Molecular-phylogenetic analysis of Palaearctic species of the genus Limnius (Coleoptera: Elmidae)

Rod Limnius Illiger, 1802 pripada porodici vodenih kornjaša Elmidae (hrv. slapoljubi). Do sada je unutar roda Limnius opisano 14 vrsta rasprostranjenih u palearktičkom području, a preliminarne molekularne analize ukazuju na složene sistematske odnose unutar ovoga roda koji zahtijevaju dodatna istraživanja. U sklopu ovog rada odredila sam filogenetske odnose između vrsta unutar roda Limnius za uzorke prikupljene u zapadno-palearktičkoj regiji upotrebom mitohondrijskog gena COI te nuklearnih gena ArgK, H3, CAD i ITS1. Za pojedinačne markere kao i za kombinacije setova markera su konstruirana filogenetska stabla raznim filogenetskim metodama. Rezultati su uglavnom usporedivi između upotrijebljenih setova podataka, no najbolju rezoluciju daje kombinirani set svih molekularnih markera. Dobiveni rezultati potvrđuju prethodne filogenetske hipoteze temeljene na morfologiji o bliskim odnosima vrsta L. volckmari / L. intermedius, L. muelleri / L. satanus, L. opacus / L. subopacus i L. perrisi / L. colchicus, no odnosi između pojedinih skupina vrsta nisu sa sigurnošću potvrđeni. Također, rezultati ukazuju na postojanje određenih kompleksa vrsta kao i neopisanih (kriptičnih) vrsta unutar ovoga roda. Ovo istraživanje daje važan doprinos poznavanju sistematike unutar roda Limnius i predstavlja osnovu za buduća sveobuhvatna taksonomska i filogenetska istraživanja upotrebom integrativnog pristupa.The genus Limnius Illiger, 1802 belongs to the family of aquatic beetles Elmidae (riffle beetles). So far, 14 species distributed in the Palearctic region have been described within the genus, and preliminary molecular analyzes indicate complex systematic relationships that require additional research. In this work I determined the phylogenetic relationships between species within the genus Limnius for samples collected in the Western Palearctic region using the mitochondrial gene COI and the nuclear genes ArgK, H3, CAD and ITS1. Phylogenetic trees were constructed using various phylogenetic methods for individual markers as well as for combinations of marker sets. The results are mostly comparable between the data sets used, but the best resolution is provided using the combined set of all molecular markers. The obtained results confirm previous phylogenetic hypotheses based on morphology about the close relationships of the species L. volckmari / L. intermedius, L. muelleri / L. satanus, L. opacus / L. subopacus and L. perrisi / L. colchicus, but the relationships between the species groups have not been confirmed with certainty. Also, the results indicate the existence of certain species complexes as well as undescribed (cryptic) species within this genus. This research makes an important contribution to the knowledge of systematics within the genus Limnius and represents the basis for future comprehensive taxonomic and phylogenetic studies using an integrative approach

Regulacija aktivnosti ubikvitinske ligaze HACE1

The HECT ubiquitin ligase HACE1 is involved in membrane dynamics regulation, mitophagy, redox homeostasis, and cytoskeleton organization. Despite HACE1 being a tumor suppressor and a significant factor in neural development, it remains biochemically poorly characterized, and its regulatory mechanisms are not known. This master’s thesis explores the impact of phosphorylation as a regulatory mechanism and its effect on HACE1 activity and dimerization. Phosphomimetic variants were generated and characterized using functional assays, mass photometry, and analytical size exclusion chromatography. The findings reveal that the phosphomimetic mutations within the N-terminal helix disrupted dimerization and activated HACE1 activity, providing insights into how the monomer could be stabilized in its active state. Furthermore, recombinantly purified kinases PAK1 and TBK1 were investigated as potential regulators of HACE1 activity, and the sites targeted by these kinases in HACE1 sites were identified through mass spectrometry.Ubikvitinska HECT ligaza HACE1 sudjeluje u regulacije dinamike membrana, mitofagiji, redokshomeostazi i organizaciji citoskeleta. Unatoč tome što je ligaza HACE1 tumor-supresor i značajan faktor u razvoju živčanog sustava, nije detaljno biokemijski karakterizirana, a regulatorni mehanizmi nisu poznati. Ovaj diplomski rad istražuje utjecaj fosforilacije kao regulatornog mehanizma na aktivnost i dimerizaciju HACE1. Pripremljene su fosfomimetičke varijante i karakterizirane korištenjem funkcionalnih eseja, masene fotometrije i analitičke kromatografije temeljene na isključivanju. Rezultati otkrivaju da fosfomimetičke varijante unutar N-terminalnog heliksa narušavaju dimerizaciju i aktiviraju aktivnost ligaze HACE1, pružajući uvid u to kako se monomer može stabilizirati u aktivnom stanju. Nadalje, rekombinantno pročišćene kinaze PAK1 i TBK1 istražene su kao potencijalni regulatori. Mjesta u ligazi HACE1 koje te kinaze ciljaju identificirana su putem masene spektrometrije

Biochemical characterization of the RRAS2 protein from the sponge Eunapius subterraneus ; Inquiry-Based Chemistry Education

Rak je jedna od najrasprostranjenijih bolesti današnjice i često se javlja uslijed mutacija ili promjena u ekspresiji gena koji kodiraju za proteine uključene u kontrolu rasta i razvoja stanica. RRAS2 je primjer takvog proteina te pripada skupini malih GTPaza. Često je prekomjerno eksprimiran u različitim tipovima raka kod ljudi. Homolog proteina RRAS2 pronađen je i kod evolucijski puno starijih i jednostavnijih životinja – spužvi. Spužve predstavljaju dobar modelni organizam jer imaju jednostavnu morfologiju, a kompleksan genom, te većina gena iz spužvi pokazuje značajnu očuvanost s homolozima kod kralješnjaka. Kako bismo dobili bolji uvid u biokemijske karakteristike homologa RRAS2 iz spužve Eunapius subterraneus, klonirana je spužvina cDNA za RRAS2 te unesena u odgovarajući ekspresijski vektor. Napravljena je prekomjerna ekspresija rekombinantnog proteina u bakteriji Escherichia coli. Analizirana je i potvrđena intrinzična GTPazna aktivnost spužvinog proteina RRAS2, što ukazuje na očuvanost biokemijskih svojstava ovog onkogena. U metodičkom dijelu ovog rada dan je prijedlog nastavnog sata temeljen na istraživačkoj nastavi, za odabranu temu (Enzimi). Pregledana je stručna i udžbenička literatura, oblikovani su prikladni didaktičko-metodički materijali te su navedeni mogući problemi koji se mogu javiti tijekom izvedbe nastavnog sata istraživačkog učenja.Cancer is one of the most widespread diseases nowadays and often occurs due to mutations or changes in the expression levels of genes that control cell growth and development. RRAS2 is one of such proteins and a small GTPase. The homologue of the human RRAS2 was found in evolutionarily much older and simpler animals – sponges. Despite their simple morphology, sponges have a complex genome with many genes very similar to their vertebrate homologues. To get a better insight into the biochemical characteristics of the RRAS2 homologue from the sponge Eunapius subterraneus, the cDNA for RRAS2 was cloned and inserted into an appropriate expression vector. E. coli cells were chemically transformed for the expression of the RRAS2 recombinant protein. The GTPase activity of the sponge RRAS2 was analyzed and confirmed, which indicates that the biochemical properties of this oncogene are evolutionary conserved. In the methodological part, a proposal of inquiry-based lesson, for the selected topic (Enzymes) is given. Professional and textbook literature was reviewed, appropriate didactic-methodical materials were designed, and possible problems that may arise during the implementation of the inquiry-based learning were highlighted

DYNAMICS AND PROPERTIES OF ORGANIC MATTER IN THE CHANGING MARINE ENVIRONMENT OF ROGOZNICA LAKE – ZMAJEVO OKO (CROATIA)

Organski ugljik je važan indikator globalnih promjena te važna komponenta u biogeokemijskim procesima u morskom okolišu. Ovaj rad istražuje promjene u kvalitativnim i kvantitativnim svojstvima organske tvari (OT), kompleksne smjese organskih spojeva s različitim karakteristikama koje se mijenjaju pod utjecajem promjenjivih okolišnih uvjeta u jedinstvenom, raslojenom euksinskom morskom okruženju Rogozničkog jezera - Zmajeva oka (RJ) na istočnoj obali Jadranskog mora. RJ pruža brz odgovor na okolišne promjene, što ga čini idealnim za istraživanje brojnih biogeokemijskih procesa uzrokovanih tim promjenama. Primjetne promjene uključuju zagrijavanje vodenog stupca, deoksigenaciju, te akumulaciju toksičnih sulfida i amonijaka. Dugoročna analiza (1996. - 2020.) OT u RJ pokazuje specifičnu dinamiku OT, uključujući akumulaciju čestičnog organskog ugljika (POC, engl. particulate organic matter) u vodenom stupcu i otopljenog organskog ugljika (DOC, engl. dissolved organic matter) u anoksičnom pridnenom sloju. Potvrđene su kvantitativne i kvalitativne promjene OT sukladno elektrokemijskim mjerenima površinski aktivnih tvari (PAT), kao najreaktivnije skupine spojeva organskog ugljika. Elektrokemijska analiza, posebno parametar normalizirane površinske aktivnosti (NPA), pokazala se pouzdanim indikatorom promjena u DOC-u morskog okoliša. Načela karakterizacije OT ispitana su i u eutrofnim uzorcima (uzorci obogaćeni s DOC-om i POC-om do 320 mg L-1 i PAT-om do 15 mg L-1) s područja sjevernog i srednjeg Jadrana, dodatno i po prvi puta koristeći stabilne izotope δ13C, δ15N i δ34S, te C : N i C : S omjere. Na temelju rezultata ove radnje, predložena je gruba granica hidrofilnosti-hidrofobnosti OT (NPA = 0,083). NPA vrijednosti iznad ove granice ukazuju na hidrofobniju i reaktivniju OT, dok vrijednosti ispod nje upućuju na prisutnost hidrofilnije i inertnije OT. Također su ispitana optimizirana voltametrijska mjerenja PAT-a na potenciostatu novije generacije bez fazne osjetljivosti kako bi se osigurala dosljednost mjerenja PAT na modernim instrumentima.Organic carbon serves as a crucial indicator of global change, participating in diverse biogeochemical processes within marine environments. This study investigates changes in the qualitative and quantitative properties of organic matter (OM), a complex mixture of organic compounds with varying characteristics that respond to changing environmental conditions in the unique, stratified eutrophic marine environment of Rogoznica Lake – Zmajevo oko (RL) on the eastern coast of the Adriatic Sea. RL exhibits rapid responses to environmental changes, rendering it ideal for studying numerous biogeochemical processes influenced by these changes. Noteworthy changes include water column warming, deoxygenation, and the accumulation of toxic sulfides and ammonia. Long-term analysis (1996 - 2020) of RJ reveals specific dynamics of OM, including the accumulation of particulate organic carbon (POC) in the water column and dissolved organic carbon (DOC) in the anoxic bottom layer. Quantitative and qualitative changes in OM, particularly related to surface active substances (SAS), the most reactive subset of organic carbon, have been confirmed. Electrochemical analysis, especially the parameter of normalized surface activity (NSA), has proven to be a reliable indicator of changes in marine DOC. Principles of OM characterization were further examined in eutrophic samples (up to 320 mg L-1 od DOC and POC and SAS up to 15 mg L-1) from the northern and central Adriatic, using stable isotopes δ13C, δ15N, and δ34S, as well as C : N and C : S ratios, to investigate the origin of OM and biogeochemical processes in the studied marine ecosystems. Based on the dissertation's findings, a rough threshold of hydrophilicity-hydrophobicity of OM (NSA = 0.083) is proposed. NSA values above this threshold indicate more hydrophobic and reactive OM, while values below it suggest the presence of more hydrophilic and inert OM. Additionally, optimized voltammetric measurements of SAS on a phase-insensitive potentiostat of the latest generation were examined to ensure measurement consistency of SAS in modern instruments

Effects of fluorescent indole derivates on the cell cycle regulation and survival of human adenocarcinoma cells and lung fibroblast cells

Fluorescentni indolni kationi zanimljivi su za terapeutsku upotrebu jer pokazuju jaku fluorescenciju i lokalizaciju u mitohondrijima. Modifikacijom indolnog prstena ovih spojeva, moguće je poboljšati njihova svojstva, poput fotostabilnosti i protutumorske aktivnosti, čime se povećava njihova učinkovitost u terapijama. Cilj ovog diplomskog rada bio je ispitati učinak novo sintetiziranih derivata indola na bazi vinil piridina na stanični ciklus, preživljenje, ekspresiju proteina uključenih u preživljavanje i regulaciju staničnog ciklusa te ispitati sposobnost lokalizacije spojeva u mitohondrijima stanica adenokarcinoma (A549) i fibroblasta pluća čovjeka (WI-38). Tretman stanica A549 i WI-38 spojevima FB404, FB411, FB414 i FB417 uzrokuje smanjenje preživljenja stanica. Smanjeno preživljenje stanica nakon tretmana spojevima nije uzrokovano aktivacijom apoptoze. Nadalje, spojevi FB404, FB406, FB411, FB414 i FB417 pokazuju značajnu lokalizaciju u mitohondrijima stanica A549 i WI-38. Tretman stanica A549 spojevima FB404, FB411, FB414 i FB417 uzrokuje zastoj u G0/G1 fazi staničnog ciklusa koji je vjerojatno posljedica povećane ekspresije proteina p21.Fluorescent indole cations are of great interest for therapeutic use because they show strong fluorescence and localization in mitochondria. By modifying the indole ring of these compounds, it is possible to improve their properties, such as photostability and antitumor activity and therefore increase their effectiveness in therapies. The aim of this thesis was to examine the effect of newly synthesized indole derivatives based on vinyl pyridine on the cell cycle, survival, expression of proteins involved in survival and regulation of the cell cycle, and to examine the ability of the compounds to localize in the mitochondria of adenocarcinoma cells (A549) and human lung fibroblasts (WI-38). Treatment of A549 and WI-38 cells with compounds FB404, FB411, FB414 and FB417 causes a decrease in cell survival. Decreased cell survival after compound treatment was not caused by activation of apoptosis. Furthermore, the compounds FB404, FB406, FB411, FB414 and FB417 show significant localization in the mitochondria of A549 and WI-38 cells. Treatment of A549 cells with compounds FB404, FB411, FB414 and FB417 causes arrest in the G0/G1 phase of the cell cycle, which is probably due to increased expression of the p21 protein

Proteomic analysis of the role of isoleucine mistranslation in the adaptation of Escherichia coli to oxidative stress

Točan prijenos genetičke informacije važan je za normalan rad bioloških sustava. Aminoacil- tRNA-sintetaze ključni su enzimi u prevođenju genetskog koda jer spajaju molekule tRNA s pripadnim aminokiselinama. Iako se ugradnja pogrešnih aminokiselina u proteine veže uz negativne posljedice, stanice od ovog procesa mogu imati pozitivne učinke, poput otpornosti na stresne uvjete. Soj bakterije Escherichia coli koji eksprimira izolecil-tRNA-sintetazu s nefunkcionalnom domenom za popravak pogreške uzgajan je u mistranslatirajućim uvjetima, te je uočena prilagodba stanica na oksidacijski stres. Radi identifikacije procesa koji omogućuju ovu prilagodbu, izvršena je proteomska analiza. U stacionarnoj fazi utvrđeno je da mistranslacija na izoleucinskim položajima uzrokuje povećanu ekspresiju šaperona, proteaza te proteina koji sudjeluju u unosu peptida. Također, dolazi do smanjene ekspresije proteina koji sudjeluju u biosintezi enterobaktina, siderofora koji omogućuje transport željeza. Uočeno je i da dolazi do promjene u ekspresiji proteina koji sudjeluju u metabolizmu nekih aminokiselina. Dodatno, primijećena je pojačana ekspresija proteina RecA i smanjena ekspesija represora LexA, što upućuje da se aktivira SOS odgovor. Daljnja istraživanja pokazat će koji od ovih procesa su ključni za prilagodbu na oksidacijski stres uslijed mistranslacije.Maintaining the accurate flow of genetic information is crucial for the normal function of all biological systems. Aminoacyl-tRNA synthetases are key enzymes in translating the genetic code, as they attach tRNA molecules to their cognate amino acids. Although incorporation of incorrect amino acids into proteins is generally associated with negative consequences, cells can sometimes benefit from this process, such as adaptation to stress. A strain of Escherichia coli expressing an isoleucyl-tRNA synthetase with a nonfunctional editing domain was cultivated under various mistranslating conditions and adaptation to oxidative stress was observed. To identify biological processes responsible for this adaptation, a proteomic analysis was performed. Analysis of proteome in stationary phase revealed that mistranslation at isoleucine positions leads to increased expression of chaperones, proteases and proteins involved in peptide uptake processes. Additionally, a decrease in the expression proteins involved in biosynthesis of enterobactin, siderophore involved in iron transport. Changes in the expression of proteins that are involved in the metabolism of amino acids were found. Also, the upregulation of RecA and downregulation of LexA expression suggests activation of SOS response. Further research will point out which of these processes are key to adaptation to oxidative stress due to mistranslation

Istraživanje okruženja radiogalaksije na crvenom pomaku z=0,35 u polju COSMOS

Radiogalaksije su galaksije čije se svojstvene sjajne strukture radiovalnog zračenja prostiru daleko izvan same galaksije. Te strukture čini središnja jezgra, mlazovi i režnjevi. Radiogalaksije koje imaju savijene radiomlazove često pripadaju grupama ili jatima galaksija. Takve radiogalaksije se nalaze jako daleko od Zemlje i ta udaljenost je opisana njihovim crvenim pomakom. U polju COSMOS je detektirana jedna takva radiogalaksija (10 918) s crvenim pomakom ≈0.35. Analiziramo morfologiju radiovalnog zračenja pomoću radiokontura. Za ovu analizu koristimo podatke o spektralnom fluksu prikupljene teleskopom VLA. Koristimo podatke o fotometrijskom crvenom pomaku , luminozitetnoj udaljenosti i spektralnom indeksu te računamo monokromatski luminozitet 3 radiogalaksije 10 918 u sustavu mirovanja na frekvenciji 3 GHz. Analiziramo 10′×10′ okruženje radiogalaksije metodom Voronoi teselacije. Pritom koristimo podatke o koordinatama optičkih izvora (galaksija) u blizini radiogalaksije 10 918 i njihovih fotometrijskih crvenih pomaka iz kataloga COSMOS2020 CLASSIC. Izdvajamo samo galaksije u područjima povećane gustoće i tražimo strukturu koja bi odgovarala potencijalnoj grupi ili jatu galaksija. Pretražujemo rendgenski katalog COSMOS X-ray Group Catalog u potrazi za izvorom rendgenskog zračenja koji se prostorno poklapa s radiogalaksijom 10 918 te bi tako predstavljao potencijalnu grupu

Visoko-razlučiva spektroskopija atoma stroncija

This thesis presents the findings of my research, which utilized high-resolution spectroscopic techniques to obtain precise insights into the internal structure of strontium atoms. In the first part of the thesis, I present the results of the absolute frequency measurement of the 5s5p1P1−5s5d1D2 transition in strontium. In these measurements, a strontium atomic beam is generated in an under-vacuum spectroscopy cell. The atoms are excited to the 5s5d1D2 state by the use of two continuous wave lasers. The first one is an on-resonance diode laser at ≈ 461 nm which transfers the population from the ground 5s21S0 to the excited 5s5p1P1 state. The second one is a titanium-sapphire (Ti:Sa) laser at ≈ 767 nm and is used for probing the 5s5p1P1−5s5d1D2 transition. The laser-induced fluorescence (LIF) is measured as a function of the Ti:Sa laser frequency. Simultaneously with the LIF signal, a beat signal between the Ti:Sa laser and an optical frequency comb is detected. Since the frequency comb (FC) is fully stabilized and referenced to a primary frequency standard, it’s providing the absolute frequency scale for LIF measurements. These results are published in Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy. In the second part of the thesis, I present the results of lifetime measurement for the 5s5p1P1 state of atomic strontium. A strontium atomic beam is generated in the same, above mentioned, spectroscopy cell, but the atoms are excited from the ground state to the excited 5s5p1P1 state using a diode-pumped Yb:KGW femtosecond laser. By collecting the laser-induced fluorescence (LIF) and guiding it to a hybrid single-photon detector, the time-correlated single-photon counting (TSCPC) technique was employed. This technique allows precise timing of the single photon arrival versus the timing of the pulsed excitation source that excited the atoms. The generated decay curve is defined by a time constant that corresponds to the lifetime of the 1P1 state. A summary of these results is provided in the manuscript which has been accepted for publication in Physical Review A. In the third part of the thesis, I report on design, implementation and current status of the experimental setup aimed at establishing the first optical atomic clock in Croatia. To create an accurate and precise optical atomic clock, strontium atoms must be cooled to low temperatures through several steps of laser cooling and trapping, and then trapped in optical potentials. This is done inside a vacuum system, which was carefully constructed. Each laser in the complex system required for laser cooling and frequency interrogation of the atomic clock transition must be stabilized. The blue laser is used in the first step of the cooling proces and is stabilized using modulation transfer spectroscopy (MTS). The red lasers - red cooling laser, repumping lasers, and clock laser - are phase-stabilized to the optical frequency comb, which in turn is stabilized to the cw laser operating at a wavelength of 1542 nm and locked to the high-finesse optical reference cavity.Ovim doktorskim radom predstavit ću rezultate istraživanja napravljenih u Grupi za kvantne tehnologije, Centar za napredne laserske tehnike na Institutu za fiziku, pod mentorstvom dr. sc. Ticijane Ban. Istraživanje se sastoji od tri dijela, tematski vezana upotrebom visoko-razlučivih spektroskopskih tehnika u kojima se interakcijom laserske svjetlosti s atomima stroncija dobiva precizna informacija o njihovoj unutarnjoj strukturi. Sva znanstvena oprema korištena u ovim istraživanjima, uključujući laserske sustave, nabavljena je u sklopu projekta "Centar za napredne laserske tehnike (CALT) voditelja nasl. izv. prof. dr. sc. Damira Aumilera. Eksperiment izgradnje optičkog atomskog sata na Institutu za fiziku vodi dr. sc. Neven Šantić koji je trenutno i voditelj QuantERA projekta "NImSoQ – New Imaging and control Solutions for Quantum processors and metrology". Doktorski rad tematski je podijeljen u tri cjeline te je organiziran na sljedeći način. U Uvodu se ukazuje na važnost visoko-razlučivih spektroskopskih tehnika koje su moćan alat za dobivanje informacija o unutarnjoj strukturi atoma. Također, opisuju se ciljevi te sadržaj doktorskog rada. U drugom poglavlju uvode se osnovne fizikalne pojave nužne za razumijevanje tematike koja se obrađuje u ovom radu. Opisano je međudjelovanje svjetlosti i atoma, tehnike hlađenja i zarobljavanja atoma, energijska struktura atoma stroncija te princip rada pulsnih lasera, a među njima i optičkog frekventnog češlja. U trećem poglavlju prikazani su prvi rezultati mojeg istraživanja - mjerenje apsolutne frekvencije 5s5p1P1−5s5d1D2 elektronskog prijelaza u toplim parama stroncija upotrebom opti čkog frekventnog češlja. Detaljno je opisana izrada spektroskopske ćelije u kojoj se stvara atomski snop stroncija pomoću dispenzera. Atomi stroncija pobuđuju se u 5s5d1D2 stanje korištenjem lasera s valnom duljinom u plavom i crvenom području spektra. Frekvencija "plavog" lasera stabilizirana je na 5s21S0−5s5p1P1 prijelaz pomoću spektroskopije prijenosa modulacije (eng. Modulation transfer spectroscopy, MTS), dok se frekvencija "crvenog" lasera mijenjala preko 5s5p1P1−5s5d1D2 prijelaza. Za svaku frekvenciju "crvenog" lasera mjerila se laserom inducirana fluorescencija u atomima stroncija istovremeno s frekvencijom udara između "crvenog" lasera i optičkog frekventnog češlja. Kako je frekventni češalj stabiliziran i referenciran na primarni frekventni standard, on služi kao apsolutna frekventna skala za ova mjerenja. U ovom poglavlju detaljno je opisana spektroskopska ćelija, laserski i optički sistemi, tehnika mjerenja te sistematski efekti koji utječu na konačni rezultat. U četvrtom poglavlju prikazani su rezultati drugog dijela istraživanja - mjerenje vremena života 5s5p1P1 stanja atoma stroncija pomoću tehnike vremenski-koreliranog brojanja pojedina čnih fotona (eng. Time-Correlated Single Photon Counting tehnique, TCSPC). Atomi stroncija stvaraju se unutar iste spektroskopske ćelije, ali se pobuđuju iz osnovnog u 5s5p1P1 stanje pomoću diodno-pumpanog Yb:KGW femtosekundnog lasera. Laserom inducirana fluorescencija detektira se hibridnim detektorom, a upotrebom TCSPC tehnike mjeri se krivulja raspada 5s5p1P1 elektronskog stanja. Krivulja raspada odgovara eksponencijalnoj funkciji s vremenskom konstantnom koja odgovara vremenu života elektronskog stanja. U ovom poglavlju detaljno je opisan laserski i optički sistem, tehnika vremenski-koreliranog brojanja pojedinačnih fotona, analiza podataka te sistematski efekti koji utječu na određivanje vremena života ovog stanja. Peto poglavlje posvećeno je dizajnu i gradnji eksperimentalnog postava za uspostavu prvog optičkog atomskog sata u Hrvatskoj. Za stvaranje optičkog atomskog sata atome je potrebno ohladiti u nekoliko koraka laserskog hlađenja i zarobljavanja, što se postiže unutar kompleksnog vakuumskog sistema. Svaki laser potreban za hlađenje frekvencije, potrebno je stabilizirati. "Plavi" kontinuirani laser bit će korišten kao prvi korak u procesu hlađenja te je stabiliziran pomoć u spektroskopije modulacijskog transfera. "Crveni" laser za hlađenje, laseri za naseljavanje i laser za ispitivanje frekvencije atomskog sata fazno su stabilizirani na optički frekventni češalj, koji je dalje stabiliziran na laser kontinuirane emisije s valnom duljinom od 1542 nm, zaključanog na optičku šupljinu visoke finese. Šesto poglavlje daje kratak sažetak teze, te buduće planove vezane uz izgradnju optičkog atomskog sata na atomima stroncija