeno en las dos semirreacciones involucradas en el proceso. Sin embargo, ambas reacciones son cinéticamente lentas, por lo tanto, se requieren catalizadores eficientes. El Capítulo 1 del manuscrito proporciona el estado actual del problema del calentamiento global y algunas estrategias correspondientes para resolverlo, destacando la importancia de los catalizadores, especialmente los nanocatalizadores, en la producción de hidrógeno como combustible solar renovable. En el Capítulo 2 se enumeran los principales objetivos de esta tesis, que incluyen el diseño y la caracterización de los materiales, así como sus pruebas (foto)(electro)catalíticas. En el Capítulo 3, se sintetizan nanopartículas (NPs) de Pt o/ y Ru mono y bimetálicas utilizando óxido de grafeno reducido dopado con nitrógeno (NH2-rGO) como soporte, y se estudia su actividad electrocatalítica y estabilidad hacia la reacción de evolución de hidrógeno (HER). En el Capítulo 4, se utiliza un ligando piridínico (3-fenilpiridina) como estabilizador para preparar NPs de Ru mediante el método organometálico. La actividad electrocatalítica en HER de las nanopartículas de Ru obtenidas se ha comparado con las de nanopartículas de Ru estabilizadas con 2-fenilpiridina y 4-fenilpiridina para investigar los efectos de los tres ligandos diferentes. Se han estudiado diferencias en términos de morfología, estado de oxidación superficial, propiedades electrocatalíticas y estabilidad. En el Capítulo 5, se han depositado NPs metálicas (Pt, Ni o Cu) en la superficie de dos macroestructuras covalentes de triazina (CTF) diferentes mediante un enfoque organometálico para producir catalizadores fotocatalíticos para la HER. Se ha investigado el efecto de las NPs metálicas y la estructura del CTF en el rendimiento fotocatalítico. En el Capítulo 6, los puntos cuánticos de carbono N,S (N,S-CD) se han utilizado como interfaces para incorporar NPs de Pt y puntos cuánticos de tipo core-shell CdSe@ZnS para construir una nanoestructura orgánico-inorgánica a través de una síntesis en "un solo paso". Los sistemas híbridos CD/QD/Pt obtenidos han revelado un potencial de actividad catalítica multitarea no solo en fotoelectrocatalisis (HER fotoelectrocatalítica) sino también en sonocatálisis (degradación sonocatalítica de contaminantes del agua). Finalmente, en el Capítulo 7 se presentan las principales conclusiones de este trabajo de doctorado.The increasing concern in the global warming issue, which is mainly caused by massive consumption of traditional fossil fuels, has created great interest in exploring renewable and sustainable energy sources. Artificial photosynthesis is a field which, inspired by nature, has the aim of storing solar energy into chemical bonds, thus becoming a feasible alternative to produce clean energy. In one of the possible processes, water splitting, water is oxidized to oxygen and reduced to hydrogen in the two half reactions involved in the process. However, both reactions are kinetically slow, therefore, efficient catalysts are required. Chapter 1 of the manuscript provides the current state of the art of the global warming issue and some of the corresponding strategies to solve the problem, highlighting the importance of catalysts, especially nanocatalysts in the production of hydrogen as a renewable solar fuel. In Chapter 2, the main objectives of this thesis are listed, including the design, and characterization of the materials and as well as their (photo)(electro)catalytic testing. In Chapter 3, mono- and bimetallic Pt or/and Ru NPs are synthesized using nitrogen doped reduced graphene oxide (NH2-rGO) as support, and their electrocatalytic activity and stability towards hydrogen evolution reaction (HER) is studied. In Chapter 4, a N-donor pyridinic ligand (3-phenylpyridine) is used as stabilizer to prepare Ru NPs through the organometallic approach. The electrocatalytic activity towards the HER of obtained Ru nanoparticles has been compared to those of 2-phenylpyridine-stabilized and 4-phenylpyridine-stabilized Ru nanoparticles to investigate the effects of the three different ligands. Differences in terms of morphology, surface oxidation state, electrocatalytic properties and stability have been studied. In Chapter 5, metal NPs (Pt, Ni, or Cu) have been deposited on the surface of two different covalent triazine frameworks (CTF) via the organometallic approach to produce photocatalytic catalysts for HER. The effect of metal NPs and CTF structure on the photocatalytic performance has been investigated. In Chapter 6, N,S-Carbon Dots (N,S-CD) have been used as interfaces to incorporate Pt-NPs and CdSe@ZnS core-shell quantum dots to build an organic-inorganic nanostructure through a simple 'one-pot' synthetic approach. The obtained CD/QD/Pt hybrid systems have revealed multitasking catalytic activity potential towards not only in photoelectrocatalysis (photoelectrocatalytic HER) but also in sonocatalysis (sonocatalytic degradation of water contaminants). Finally, in Chapter 7 the main conclusions of this PhD piece of work are given

The role of urban biodiversity in green infrastructure multifunctionality and environmental justice

A mesura que les àrees urbanes s'amplien, el contacte de la societat amb la natura es veu cada vegada més limitat als paisatges urbans, destacant la necessitat d'explorar les interaccions entre la biodiversitat urbana, la infraestructura verda urbana (IVU) i el benestar humà. La distribució espacial, accessibilitat i qualitat dels ecosistemes urbans són aspectes importants a considerar en avaluar aquestes interaccions. Reconèixer el paper fonamental de la biodiversitat en el suport de la IVU i la provisió de serveis ecosistèmics (SE) és clau. Això requereix un examen dels patrons espacials de la IVU i les característiques ecològiques que contribueixen a la producció de SE. Aquesta tesi examina la contribució de la biodiversitat urbana a la multifuncionalitat de la infraestructura verda des d'una perspectiva de justícia ambiental. La investigació es desenvolupa a través de tres capítols empírics independents, cadascun construint sobre els resultats de l'anterior i corresponent a un objectiu de recerca específic, utilitzant Vitoria-Gasteiz, la "Capital Verda Europea", com a estudi de cas, una ciutat de mida mitjana i la capital del País Basc. El Capítol II va avaluar la natura salvatge urbana i la qualitat de l'hàbitat de la IVU com a predictors de la biodiversitat adaptats als ecosistemes urbans. Per aconseguir-ho, adapto eines de modelatge espacial tradicionalment utilitzades en àrees amb mínima influència humana. Aquesta adaptació desafia la perspectiva tradicional que considera que els usos del sòl urbans són només fonts de amenaces per als paisatges no dominats per humans, enlloc de reconèixer el seu potencial com a fonts d'hàbitat. Els resultats de Vitoria-Gasteiz revelen nivells variables de qualitat relativa de l'hàbitat i natura salvatge, amb espais verds petits i fragmentats que no aconsegueixen donar suport efectivament a la biodiversitat urbana en comparació amb espais verds periurbans més grans i menys fragmentats. El Capítol III se centra en com els factors socioeconòmics i històrics donen forma als ecosistemes urbans i regulen la provisió de SE des d'una perspectiva de justícia ambiental distributiva. Utilitzant dades de teledetecció i censos, examino els efectes de luxe i llegat en la biodiversitat urbana, la cobertura vegetal i els SE, considerant efectes interactius entre variables sociodemogràfiques i biofísiques d'interès. Els resultats suggereixen que la biodiversitat urbana està impulsada principalment per factors socioeconòmics relacionats amb l'"estatut" social (és a dir, una alta educació), mentre que la cobertura vegetal i els SE reguladors estan influïts per llegats de gestió en interacció amb la densitat de població. Al Capítol IV, analitzo els patrons espacials de desajustos en l'oferta i demanda de regulació tèrmica de SE, considerant factors sociodemogràfics i de salut que impulsen desigualtats en l'exposició a la calor urbana com a risc ambiental. Això implica la integració de dades de teledetecció, salut i sociodemogràfiques amb eines d'intel·ligència artificial i sistemes d'informació geogràfica. Els resultats destaquen disparitats en la vulnerabilitat al calor, amb una major exposició observada entre comunitats desafavorides en contrast amb àrees més acomodades. Els tres capítols proporcionen coneixement sobre la qualitat ecològica dels espais urbans, la influència dels factors socioeconòmics en la natura urbana i el seu impacte cascada en el benestar humà, a través de disparitats en l'accés als SE. En conjunt, aquests tres estudis empírics ofereixen idees valuoses sobre la influència de factors socioeconòmics i de salut en la qualitat i distribució dels ecosistemes urbans, i el seu impacte cascada en el benestar humà i l'accés desigual als SE. Aquests descobriments contribueixen a una millor comprensió dels sistemes socioecològics urbans, proporcionant idees pràctiques per avançar en les agendes urbanes cap a un desenvolupament urbà equitatiu, tant a Vitoria-Gasteiz com més enllà.Conforme las áreas urbanas se expanden, el contacto de la sociedad con la naturaleza se ve cada vez más limitado a los paisajes urbanos, resaltando la necesidad de explorar las interacciones entre la biodiversidad urbana, la infraestructura verde urbana (IVU) y el bienestar humano. La distribución espacial, accesibilidad y calidad de los ecosistemas urbanos son aspectos importantes a considerar al evaluar estas interacciones. Reconocer el papel fundamental de la biodiversidad en el soporte de la IVU y la provisión servicios ecosistémicos (SE) es clave. Esto requiere un examen de los patrones espaciales de la IVU y las características ecológicas que contribuyen a la producción de SE. Esta tesis examina la contribución de la biodiversidad urbana a la multifuncionalidad de la infraestructura verde desde una perspectiva de justicia ambiental. La investigación se desarrolla a través de tres capítulos empíricos independientes, cada uno construyendo sobre los resultados del anterior y correspondiendo a un objetivo de investigación específico, utilizando Vitoria-Gasteiz, la "Capital Verde Europea", como estudio de caso, una ciudad de tamaño mediano y la capital del País Vasco. El Capítulo II evaluó la naturaleza silvestre urbana y la calidad del hábitat de la IVU como predictores de la biodiversidad adaptados a los ecosistemas urbanos. Para lograr esto, adapto herramientas de modelado espacial tradicionalmente utilizadas en áreas con mínima influencia humana. Esta adaptación desafía la perspectiva tradicional que considera que los usos del suelo urbanos son solo fuentes de amenazas para paisajes no dominados por humanos, en lugar de reconocer su potencial como fuentes de hábitat. Los resultados de Vitoria-Gasteiz revelan niveles variables de calidad relativa del hábitat y naturaleza silvestre, con espacios verdes pequeños y fragmentados que no logran apoyar efectivamente la biodiversidad urbana en comparación con espacios verdes periurbanos más grandes y menos fragmentados. El Capítulo III se centra en cómo factores socioeconómicos e históricos dan forma a los ecosistemas urbanos y regulan la provisión de SE desde una perspectiva de justicia ambiental distributiva. Utilizando datos de teledetección y censos, examino los efectos de lujo y legado en la biodiversidad urbana, la cobertura vegetal y los SE, considerando efectos interactivos entre variables sociodemográficas y biofísicas de interés. Los hallazgos sugieren que la biodiversidad urbana está impulsada principalmente por factores socioeconómicos relacionados con el "estatus" social (es decir, una alta educación), mientras que la cobertura vegetal y los SE reguladores están influenciados por legados de gestión en interacción con la densidad de población. En el Capítulo IV, analizo los patrones espaciales de desajustes en la oferta y demanda de regulación térmica de SE, considerando factores sociodemográficos y de salud que impulsan desigualdades en la exposición al calor urbano como riesgo ambiental. Esto implica la integración de datos de teledetección, salud y sociodemográficos con herramientas de inteligencia artificial y sistemas de información geográfica. Los resultados destacan disparidades en la vulnerabilidad al calor, con una mayor exposición observada entre comunidades desfavorecidas en contraste con áreas más acomodadas. Los tres capítulos proporcionan conocimiento sobre la calidad ecológica de los espacios urbanos, la influencia de los factores socioeconómicos en la naturaleza urbana y su impacto en cascada en el bienestar humano, a través de disparidades en el acceso a los SE. En conjunto, estos tres estudios empíricos ofrecen ideas valiosas sobre la influencia de factores socioeconómicos y de salud en la calidad y distribución de los ecosistemas urbanos, y su impacto cascada en el bienestar humano y el acceso desigual a los SE. Estos hallazgos contribuyen a una mejor comprensión de los sistemas socioecológicos urbanos, proporcionando ideas prácticas para avanzar en las agendas urbanas hacia un desarrollo urbano equitativo, tanto en Vitoria-Gasteiz como más allá.As urban areas expand, societal contact with nature is increasingly confined to cityscapes, highlighting the need to explore the interactions between urban biodiversity, urban green infrastructure (UGI), and human well-being. The spatial distribution, accessibility, and quality of urban ecosystems are important aspects to consider when assessing these interactions. For instance, the uneven distribution and accessibility to UGI may cause many urban dwellers to live in poor environmental conditions with direct impacts on their health. Recognising the critical role of biodiversity in supporting UGI and the provision of ecosystem services (ES) is key. This requires an examination of the UGI spatial patterns and ecological characteristics that contribute to the production of ES. This dissertation examines the contribution of urban biodiversity to the multifunctionality of green infrastructure from an environmental justice perspective. The research unfolds through three standalone empirical chapters, each building on the outcomes of the previous one and corresponding to a specific research objective, using the "European Green Capital" Vitoria-Gasteiz, a middle-sized city and the capital of the Basque Country, as a case study. Chapter II assessed the urban wildness and habitat quality of UGI as biodiversity predictors adapted to urban ecosystems. To achieve this, I adapt spatial modelling tools traditionally used in areas with minimal human influence. This adaptation challenges the traditional perspective that considers urban land uses solely sources of threats to non-human-dominated landscapes, rather than recognising their potential as habitat sources. Results from Vitoria-Gasteiz reveal varying levels of relative habitat quality and wildness, with small and fragmented green spaces failing to effectively support urban biodiversity compared with larger and less fragmented periurban green spaces. Chapter III focuses on how socioeconomic and historical factors shape urban ecosystems and regulate ES provision from a distributive environmental justice perspective. Using remote sensing and census data, I examine luxury and legacy effects on urban biodiversity, vegetation cover, and ES, considering interactive effects among sociodemographic and biophysical variables of interest. Findings suggest that urban biodiversity is primarily driven by socioeconomic factors related to social "status" (i.e. high education attainment), whereas vegetation cover and regulating ES are influenced by management legacies in interaction with population density. In Chapter IV, I analyse the spatial patterns of temperature regulation ES supply and demand mismatches, considering sociodemographic and health factors driving distributional inequalities in exposure to urban heat as an environmental hazard. The results highlight the existence of disparities in access to nature-based urban cooling and hence the level of heat vulnerability, with increased exposure observed in areas inhabited by disadvantaged communities in contrast to more affluent areas. Together, these three empirical studies provide valuable insights into the influence of socioeconomic and health factors on urban ecosystem quality and distribution, and their cascading impact on human well-being and inequitable access to ES. These findings contribute to a better understanding of urban socio-ecological systems, providing actionable insights for advancing urban agendas towards equitable urban development in both Vitoria-Gasteiz and beyond

Soil microbial functional profiles of P-cycling reveal drought-induced constraints on P-transformation in a hyper-arid desert ecosystem

Altres ajuts: the Fundación Ramón Areces Project CIVP20A6621.Soil water conditions are known to influence soil nutrient availability, but the specific impact of different conditions on soil phosphorus (P) availability through the modulation of P-cycling functional microbial communities in hyper-arid desert ecosystems remains largely unexplored. To address this knowledge gap, we conducted a 3-year pot experiment using a typical desert plant species (Alhagi sparsifolia Shap.) subjected to two water supply levels (25 %-35 % and 65 %-75 % of maximum field capacity, MFC) and four P-supply levels (0, 1, 3, and 5 g P m−2 y−1). Our investigation focused on the soil Hedley-P pool and the four major microbial groups involved in the critical phases of soil microbial P-cycling. The results revealed that the drought (25 %-35 % MFC) and no P-supply treatments reduced soil resin-P and NaHCO3-Pi concentrations by 87.03 % and 93.22 %, respectively, compared to the well-watered (65 %-75 % MFC) and high P-supply (5 g P m−2 y−1) treatments. However, the P-supply treatment resulted in a 12 %-22 % decrease in the soil NH4+-N concentration preferred by microbes compared to the no P-supply treatment. Moreover, the abundance of genes engaged in microbial P-cycling (e.g. gcd and phoD) increased under the drought and no P-supply treatments (p < 0.05), suggesting that increased NH4+-N accumulation under these conditions may stimulate P-solubilizing microbes, thereby promoting the microbial community's investment in resources to enhance the P-cycling potential. Furthermore, the communities of Steroidobacter cummioxidans, Mesorhizobium alhagi, Devosia geojensis, and Ensifer sojae, associated with the major P-cycling genes, were enriched in drought and no or low-P soils. Overall, the drought and no or low-P treatments stimulated microbial communities and gene abundances involved in P-cycling. However, this increase was insufficient to maintain soil P-bioavailability. These findings shed light on the responses and feedback of microbial-mediated P-cycling behaviors in desert ecosystems under three-year drought and soil P-deficiency

Study of Pulmonary and Systemic Markers for the Characterization of the Immune Response against Mycobacterium tuberculosis in mouse and human

La tuberculosi (TB) és una de les principals causes de mort infecciosa a tot el món. Si volem millorar els esforços diagnòstics i terapèutics actuals, és indispensable adquirir un coneixement més profund de la complexa resposta immune contra l'agent causant, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Aquesta tesi investiga la presència de biomarcadors de protecció i malaltia en mostres de sang perifèrica i de pulmó, analitzant els canvis en l'expressió de marcadors de superfície cel·lulars o en la presència de certes poblacions cel·lulars de la resposta immune contra Mtb. En aquest treball es combinen projectes que analitzen dades de mostres humanes i de ratolins. Les mostres de sang humanes van ser recollides de participants amb infecció latent o malaltia de TB a l'inici i al final del tractament. Mitjançant citometria de flux convencional, es va estudiar l'expressió de biomarcadors de maduració i activació immune en limfòcits després de la reexposició a l'antigen micobacterià. Els nostres resultats demostren que els nivells d'expressió d'aquests biomarcadors són capaços de caracteritzar la infecció latent per TB (LTBI) i la malaltia de TB, i es correlacionen amb l'èxit del tractament, confirmant el gran potencial de l'assaig com a biomarcador de TB. D'altra banda, les mostres de pulmó i sang d'un model de ratolí C57BL/6J infectat aerogènicament amb una dosi baixa de Mtb, ens han donat l'oportunitat d'estudiar el perfil immunològic de forma exhaustiva de la resposta immune local i sistèmica mitjançant citometria espectral. Les nostres dades mostren una acumulació d'un subgrup protector de cèl·lules, les cèl·lules residents de memòria tissular, al parènquima pulmonar, juntament amb cèl·lules CD4 Th i altres tipus cel·lulars vinculats a perfils inflamatoris reduïts. A més, els anàlisis multiparamètrics no supervisats destaquen la compartimentalització de la resposta immune després de la vacunació amb BCG, desencadenant una activitat proinflamatòria Th17 a la sang i una resposta més moderada de cèl·lules T amb un augment de cèl·lules B activades al pulmó. Estratègies alternatives de vacunació amb BCG, com l'exposició al fluid alveolar dels humans, han millorat encara més alguns dels mecanismes immunitaris desencadenats per la vacunació amb BCG. Aquesta tesi també inclou un capítol dedicat a la caracterització del sistema immune en condicions fisiològiques d'un nou model de ratolí, el Collaborative Cross (CC), que permet estudiar la contribució genètica de cada soca de ratolí a la susceptibilitat a Mtb i als mecanismes de protecció de la BCG, revelant la seva alta heterogeneïtat i la seva presència generalment menor de poblacions de cèl·lules immunes madures i actives en comparació amb la soca de referència, C57BL/6J. Aquests resultats subratllen el potencial dels ratolins CC per abordar la resistència a la malaltia i l'eficàcia de la vacuna en futurs estudis sobre TB explorant una selecció de soques CC d'interès. Els estudis descrits en aquesta tesi ajuden a millorar els camps de diagnòstic i la immunologia de la TB.La tuberculosis (TB) es una de las principales causas de muerte a nivel mundial por infección por un único patógeno. Tener mayor conocimiento sobre la respuesta inmune que provoca el agente etiológico de la enfermedad, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), es necesario para mejorar el diagnóstico y la terapia para la tuberculosis. Esta tesis explora la presencia de biomarcadores protección y enfermedad en muestras de sangre periférica y pulmón, investigando cambios en la expresión de biomarcadores celulares o en la presencia de ciertas poblaciones celulares típicas de la respuesta inmune contra Mtb. En este trabajo se combinan proyectos que analizan datos de muestras humanas y de ratón. Las muestras de sangre humana, provenientes de individuos con infección latente o enfermedad tuberculosa al inicio y al final del tratamiento, nos permitieron estudiar mediante citometría de flujo convencional la expresión de biomarcadores de maduración y activación celular en linfocitos tras su re-exposición a antígenos micobacterianos. Nuestros resultados demuestran que los niveles de expresión de estos biomarcadores son capaces de caracterizar la infección latente por tuberculosis (LTBI) y la enfermedad tuberculosa, y se correlacionan con el éxito del tratamiento, confirmando su gran como biomarcador de la TB. Por otro lado, las muestras de tejido pulmonar y sangre de ratones C57BL/6J infectados por exposición inhalatoria con Mtb nos brindaron la oportunidad de realizar un perfil inmunológico profundo de la respuesta inmune local y sistémica mediante citometría espectral. Nuestros datos muestran una acumulación de un subconjunto protector de células, las células de memoria residentes en tejidos, en el parénquima pulmonar, junto con células Th CD4 y otros tipos celulares vinculados a perfiles inflamatorios reducidos. Además, los análisis multiparamétricos no supervisados destacan la alta compartimentalización de la respuesta inmune después de la vacunación con BCG, desencadenando actividad proinflamatoria de células Th17 en sangre y una respuesta de células T más moderada, con un aumento de células B activadas, en el pulmón. Estrategias alternativas de vacunación con BCG, como la exposición al líquido alveolar humano, potenciaron aún más algunos de los mecanismos inmunitarios inducidos por la vacunación con BCG. Esta tesis también incluye un capítulo dedicado a la caracterización del sistema inmunológico en condiciones fisiológicas de un nuevo modelo murino, el Collaborative Cross (CC), que permite estudiar las contribuciones genéticas a la susceptibilidad a Mtb y los mecanismos de protección de la vacuna BCG, revelando su alta heterogeneidad y una presencia generalmente menor de poblaciones de células inmunes maduras y activas en comparación con los ratones C57BL/6J. Estos hallazgos subrayan el potencial de los ratones CC para abordar la resistencia a enfermedades y la eficacia de las vacunas en estudios futuros de TB, explorando una selección de cepas CC de interés. Los estudios descritos en esta tesis contribuyen a cerrar la brecha en el campo del diagnóstico y la inmunología de la TB.Tuberculosis (TB) is one of the leading causes of infectious death worldwide, and a deeper knowledge in the intricate immune response against the causative agent, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is necessary if we want to improve current diagnostic and therapeutic efforts. This thesis investigates the presence of biomarkers of protection and disease in peripheral blood and lung samples, looking into changes on the expression of cell surface markers or on the presence of certain cell populations from the immune response against Mtb. In this work we combine projects that analyze data from human and mouse samples. The human blood samples, collected from participants with latent infection or TB disease at the beginning and end of treatment, allowed us study via conventional flow cytometry the expression of immune cell maturation and activation biomarkers on lymphocytes after mycobacterial antigen re-exposure. Our results demonstrate that the levels of expression from these biomarkers are able to characterize LTBI and TB disease and correlate with treatment success, confirming the great potential of the assay as a TB biomarker. On the other hand, murine lung and blood tissue from a C57BL/6J mouse model that was aerogenically infected with a low dose of Mtb, gave us the opportunity to perform a deep immune profiling of the local and systemic immune response via spectral cytometry. Our data shows an accumulation of a protective subset of cells, the tissue resident memory cells, in the lung parenchyma, together with Th CD4 cells and other cell types linked to reduced inflammatory profiles. Additionally, unsupervised multiparametric analyses highlights how highly compartmentalized the immune response is after BCG vaccination, triggering pro-inflammatory Th17 activity in the blood and a more moderate T cell response with increase in activated B cells in the lung. Alternative strategies of BCG vaccination, such as exposing it to the Alveolar Lining Fluid of the humans, further enhanced some of the immune mechanisms elicited by BCG vaccination. This thesis also includes a chapter revolving on the characterization of the immune system at physiological conditions of a novel mouse model, the Collaborative Cross (CC), that allows to study the genetic contributions to Mtb susceptibility and BCG protection mechanisms, revealing their high heterogeneity and their generally lower presence of mature and active immune cell populations compared to C57BL/6J. These findings underscore the potential of CC mice for addressing disease resistance and vaccine efficacy in future TB studies exploring a selection of CC strains of interest. The studies described in this thesis help close the gap in the field of TB diagnostics and immunology

Identification of mitochondrial epigenetic signatures for the prognosis of Alzheimer's disease

El diagnòstic i la predicció de la Malaltia d'Alzheimer (MA) en les primeres etapes es basa principalment en símptomes clínics. Les tècniques d'imatge neurofuncional aprovades per la FDA i els biomarcadors del líquid cefalorraquidi poden ajudar en la detecció i el diagnòstic, però la implementació clínica d'aquestes tècniques està limitada per la disponibilitat, el cost i la invasivitat. Preveure la progressió a la demència de la MA (DMA) en el deteriorament cognitiu lleu (DCL) és crucial. Els criteris d'inclusió actuals per als assajos clínics destinats a fàrmacs per a la MA requereixen pacients DCL amb una puntuació de l'Escala Clínica de Demencia igual a 0,5, i una Tomografía PET beta amiloide (Aβ) positiva. No obstant, la sensibilitat i especificitat de la Tomografia PET Aβ per a la progressió de la fase de DCL a MA mostra variabilitat depenent de l'estudi clínic. A més, la inclusió de falsos positius perjudica la taxa d'èxit dels assajos clínics. Actualment, s'està impulsant l'exploració de nous biomarcadors basats en sang independents d'Aβ i tau. Diversos estudis han reportat disfunció mitocondrial en la MA a nivells cerebrals i sistèmics. Aquesta tesi doctoral presenta el desenvolupament del MAP-AD® Test, basat en l'anàlisi de Seqüenciació de Nova Generació de biomarcadors epigenètics patentats de l'ADN mitocondrial (ADNmt) presents en la sang de pacients DCL. Proporciona un percentatge de progressió a DMA, indicant la possibilitat de desenvolupament de la malaltia. A més, proporciona la validació analítica del producte per obtenir la documentació tècnica necessària per demostrar la conformitat d'un dispositiu de diagnòstic in vitro davant les agències reguladores. L'estudi clínic del MAP-AD® Test es duu a terme utilitzant ADN de sang total de dos grups d'individus: individus cognitivament normals i pacients amb DCL, aquests classificats en dues categories: Progressats i No Progressats a DMA. L'estudi inclou un total de 600 individus reclutats de diferents cohorts. El conjunt de dades original es divideix aleatòriament en dos subconjunts: entrenament i prova. El procés de mostreig aleatori es condueix dins de cada grup. Les característiques analitzades cobreixen dues fonts principals d'informació: variables clíniques recollides (edat, puntuació CDR-SOB i genotip ApoE) i mesures de metilació generades internament utilitzant els Oligos del MAP-AD® Test. El Random Forest és el mètode d'aprenentatge supervisat emprat per construir el model. Els resultats del rendiment clínic en la classificació de pacients amb DCL progressats a DMA demostren una sensibilitat de 0,951 i una especificitat de 0,707; un valor predictiu positiu de 0,773; un valor predictiu negatiu de 0,932; i un F1-score de 0,853. El model exhibeix un equilibri sòlid entre identificar amb precisió els casos positius i la seva precisió predictiva global. La corba AUC-ROC per DCL Progressat vs. Altres en el subconjunt de prova és 0,903 (0,847-0,959). Aquests resultats demostren el paper important de les marques mitoepigenètiques en sang en la predicció de la progressió de DCL a DMA. La validació analítica estudia l'estabilitat de l'ADNmt en diversos escenaris. Els resultats indiquen que les mostres de sang emmagatzemades a temperatura ambient mantenen els nivells de metilació. A més, la metilació de l'ADN es manté estable en l'ADN extret sotmès fins a 12 cicles de congelació-descongelació. L'ADN tractat amb bisulfit es pot emmagatzemar fins a dos mesos a -20 o -80°C sense afectar els resultats de metilació de l'ADNmt. L'estudi també avalua la variabilitat de les mesures de metilcitosina en condicions de repetibilitat i reproductibilitat. Els resultats demostren que l'assaig és repetible i reproduïble, sense variabilitat significativa entre diferents operadors, instal·lacions i lots. La validació analítica confirma el rendiment de l'assaig i dona suport a la finalitat prevista del dispositiu MAP-AD® Test en la mesura precisa de la metilació de l'ADNmt.El diagnóstico y la predicción de la Enfermedad de Alzheimer (EA) en las primeras etapas se basa en síntomas clínicos. Las técnicas de imagen neurofuncional aprobadas por la FDA y los biomarcadores del líquido cefalorraquídeo ayudan en la detección y el diagnóstico, pero la implementación clínica de estas técnicas está limitada por la disponibilidad, el costo y la invasividad. Prever la progresión a la demencia de la EA (DEA) en el deterioro cognitivo leve (DCL) es crucial. Los criterios de inclusión para los ensayos clínicos de fármacos de la EA requieren pacientes DCL con una puntuación en la Escala Clínica de Demencia igual a 0,5 y una Tomografía PET de beta amiloide (Aβ) positiva. Sin embargo, la sensibilidad y especificidad de la Tomografía PET Aβ para la progresión de la fase de DCL a EA muestra variabilidad entre estudios. Además, la inclusión de falsos positivos perjudica la tasa de éxito de estos. Actualmente, se estan explorando nuevos biomarcadores basados en sangre independientes de Aβ y tau. Varios estudios han reportado disfunción mitocondrial en la EA a niveles cerebrales y sistémicos. Esta tesis doctoral presenta el desarrollo del MAP-AD® Test, basado en el análisis de Secuenciación de Nueva Generación de biomarcadores epigenéticos patentados del ADN mitocondrial (ADNmt) presentes en la sangre de pacientes DCL. Proporciona un porcentaje de progresión a DEA, indicando la posibilidad de desarrollo de la enfermedad. Además, proporciona la validación analítica del producto para obtener la documentación técnica necesaria para demostrar la conformidad de un dispositivo de diagnóstico in vitro ante las agencias reguladoras. El estudio clínico del MAP-AD® Test se llevó a cabo utilizando ADN de sangre total de dos grupos de individuos: individuos cognitivamente normales y pacientes con DCL, estos clasificados en dos categorías: Progresados y No Progresados a DEA. El estudio incluye un total de 600 individuos reclutados de diferentes cohortes. El conjunto de datos original se divide aleatoriamente en dos subconjuntos: entrenamiento y prueba. El proceso de muestreo aleatorio se lleva a cabo dentro de cada grupo. Las características analizadas cubren dos fuentes principales de información: variables clínicas recogidas (edad, puntuación CDR-SOB y genotipo ApoE) y medidas de metilación generadas internamente utilizando los Oligos del MAP-AD® Test. Random Forest es el método de aprendizaje supervisado utilizado para construir el modelo. Los resultados del rendimiento clínico en la clasificación de pacientes con DCL progresados a DEA muestran una sensibilidad de 0,951 y una especificidad de 0,707; un valor predictivo positivo de 0,773; un valor predictivo negativo de 0,932; y un F1-score de 0,853. El modelo exhibe un equilibrio sólido entre identificar con precisión los casos positivos y su precisión predictiva global. La curva AUC-ROC para DCL Progresado vs. Otros en el subconjunto de prueba es 0,903 (0,847-0,959). Estos resultados demuestran el papel importante de las marcas mitoepigenéticas en sangre en la predicción de la progresión de DCL a DME. El estudio de validación analítica estudia la estabilidad del ADNmt en diversos escenarios. Los resultados indican que las muestras de sangre almacenadas a temperatura ambiente mantienen los niveles de metilación. Además, la metilación del ADN se mantiene estable en el ADN extraído sometido hasta 12 ciclos de congelación-descongelación. El ADN tratado con bisulfito se puede almacenar hasta dos meses a -20 o -80°C sin afectar los resultados de metilación del ADNmt. El estudio evalúa la variabilidad de las medidas de metilcitosina en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, mostrando que MAP-AD® Test es consistente, sin variabilidad significativa entre operadores, instalaciones y lotes. La validación analítica confirma el rendimiento de la prueba y apoya la finalidad prevista del dispositivo MAP-AD® Test en la medición precisa de la metilación del ADNmt.The diagnosis and prediction of early Alzheimer's Disease (AD) is largely guided by clinical symptoms. FDA-approved neuroimaging and Cerebrospinal Fluid biomarkers can aid in detection and diagnosis, but the clinical implementation of these testing modalities is limited by availability, cost, and invasiveness. The prediction of progression to Alzheimer Disease Dementia (ADD) at the Mild Cognitive Impairment (MCI) stage is an unmet medical need. The current inclusion criteria for clinical trials destinated to AD drug development is MCI patients with a Clinical Dementia Rating equal to 0,5, and a positive Aβ.PET scan. However, the sensitivity and specificity of the Aβ-PET scan for the progression of MCI stage to AD show variability depending on the clinical study. In addition, the inclusion of false positives impairs the success rate of clinical trials. Discoveries in the field of AD are evolving, driving the exploration of new blood-based biomarkers independent from and tau. Several studies have reported mitochondrial dysfunction in AD at cerebral and systemic levels. This doctoral thesis presents the development of a cutting-edge diagnostic technology, the MAP-AD® Test, based on Next-Generation Sequencing analysis of patented mitochondrial DNA (mtDNA) epigenetic biomarkers present in the blood of patients with MCI. It provides a percentage of progression to ADD using a machine learning approach, indicating the possibility of disease development. Additionally, it provides the analytical validation of the product to obtain the technical documentation required to demonstrate the conformity of an in vitro diagnostic device to European and American Regulatory Agencies. The MAP-AD® Test clinical study was conducted using DNA from whole blood collected from two groups of subjects: Cognitively normal subjects, and MCI patients, that were classified in two categories: Progressed and Non-Progressed to ADD. A total of 600 subjects recruited from different cohorts were included in the study. The original sample dataset was randomly split into two main subsets: training and testing. The random sampling process was driven within each group to preserve the overall class distribution of the data. The features analysed covered two principal sources of information: collected clinical variables (age, CDR-SOB score, and ApoE genotype), and in-house generated methylation measures using the MAP-AD® Test Oligos. Random Forest was the supervised learning method employed to construct the model. The results of the clinical performance on classifying MCI patients progressed to ADD demonstrated a sensitivity of 0,951 and a specificity of 0,707; a Positive Predicted Value equal to 0,773; a Negative Predicted Value equal to 0,932; and a F1-score equal to 0,853. The model exhibits a solid balance between accurately identifying positive cases and its overall prediction accuracy. The AUC-ROC curve for MCI Progressed vs. Others in the testing subset is 0,903 (95% CI 0,847-0,959). These findings demonstrate the role of blood mitoepigenetic signatures in predicting the progression from MCI to ADD. The analytical validation study aimed to analyse the stability of mtDNA in several scenarios. Key findings from DNA methylation data indicate that blood samples stored at room temperature maintained methylation levels. Further, DNA methylation remained stable in extracted DNA subjected to up to 12 freeze-thaw cycles. Additionally, bisulfite-treated DNA could be stored for up to two months at -20°C or -80°C without affecting mtDNA methylation results. The study also evaluated the variability of methylcytosine measurements under repeatability and reproducibility conditions. Results showed that the assay is repeatable and reproducible, with no significant variability within a run or across different operators, facilities, and instrument sets. Overall, the analytical validation confirmed the performance of the assay, supporting the intended purpose of the device an

Yellow-in-the-dark mutants meet the omics era to unravel light and retrograde signaling in the green algae Chlamydomonas reinhardtii

Durant la desetiolació les plàntules passen d'un desenvolupament escotomorfogènic (hipocòtil allargat, cotilèdons tancats i ganxo apical, limitat desenvolupament de les arrels) a fotomorfogènic (hipocòtil curt, cotilèdons oberts i expandits, creixement lateral de les arrels). Durant aquesta transformació, plasts no fotosintètics (anomenats etioplasts) que estan adaptats a la foscor es transformen en cloroplasts fotosintètics i completament funcionals una vegada que perceben llum. Aquest procés està regulat per mecanisme de senyalització per llum força complex i sofisticat que involucra fotoreceptors (principalment fitocroms i criptocroms) i diversos reguladors transcripcionals essencials (PIF, HY5, GLK i proteïnes B-BOX). A més, el mateix plast pot actuar com un detector de senyals ambientals i enviar senyals retrògrads (RS) al nucli per afinar-ne el desenvolupament durant la desetiolació. La manera com això passa segueix sent un misteri, però s'ha demostrat que GUN1 és un regulador central d'aquesta via i que llum i senyals dels cloroplasts convergeixen per regular la biogènesi dels cloroplasts i altres aspectes del desenvolupament de les plàntules, com la separació dels cotilèdons. La desetiolació s'ha estudiat tradicionalment en plantes angiospermes, ja que a causa de la capacitat d'etiolar en foscor. Les gimnospermes, en canvi, poden sintetitzar clorofil·la a la foscor i sempre tenen un cloroplast desenvolupat. Curiosament, els mutants yellow-in-the-dark (i) de l'alga verda Chlamydomonas reinhardtii no poden sintetitzar clorofil·les a la foscor i formen cloroplasts indiferenciats sense capacitat quan les cèl·lules es mantenen en foscor. Però quan aquestes s'exposen a llum poden restaurar completament un cloroplast funcional. Això és sorprenent, ja que aquestes manquen dels components essencials de la senyalització per llum i retrògrada en angiospermes, inclosos els PIF, GLK i GUN1. En aquest treball, desenvolupem un sistema de desetiolació basat en mutants i que ens va permetre estudiar i caracteritzar transcriptòmicament els principals esdeveniments regulats per llum i senyalització retrògrada. En comparar el transcriptoma d'aquestes cèl·lules amb Arabidopsis es va veure que llum i senyalització retrògrada regulen processos biològics similars a les dues espècies. Descobrim que els gens associats a la fotosíntesi ja estan acumulats en nivells alts en cèl·lules etiolades i són lleugerament induïts per la llum, mentre que la senyalització retrògrada reprimeix fortament però transitòriament aquests gens. Els nostres resultats suggereixen que els PIFs i GLKs van evolucionar en plantes angiospermes per conferir un major grau de regulació a aquests gens, i que GUN1 podria haver evolucionat per mantenir reprimits aquests gens. A més, les nostres dades fisiològiques i transcriptòmiques suggereixen que la biogènesi del cloroplast ocorre en dues fases diferents en aquests mutants i de manera similar al que es descriu en plantes angiospermes. A més, mitjançant la construcció de xarxes de coexpressió gènica, identifiquem nous factors de transcripció candidats a regular la biogènesi de cloroplast a Chlamydomonas. Aquest treball exposa una nova mirada sobre la regulació de llum i retrògrada durant la desetiolació.Durante la desetiolación las plántulas pasan de un desarrollo escotomorfogénico (hipocótilo alargado, cotiledones cerrados y gancho apical, limitado desarrollo de las raíces) a fotomorfogénico (hipocótilo corto, cotiledones abiertos y expandidos, crecimiento lateral de las raíces). Durante esta transformación, plastos no fotosintéticos (denominados etioplastos) que están adaptados a oscuridad se transforman en cloroplastos fotosintéticos y completamente funcionales una vez que perciben luz. Este proceso está regulado por mecanismo de señalización por luz bastante complejo y sofisticado que involucra fotorreceptores (principalmente fitocromos y criptocromos) y varios reguladores transcripcionales esenciales (PIF, HY5, GLK y proteínas B-BOX). Además, el propio plasto puede actuar como un detector de señales ambientales y enviar señales retrógradas (RS) al núcleo para afinar el desarrollo del mismo durante la desetiolación. La manera en la que esto ocurre sigue siendo un misterio, pero se ha demostrado que GUN1 es un regulador central de esta vía y que luz y señales de los cloroplastos convergen para regular la biogénesis de los cloroplastos y otros aspectos del desarrollo de las plántulas, como la separación de los cotiledones. La desetiolación se ha estudiado tradicionalmente en plantas angiospermas, ya que debido a su capacidad de etiolar en oscuridad. Las gimnospermas, en cambio, pueden sintetizar clorofila en la oscuridad y siempre tienen un cloroplasto desarrollado. Curiosamente, los mutantes yellow-in-the-dark (y) de la alga verde Chlamydomonas reinhardtii no pueden sintetizar clorofilas en la oscuridad y forman cloroplastos indiferenciados sin capacidad cuando las células se mantienen en oscuridad. Pero cuando estas se exponen a luz pueden restaurar completamente un cloroplasto funcional. Esto es sorprendente, ya que estas carecen de los componentes esenciales de las señalización por luz y retrógrada en angiospermas, incluidos los PIF, GLK y GUN1. En este trabajo, desarrollamos un sistema de desetiolación basado en mutantes y, que nos permitió estudiar y caracterizar transcriptómicamente los principales eventos regulados por luz y señalización retrógrada. Al comparar el transcriptoma de estas células con Arabidopsis se vio que luz y señalización retrógrada regulan procesos biológicos similares en ambas especies. Descubrimos que los genes asociados a la fotosíntesis ya están acumulados en niveles altos en células etioladas y son ligeramente inducidos por la luz, mientras que la señalización retrógrada reprime fuertemente pero transitoriamente estos genes. Nuestros resultados sugieren que los PIFs y GLKs evolucionaron en plantas angiospermas para conferir un mayor grado de regulación a estos genes, y que GUN1 podría haber evolucionado para mantener reprimidos estos genes. Además, nuestros datos fisiológicos y transcriptómicos sugieren que la biogénesis del cloroplasto ocurre en dos fases distintas en estos mutantes y de manera similar a lo descrito en plantas angiospermas. Además, mediante la construcción de redes de co-expresión génica, identificamos nuevos factores de transcripción candidatos en regular la biogénesis de cloroplasto en Chlamydomonas. Este trabajo expone una nueva mirada sobre la regulación de luz y retrógrada durante la desetiolación.Seedling de-etiolation is characterized by the transition from skotomorphogenesis (elongated hypocotyl, presence of hook and closed cotyledons, limited root growth) to photomorphogenesis (short hypocotyl, open and expanded cotyledons, lateral root growth); during this shift, dark-adapted non-photosynthetic plastids (etioplasts) transform into fully functional photosynthetic chloroplasts upon transfer to light. This process is regulated by complex but exquisite light signaling pathways that involve photoreceptors (mainly phytochromes and cryptochromes), and several key transcriptional regulators (PIFs, HY5, GLKs and B-BOX proteins. In addition, the plastid itself can act as an environmental sensor and send retrograde signals (RS) to the nucleus to fine-tune its development during de-etiolation. How RS are sent to the nucleus remains a mystery, but it has been shown that GUN1 is a central regulator of this pathway. Importantly, light and chloroplasts signals converge to regulate chloroplast biogenesis and other aspects of seedling development such as cotyledon separation. De-etiolation has been traditionally studied in angiosperm plants, thanks to their ability to etiolate in the dark. In contrast, gymnosperms can synthesize chlorophyll in darkness and always feature a fully developed chloroplast. Interestingly, yellow-in-the-dark (y) mutants of the green microalgae Chlamydomonas reinhardtii are unable to synthesize chlorophylls in the dark and form undifferentiated chloroplasts with no photosynthetic activity under prolonged darkness. Upon exposure to light, they are able to fully restore a functional chloroplast. Remarkably, they lack essential components of light and RS pathways in angiosperms, including PIFs, GLKs and GUN1. In this work, we developed a y mutant based de-etiolation system that allowed us to transcriptomically study and characterize main light and RS events. Comparative analysis with Arabidopsis showed that light and RS regulate similar biological processes in both species. We found that photosynthesis-associated genes are already accumulated at high levels in y etiolated cells and are slightly induced by light, while RS strongly but transiently repress these genes. Our results suggest that PIFs and GLKs evolved in angiosperm plants to confer a higher degree of regulation to these genes, and that GUN1 might have evolved to keep sustained repression of these genes. Moreover, combined physiological and transcriptomic data suggests that chloroplast biogenesis is achieved in two distinct phases in y mutants, similarly to angiosperm plants. Finally, by building gene co-expression networks we identified potential novel transcription factors that regulate chloroplast biogenesis in Chlamydomonas. This work provides new insights in the regulation of light and RS during de-etiolation