Jichi Medical University Institutional Repository

佐藤, 美樹

  氏 名 佐 EさA AE藤 Eと うA AE美 EみA AE樹 Eき 学 位 の 種 類 博士 (医学) 学 位 記 番 号 甲第 515 号 学位授与年月日 平成 28 年 3 月 22 日 学位授与の要件 自治医科大学学位規定第 4 条第 2 項該当 学 位 論 文 名 造血幹細胞移植後の合併症予測因子の検討 論 文 審 査 委 員 (委員長) 教 授 室 井 一 男    (委 員) 教 授 森 本   哲  准教授 佐久間 康 成    論文内容の要旨 1 研究目的 白血病、悪性リンパ腫、再生不良性貧血などの造血器疾患に対しては、主に、抗がん剤治療、免疫療法、造血幹細胞移植などが行われている。しかし、抗がん剤、免疫抑制剤を用いた治療の場合、腫瘍のみならず正常細胞、正常臓器への障害が避けられず、特に全体の免疫能が低下し感染症などの合併症を引き起こしやすい。さらに造血幹細胞移植では、移植片対宿主病（GVHD）という新たな疾病を生み出してしまうことさえある。昨今の化学療法、移植療法の発展により恩恵を受ける患者は飛躍的に伸びたが、一方で、その合併症は多様化しているのが現状である。このため、治療関連合併症の的確な予後予測モデルの構築および適正な治療法の開発が急務である。 近年、CRP の測定方法にラテックス凝集比濁法(latex agglutination turbidimetry: LA 法)が新しく開発され、低濃度から高濃度域まで精度良く正確に測定できるようになった。高感度 CRP により CRP の微量定量の臨床的意義が重要となり、その予測能の向上が期待されるようになった。このことから、以前に急性骨髄性白血病の患者で、治療開始前の高感度 CRP 値測定によって、その後の感染症の合併を予測できるか否かを検討した結果、地固め療法開始前の CRP 値が発熱性好中球減少症(febril neutropenia:FN)では閾値 0.19mg/dl で、臨床的に診断された感染症(documented infection: DI)に対しては閾値 0.26mg/dl で、高い予測効果が認められ、高感度 CRP 値の有用性が証明されたことを報告した。これらの結果を踏まえて、造血幹細胞移植施行例でも前処置施行前の CRP 値が移植後の合併症予測因子となるかを検討することとした。さらに、CRP よりも他の炎症性疾患から感染症を区別するのに役立つと注目を浴びているマーカーのひとつであるプロカルシトニン(PCT)に着目し、PCT 値での予測能を CRP 値と比較検討した。研究は以下の 3 つに分類される。 (1) 同種造血幹細胞移植における前処置施行前 CRP 値による移植関連合併症の予測 (2)リンパ腫と多発性骨髄腫に対する自家末梢血幹細胞移植施行前 CRP 値による感染症発症予測 (3)同種造血幹細胞移植における前処置施行前プロカルシトニン値による移植関連合併症の予測  2 研究方法 (1) 同種造血幹細胞移植における前処置施行前 CRP 値による移植関連合併症の予測 前処置施行直前の血清 CRP 値を測定し、移植後 30 日、100 日以内の DI、100 日以内の非再発死亡（non relapse mortality:NRM）を評価し、ROC 曲線を用いて CRP 値の適切な閾値と感度、特異度を検討する。  (2)リンパ腫と多発性骨髄腫に対する自家末梢血幹細胞移植施行前 CRP 値による感染症発症予測 前処置施行前の血清 CRP 値を測定し、その後の感染症発症予測を ROC 曲線を用いて評価する。 (3)同種造血幹細胞移植における前処置施行前プロカルシトニン値による移植関連合併症の予測 前処置施行前の血漿は測定まで凍結保存し、後方視的に PCT 値を測定する。CRP と PCT での移植後 30 日以内の DI と血液培養が陽性となった血流感染症(blood stream infection:BSI)、100 日以内の NRM の予測能を ROC 曲線を用いて評価し、その予測能を AUC で比較する。  3 研究成果 (1) 同種造血幹細胞移植における前処置施行前 CRP 値による移植関連合併症の予測 前処置施行前の CRP 値は造血幹細胞移植後、早期の感染症発症予測には有用でなかった。  前処置前の CRP 値 0.6 mg/dl 以上は早期 NRM の独立したリスク因子となった。  CRP 値が 0.6 mg/dl 以上の症例では Grade III-IV の急性 GVHD の発症頻度が有意に高かった。 (2)リンパ腫と多発性骨髄腫に対する自家末梢血幹細胞移植施行前 CRP 値による感染症発症予測 自家移植施行前の血清 CRP 値はその後の DI 発症予測とはならなかった。 (3)同種造血幹細胞移植における前処置施行前プロカルシトニン値による移植関連合併症の予測 前処置施行前の PCT 値は、CRP 値と同様に造血幹細胞移植後、早期の感染症発症予測には有用ではなかった。前処置施行前 CRP 値は早期 NRM の独立した予測因子となり、これは(1)の研究結果と同様であった。しかしながら、PCT 値は測定値のみならず測定時に微細な感染兆候を伴う症例では、実際に PCT 値が上昇しているとその後の DI、BSI 発症頻度が高いことが示唆された。  4 考察 (1) 同種造血幹細胞移植における前処置施行前 CRP 値による移植関連合併症の予測 過去の報告からも移植前の CRP 値が高いということは、造血幹細胞移植後の臨床結果に関連すると思われるが、その意義は原疾患や前処置の違いや患者背景の違い、CRP のカットオフ値によっても様々である。今回の研究では前処置施行前の CRP>=0.6mg/dl の症例は III-IV 急性 GVHD の発症頻度が高く、これが OS に影響した可能性がある。CRP が高いということは移植前に臨床的に問題となるようなものではないような感染症の残存や腫瘍そのものの残存による微細な炎症環境を反映していると考えられる。GVHD と炎症性サイトカインの関連を報告したものはいくつかあり、例えば TNFα、IL1、IL6 は前処置による組織障害によって放出され、T 細胞を刺激する。こうした炎症性サイトカインは、ドナーとレシピエントの同種免疫反応を過剰に反応させ GVHDに至ると考えられえる。このため前処置による組織障害の程度は GVHD の誘因として非常に重要なものであると考えられる。一方、骨髄破壊的前処置では強度の高い前処置によって炎症環境がマスクされてしまった可能性がある。 (2)リンパ腫と多発性骨髄腫に対する自家末梢血幹細胞移植施行前 CRP 値による感染症発症予測 前処置施行前の高感度 CRP 値は感染症発症には有用ではなく、前処置施行後の他の因子が影響を与えているのかもしれない。 (3)同種造血幹細胞移植における前処置施行前プロカルシトニン値による移植関連合併症の予測 前処置施行前 PCT 値単独では感染症発症予測因子とはならなかった。しかし、PCT 値と臨床所見を組み合わせることで DI 発症、BSI 発症の高リスク症例をみつけることが可能となった。PCT値のみでは感染症イベント発症予測能はみられなかった理由として、予防的抗菌薬投与による偽陰性例の増加が考えられる。また、本研究では閾値が 0.1ng/ml 以下であり、これは過去の報告から細菌感染症を診断する閾値(0.5-1.3ng/ml)と比較してもかなり低い値である。近年 PCT の高感度定量が可能となり、本研究での閾値は正常下限値である 0.5ng/ml よりも低く、偽陽性例を増加させてしまったかもしれない。よってバイオマーカーとしての PCT 値と臨床所見としての局所的な感染兆候を組み合わせることで偽陽性例を減らすことができたのかもしれない。  5 結論  同種造血幹細胞移植における前処置施行前の CRP 値が高い症例はその後の III-IV 急性 GVHDの発症頻度が高く、NRM、OS にも関連することが示唆されたが、感染症イベント予測は不可能であった。自家末梢血幹細胞移植施行例でも、前処置施行前の CRP 値での発症予測は不可能であった。同様に同種造血幹細胞移植時における前処置施行前 PCT 値単独では、その後の感染症発症予測因子とはならなかった。しかしながら、測定時に臨床的に問題とならない微細なものであっても感染兆候が存在する症例では PCT 値が上昇していると、その後の DI、BSI 発症頻度が高くなることが示唆された。 論文審査の結果の要旨  造血幹細胞移植後、感染症、臓器障害、GVHD によって命を落とすことがあり、非再発死亡（NRM）と呼ばれている。申請者は、血清の CRP とプロカルシトニン（PCT）に着目し、造血幹細胞移植前のこれらの値がNRM を予測するか統計学的手法を用いて検討した。CRPの測定は、高感度検出法を用いた。CRP と PCT は、単独では造血幹細胞移植後の感染症インベント（DI）を予測出来なかったが、これらと造血幹細胞移植前の微小な感染巣の有無を組み合わせることによって、DI を予測できることが示された。一方、CRP は NRM の予測因子となること、CRP 高値群では重症の急性 GVHD が多いことが示された。この現象は、骨髄非破壊的前処置群でのみ認められ、通常の骨髄破壊的前処置群では認められなかった。最近、類似の報告があることが示された。この現象は大変興味深く、この現象のメカニズムを解明する必要性が述べられた。本学位論文のもととなる複数の論文は、既に海外誌に発表されており、本学位論文の学術的価値は高く、審査員全員一致で合格と判定した。 最終試験の結果の要旨  申請論文の内容に従い、研究の背景、目的、方法、結果、考察について、丁寧な説明がなされた。対象集団の詳細、CRP の測定法、結果の解釈、申請論文以外の研究成果、今後の研究の発展について、多数の質問がなされたが、各々の質問に対し的確に返答された。質疑応答の経過から、造血幹細胞移植全般について深い知識を有しており、この分野で取り組むべき課題を理解していることが伺えた。以上より、申請者は医学博士に相応しい資質を有することから、審査委員全員一致で合格と判定した。 

Japanese

造血幹細胞移植後の合併症予測因子の検討

北川, 良子

博士後期課程  大学院看護学研究科看護学専攻 学籍番号 DN1202 氏 名 北川 良子 学位の種類 博士（看護学） 学位授与年月日 2016 年 3 月 22 日 学位授与の要件 学位規程第 4 条第 2 項該当 論文題目 助産師の職業生活の変化の様相と職業生活の変化に影響する要因 主指導教員  成田 伸  教授 副指導教員  中村 美鈴 教授  春山 早苗 教授 論文審査委員 主査： 教授  永井 優子 副査： 教授  春山 早苗 副査： 教授  本田 芳香   論文審査の結果の要旨 本研究は、助産師の職業生活の変化の様相と職業生活の変化に影響する要因を明らかにすることによって助産師のキャリア支援のための示唆を得ることを目的とした質的記述的研究である。対象は助産師資格取得後 10年以上経過し、離職経験が 1回以上ある 30～40歳代の助産師を 2つの都道府県助産師会を通じて募集し、同意を得られた 9名である。 年齢、分娩介助件数、助産師基礎教育機関の種類、助産師資格取得後の職歴の概略等 6項目からなる調査用紙と職業生活が変化したときの状況や理由に関するインタビューガイドに基づいた各 1回の半構成的面接によってデータを収集した。 看護職のキャリア開発研究(平井、2009)を参考に、助産師の職業生活の内容、場所、就業状況のいずれかの変化を 1 回の職業生活の変化とし、各事例の職業生活の変化について経年的にデータを整理した総体を職業生活の変化の様相と定義した。全事例の様相を俯瞰して共通性を見出して分類し、そのグループの特徴をもって命名した。 また、各事例の逐語録から職業生活の変化に影響した文脈を取り出し、意味内容を明確に要約して「コード」として全事例の「コード」を集約し、内容の類似性に基づいて抽象度を高めてカテゴリー化し、自己、家族、職場や周辺の 3要因に分類した。 博士後期課程  本研究の結果、助産師の職業生活の変化の様相は、全事例が病院で分娩を含む周産期ケアから職業生活を始めており、その後①地域で分娩を含む周産期ケアと育児支援に移行する、②他の場所に移動した後に病院・診療所において分娩を含む周産期ケアに戻る、③地域における育児支援中心の助産ケアに移行する、という 3グループに分類された。また、職業生活の変化に影響する要因のカテゴリーとして、『自己要因』には【助産実践から得るやりがいの実感】等 8個、『家族要因』には【子育てや家事の増大】等 5個、『周辺要因』には【助産師同士のつながり】等 10個が生成された。 助産師のキャリア支援として、就業初期にこれらのケア領域の体験をもつ助産師との交流を促す支援、および助産師のケアには分娩を含む周産期領域と地域における育児支援という 2領域があることを助産師基礎教育で強調することの重要性が示唆された。 2016年 1月 6日(水)の論文審査において、少子化問題とマンパワー不足にある周産期医療の深刻な現状における助産師のキャリア形成支援の視点から長期間の職業生活の様相の特徴を見出した独創性を認められて合格となった。一方、用語の定義、分析の理論的枠組みと手順の明確化、データの本質を損なわない結果の表記等、論旨の一貫性に留意し,考察を深める必要性が指摘された。同年 2月 15日(月)の最終審査において、指摘事項について一部修正されたプレゼンテーションがあり、助産師の基礎教育および就業早期のキャリア支援とその体制構築へ寄与する実践的かつ社会的意義があり、広域実践看護学分野の目的に適合していることから、合格となった。一方、研究目的と結果との一貫性を保つために論文題目の変更と考察のさらなる深化が求められ、同年 2月 29日(月)に最終提出論文で修正事項を確認して、審査委員全員が合格と判断した。                                                               (1307文字) 

助産師の職業生活の変化の様相と職業生活の変化に影響する要因

小坂, 仁

遺伝子研究総論(Ⅱ)

屋代, 隆

医学研究法概論「共焦点レーザー・電子顕微鏡の使用法」

滝澤, 亮哉

  氏 名 滝澤たきざわ 亮りょう哉や 学 位 の 種 類 博士 (医学) 学 位 記 番 号 甲第 738号 学位授与年月日 令和 7年 3月 17日 学位授与の要件 自治医科大学学位規定第 4条第 2項該当 学 位 論 文 名 ナノマテリアル曝露による肺への影響とその炎症誘導機構の検討 論 文 審 査 委 員 (委員長)     教授 小宮根 真弓  (委 員)        教授 小川 真規 講師 唐澤 直義        論文内容の要旨 1 研究目的  ナノテクノロジーの発展に伴い、多くのナノマテリアルが医療、工業などの様々な用途で使用されるようになった。しかしながら、ナノマテリアルは、その小ささから体内の深部にまで到達することや、表面構造により生体への影響が変化するため、その毒性評価がいまだに定まっていない。また、ナノマテリアルを加工する工場などでは、大量のナノマテリアルを吸入してしまう可能性があり、ナノマテリアルの毒性評価は喫緊の課題となっている。そこで、本研究では、3 種類の表面コーティングの異なる酸化チタンナノ粒子とポリ L乳酸ファイバー/銀ナノ粒子、及び銀ナノ粒子を用い、それらの吸入曝露による、肺に対する生体影響の評価を行った。  2 研究方法  3 種類の表面コーティングの異なる酸化チタンナノ粒子を、C57BL/6J 野生型マウスと Nrf2 ノックアウトマウスに咽頭内吸入曝露した。投与後 2週間後に解剖を行い、各臓器の重量、気管支肺胞洗浄液中(BALF)の採取を行った。その後、BALF 中の細胞について diff-quick 染色を行い細胞数と細胞分布を確認した。その後、BALF中の炎症性サイトカインである Interleukin-6 (IL-6) と Tumor necrosis factor alpha (TNF-α)の解析を行った。また、肺組織を用い、Nrf2関連因子である superoxide dismutase 1 (SOD1)、 heme-oxygenase 1 (HO-1)、NAD(P) H quinone oxidoreductase (NQO1)や、炎症性サイトカインである IL-6,TNF-αについての qPCRを行った。 次に、ポリ L乳酸ファイバー/銀ナノ粒子と銀ナノ粒子を C57BL/6J野生型マウスと Nrf2-ApoEダブルノックアウトマウスに咽頭内吸入曝露した。その後、BALF中の細胞数、細胞分布の確認を行った。肺組織を用い、Nrf2関連因子とマクロファージ関連因子である Monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1)とMacrophage Colony Stimulating factor (M-CSF)について、ウエスタンブロッティングを行い解析した。  3 研究成果  3 種類の表面コーティングの異なる酸化チタンナノ粒子のマウス肺への曝露では、野生型マウスとNrf2ノックアウトマウスで、非曝露群と比較し、BALF中の細胞数や細胞の分布に変化は無かった。また、BALF 中の炎症性サイトカインの変化は無かった。加えて、野生型マウスと Nrf2 ノックアウトマウスへのすべての酸化チタンナノ粒子の曝露群で、非曝露群と比較し、Nrf2関連因子や、炎症性サイトカインの mRNAの変化はなかった。このことから、3種類の表面コーティングの異なる酸化チタンナノ粒子の肺への曝露では、炎症などの生体影響は確認されなかった。 ポリ L 乳酸ファイバー/銀ナノ粒子のマウス肺への曝露では、Nrf2-ApoE をノックアウトしたマウスでBALF中の総細胞数が増加した。また、BALF中の総細胞数が増加した群では、マクロファージ、リンパ球、好中球が増加した。BALF の総細胞数が変化しなかった野生型マウスでは、肺組織で Nrf2 関連因子である HO-1の発現が増加した。また、ポリ L乳酸ファイバー/銀ナノ粒子と銀ナノ粒子曝露群の比較では、野生型マウスの銀ナノ粒子曝露で M-CSF の発現が増加したが、ポリ L 乳酸ファイバー/銀ナノ粒子の曝露での変化が無かった。  4 考察 本研究で用いた 3種類の表面コーティングの異なる酸化チタンナノ粒子の曝露では、肺に対して生物学的な影響を示さなかった。また、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムとステアリン酸の複合コーティングを施してもルチル型の酸化チタンナノ粒子は低毒性を示した。 ポリ L乳酸ファイバー/銀ナノ粒子の曝露では、Nrf2-ApoEノックアウトマウスで、BALFの細胞数が増加しており、野生型マウスでは BALFの細胞数は変化しなかった。加えて、野生型マウスでは Nrf2の下流の因子である HO-1の発現が増加していたが、Nrf2-ApoEノックアウトマウスでは変化が無かった。この結果から、Nrf2 は炎症の抑制に関与しており、特に、下流の因子である HO-1 の発現増加が肺での炎症を抑制していることが予想される。 ポリ L 乳酸ファイバー/銀ナノ粒子と銀ナノ粒子曝露の比較では、野生型マウスでマクロファージ関連因子であり、抗炎症作用を示す M-CSFの発現が銀ナノ粒子曝露でのみ増加していた。この結果は、銀ナノ粒子に加工を施すと、肺への生体影響が変化することを示唆しており、また、曝露による炎症の抑制には Nrf2が関与していることを示している。  5 結論 本研究では、特に、加工されたナノマテリアルの吸入曝露による影響に着目した研究を行った。本研究結果は、ナノマテリアルは加工を施すと、元のナノマテリアルと比較し、毒性が変化する場合があることを示した。このことから、加工されたナノマテリアルは毒性予測が難しく、個々のナノマテリアルに対しての毒性評価が必要であることが考えられる。 また、本研究では Nrf2に着目し、毒性評価を行った。本研究で、ポリ L乳酸ファイバー/銀ナノ粒子の曝露では、Nrf2 の下流因子である HO-1 が炎症抑制に働いている因子の一つであることを同定した。HO-1 はナノマテリアル曝露のバイオマーカーとして利用できる可能性があり、Nrf2 に着目したバイオマーカーの探索はナノマテリアル曝露による毒性の評価や予測に貢献することが期待される。  論文審査の結果の要旨 本学位論文は、ナノ粒子、特に酸化チタンナノ粒子および銀ナノ粒子の、吸入曝露における安全性・毒性について、コーティングの影響も含めて検討したものである。本研究において、ナノ粒子は加工を施すことで元のナノ粒子と比較し毒性が変化する場合があるが、今回検討した３種のコーティングによる酸化チタンナノ粒子では安全性・毒性に差がなかった。ポリ L 乳酸ファイバー/銀ナノ粒子の曝露では、Nrf2 の下流にある HO-1 が炎症抑制に働いている可能性が示された。これらのナノ粒子は適切なコーティングによって通常使用する濃度において、呼吸器に対する毒性はほとんど認めなかった。  ナノ粒子に関する研究は、端緒についたばかりであり、ナノ粒子の安全性・毒性を検討することは学問的、社会的に意義がある、この研究結果は学術的にも新規性がある内容である。ナノ粒子の安全性・毒性評価はいまだ確立されたものがなく、この研究により今度新たな評価系の開発への発展が期待され、独自性のある内容と考えられる。  学位論文としては、研究背景の部分が不十分であったため、内容を拡充するよう指導したところ、適格に修正された。図表に不十分な点があったため修正を依頼したところ、適切に修正された。内容の構成、日本語の表現がややわかりにくかった点について指導し、適切に修正された。以上より、本学位論文を合格と判断する。 最終試験の結果の要旨 本学位論文は、ナノ粒子、特に酸化チタンナノ粒子および銀ナノ粒子の、吸入曝露における安全性・毒性について、コーティングの影響も含めて検討したものである。本研究において、ナノ粒子は加工を施すことで元のナノ粒子と比較し毒性が変化する場合があるが、今回検討した３種のコーティングによる酸化チタンナノ粒子では安全性・毒性に差がなかった。さらに酸化ストレスに着目した検討により、ポリ L乳酸ファイバー/銀ナノ粒子の曝露では、Nrf2の下流にある HO-1が炎症抑制に働いている可能性が示された。この研究は、ナノ粒子の安全性・毒性の評価系の確立、ナノ粒子毒性の新たな指標についての基礎的データを提供するものと評価できる。  ナノ粒子の開発が進み、世界的に広く使用されているにもかかわらず、ナノ粒子に関する研究、特にその安全性・毒性評価の研究については端緒についたばかりである。ナノ粒子の安全性・毒性を検討することは学問的のみならず社会的にも意義があり、この博士論文は学術的な面からも適格に検討され記載されており、新規性がある内容である。研究内容は社会的にも今度の発展が期待される重要な分野である。ナノ粒子の安全性・毒性評価はいまだ確立されたものがなく、この研究により今度新たな評価系への発展が期待され、独自性のある内容と考えられる。  学位論文としては、研究背景の部分が不十分であったため、内容を拡充するよう指導したところ、適格に修正された。また、内容の構成、日本語の表現がややわかりにくかった点について指導し、適切に修正された。 学位審査会での発表は、順序だててわかりやすい発表であり、質問にも的確に答えていた。  以上より、提出された論文および学位審査会での発表内容を総合的に判断し、申請者 滝澤 亮哉氏を博士号取得者にふさわしいと考え、合格と判定する。

ナノマテリアル曝露による肺への影響とその炎症誘導機構の検討

桂田, 健一

  氏 名 桂 EかつらA AE田 EだA AE健 EけんA AE一 Eいち 学 位 の 種 類 博士 (医学) 学 位 記 番 号 甲第 474 号 学位授与年月日 平成 27 年 3 月 18 日 学位授与の要件 自治医科大学学位規定第 4 条第 2 項該当 学 位 論 文 名 糖尿病治療薬 GLP-1 受容体アゴニストの中枢を介した心血管作用  論 文 審 査 委 員 (委員長) 教 授 百 村 伸 一  (委 員) 准教授 長 坂 昌一郎  講 師 藤 原   研    論文内容の要旨 1 研究目的 近年増加している 2 型糖尿病の主要な死亡原因は、心筋梗塞や脳梗塞などの心血管合併症である。わが国の 2 型糖尿病患者の寿命は非罹患者に比べて約 10 年も短く、生命予後改善には心血管合併症の予防が重要である。糖尿病治療薬としてインクレチン関連薬が 2009 年に登場し、幅広く使用されるようになった。インクレチンの代表である Glucagon-like peptide-1(GLP-1)にはインスリン分泌促進作用や膵 β 細胞保護作用以外に多彩な膵外作用が報告されている。特に心血管作用として、2 型糖尿病患者に対する臨床研究において GLP-1 受容体アゴニストの血圧低下作用が報告されたことから、心血管合併症予防効果にも大きな期待が寄せられている。心血管合併症において、自律神経調節の破綻とくに交感神経活性化は高血圧や虚血性心疾患、心不全の発症進展に密接に関わっており、交感神経活動を規定する中枢神経の役割は重要である。 GLP-1 には中枢神経作用があり、その摂食抑制作用は視床下部室傍核を介することが明らかにされている。GLP-1 受容体は脳内の心臓血管中枢を含む複数部位に発現している。そして、末梢GLP-1、GLP-1 受容体アゴニストともに、血液脳関門を通過し脳内へ到達することが示されている。そのため GLP-1 の心血管作用は中枢神経を介した作用の寄与が大きいと推察される。 GLP-1 の心血管作用として、正常動物では末梢投与、中枢投与ともに急性の血圧上昇作用が知られており、中枢神経を介した機序が考えられている。一方、高血圧モデルでは末梢投与による慢性の降圧作用が報告されているが、中枢投与の作用は不明である。 そこで本研究は、高血圧モデルに対する GLP-1 中枢投与の効果とその作用機序を明らかにすることを目的とした。  2 研究方法 高血圧モデルとして高血圧自然発症ラット（SHR）および対照の Wistar-Kyoto（WKY）ラットを使用した。SHR、WKY ラットそれぞれに GLP-1 受容体アゴニストまたは Vehicle を脳室内投与した。GLP-1 受容体アゴニストの投与は、リラグルチド 200 pmol を脳室内（側脳室）に投与し、単回投与群と反復投与群に分けて行った。 単回投与群では、リラグルチド投与 2 時間後に Tail cuff 法により血圧・脈拍数を測定し急性効果を観察した。反復投与群では、リラグルチドを 1 日 1 回 2 週間にわたって投与し、毎週 Tail cuff法により血圧・脈拍数を測定し慢性効果を観察した。 中枢におけるリラグルチド作用機序の解析を、急性効果と慢性効果に分けて行った。急性効果の解析のため、リラグルチド脳室内単回投与後に抗 c-Fos 抗体を用いて視床下部および脳幹の免疫染色を行った。また視床下部に関しては GLP-1 の摂食抑制作用部位である室傍核の解析を行った。Wistar ラット室傍核からニューロンを単離し、fura-2 蛍光画像解析により細胞内 Ca2+濃度（[Ca2+]i）を測定し、GLP-1 の作用を解析した。その後、CRH およびバゾプレッシン、オキシトシン、ネスファチン抗体を用いた免疫染色により含有神経ペプチドを同定し、各神経ペプチドニューロンにおける GLP-1 の[Ca2+]i増加作用を解析した。 慢性効果の解析のため、リラグルチド反復投与 2 週間後に抗 c-Fos 抗体を用いて視床下部および脳幹の免疫染色を行った。またリラグルチド投与 2 週間目に蓄尿ケージを用いて採尿し、尿中カテコールアミン排泄量を HPLC 法により測定した。2 週間のリラグルチド投与の終了後、下大静脈より採血し、レニン活性を RIA 法にて測定した。また腎臓を摘出し eNOS の mRNA 発現量を Real time PCR 法により測定した。  3 研究成果 SHR において、Vehicle 投与と比較してリラグルチド脳室内投与により、単回投与群では血圧・脈拍数はともに上昇した（ΔsBP 11±1 mmHg vs. 3±2 mmHg, p<0.05, ΔPR 45±5 bpm vs. 9±12 bpm, p<0.05）。反復投与群では、2 週間後に血圧上昇が抑制され、脈拍数は不変であった（sBP 188±2 mmHg vs. 203±4 mmHg, p<0.01, PR 461±9 bpm vs. 471±5 bpm, p=ns）。WKY ラットにおいては、リラグルチドの反復投与は血圧・脈拍数を変化させなかった。 SHR へのリラグルチド初回投与後に、視床下部室傍核、弓状核、および延髄孤束核の c-Fos 発現が亢進した。Wistar ラット室傍核から単離したニューロンの[Ca2+]i解析の結果、GLP-1（10-14～10-8 M）は濃度依存性に室傍核ニューロンの[Ca2+]i 増加を惹起した。免疫染色の結果、[Ca2+]i増加を示したニューロンの 50%が CRH、14%がバゾプレッシン、13%がオキシトシン、44%がネスファチン陽性であった。 SHR へのリラグルチド反復投与の 2 週間後に、室傍核、弓状核の c-Fos 発現は変化せず、孤束核の c-Fos 発現が亢進した。尿中ノルエピネフリン排泄量は有意に低下し、血漿レニン活性は変化しなかった。また腎皮質において eNOS の mRNA 発現量が有意に増加した。  4 考察 本研究は、高血圧モデル SHR において、リラグルチドの脳室内単回投与（急性効果）が血圧上昇作用を、反復投与（慢性効果）が血圧上昇抑制作用を発揮することを明らかにした。 SHR において、リラグルチドの単回投与後に室傍核、弓状核、孤束核で c-Fos 発現が亢進した。室傍核における標的を同定するため、Wistar ラットの単離室傍核ニューロンの[Ca2+]i解析を行ったところ、GLP-1 は室傍核ニューロンを直接活性化し、その主要標的は CRH およびネスファチンニューロンであった。CRH は ACTH-コルチコステロン分泌促進作用を有し、ネスファチンは交感神経活性化を介した一過性の血圧上昇作用が報告されている。リラグルチド脳室内投与による急性の血圧上昇作用に、室傍核 CRH、ネスファチンニューロン活性化が関与していることが示唆される。 SHR において、リラグルチドの反復投与 2 週間後に、孤束核で c-Fos 発現が亢進し、尿中ノルエピネフリン排泄量が低下した。リラグルチド脳室内投与による慢性の血圧上昇抑制作用は、孤束核活性化を介した交感神経抑制による可能性が示された。この際、血漿レニン活性に変化はなく代償性の活性がみられなかったことから、腎交感神経も抑制されレニン活性が抑制されたままであった可能性が考えられる。 またリラグルチド反復投与後にみられた腎皮質 eNOS 発現の増加は、血管抵抗減少を介した血圧上昇抑制への寄与が考えられる。しかし、リラグルチドの中枢作用から末梢 eNOS 発現増加にいたる経路、機序を示唆するデータは得られなかった。孤束核活性化から交感神経抑制、末梢eNOS 発現増加にいたるメカニズムについては、今後さらなる研究が必要である。  5 結論 本研究では、GLP-1 受容体アゴニストの中枢作用が、高血圧モデルである SHR に対して、急性の血圧上昇作用と慢性の血圧上昇抑制（高血圧改善）作用をもつことを示した。 急性作用は視床下部室傍核、弓状核の活性化を介すると考えられ、この活性化は慢性作用では消失していた。一方で反復投与後に観察された GLP-1 受容体アゴニストの慢性の高血圧改善作用は、臨床研究における報告に合致する。GLP-1 受容体アゴニストは血液脳関門を通過するため、高血圧改善作用メカニズムの一部に中枢を介した機序が想定される。特に中枢を介した交感神経抑制作用が示されたことは、心血管合併症に結びつく交感神経活性化を予防し、高血圧改善のみならず糖尿病患者の生命予後を改善することが期待される。  論文審査の結果の要旨 本研究では、GLP-1受容体アゴニストの中枢作用が、高血圧モデルであるSHRに対して、急性の血圧上昇作用と慢性の血圧上昇抑制（高血圧改善）作用をもつことが示された。その急性作用は視床下部室傍核、弓状核の活性化を介すると考えられ、この活性化は慢性作用では消失していた。一方で反復投与後に観察されたGLP-1受容体アゴニストの慢性の高血圧改善作用については、GLP-1受容体アゴニストは血液脳関門を通過するため、高血圧改善作用メカニズムの一部に中枢を介した機序が想定される。特に中枢を介した交感神経抑制作用が示されたことは、心血管合併症に結びつく交感神経活性化を予防し、高血圧改善のみならず糖尿病患者対するベネフィットも期待できる。 本研究は精緻なデザインに基づいた実験により GLP-1 受容体アゴニストの中枢を介した心血管作用の機序解明に迫った内容で学位論文に値する質を有する研究であると考えられた。文言や図表のスタイルに関し、若干の修正が必要との指摘もあったため、それらの修正を加えた後、再度審査委員により内容の確認が行われ、全員一致で合格と判定された。  最終試験の結果の要旨 平成 27 年 1 月 28 日に委員長、百村伸一、委員、長坂昌一郎、委員、藤原 研の出席のもと最終審査が行われた。桂田氏より学位論文内容に関するプレゼンテーションが約 30 分おこなわれた後、質疑応答に入った。審査委員からの質問に対して桂田氏より適切かつ真摯な回答が行われ、本人退場の後、審議を行い全員一致で最終試験に合格と判定された。 なお主な質疑応答内容は以下のとおりである。 質疑）まず、急性投与と慢性投与において脳内の c-Fos 発現亢進部位が異なっているのはどういう機序によると思われるか？ 応答）孤束核からは室傍核・弓状核への神経投射があり、リラグリチドが孤束核の活性化を介してこれらの部位のニューロンを慢性的には抑制することによる可能性がある。  質疑）急性期慢性期の c-Fos 発現の亢進についてニューロンの同定はできているか？ 応答）今回は検討していないが、[Ca2+]i 解析の結果から、おそらく室傍核では CRH ニューロンであろうと考えており、それを支持する c-Fos と CRH の二重免疫染色の報告もある。  質疑）慢性投与で摂食も変化したか、もしそうであるならばそれが血圧に影響を与えた可能性は無いか？ 応答）確かにリラグリチド投与群で摂食は 1 週目で有意に低下しており、2 週目で回復傾向にあるもののまだ有意に低下している。ただし体重には有意な変化がなく、摂食の変化が血圧に大きな変化を及ぼしたとは考えにくい。  質疑）中枢に対する作用は交感神経を介することが本研究で明らかになったわけであるが末梢に対する作用として迷走神経を介した経路は考えられないか？ 応答）今回は評価していないが否定はできない。  質疑）SHR では血圧上昇を抑えているが対照ラットでは血圧を抑制していないのはなぜか？ 応答）SHR では交感神経活性が亢進しており、そのような状態においてのみリラグリチドが交感神経を抑制し、交感神経活性が正常の場合には抑制していない可能性がある。  質疑）リラグリチドの臨床投与量で中枢への移行はどの程度と予想されるか？ 応答）検討は行っていないが、おそらく 1/100～1/1000 との予想に基づいて、それよりも高い濃度での実験を行った。  質疑）リラグリチドの慢性投与の血圧と心拍数に対する作用に解離がみられるのはなぜか？ 応答）心拍数は心臓のβ受容体を介しているが、リラグリチドの作用機序は必ずしもβ受容体を介するものがメインではない可能性がある。  質疑）リラグリチドの作用における CRH、ネスファチンをはじめとする各ニューロンの寄与度に差異はあると考えているか？ 応答）主要ターゲットは CRH であると考えているが、ネスファチンニューロンの寄与度については本研究では検討していない。 

糖尿病治療薬 GLP-1 受容体アゴニストの中枢を介した心血管作用

大澤, 英之

  氏 名 大 Eお おA AE澤 Eざ わA AE英 Eひ でA AE之 Eゆ き 学 位 の 種 類 博士 (医学) 学 位 記 番 号 甲第 473 号 学位授与年月日 平成 27 年 3 月 18 日 学位授与の要件 自治医科大学学位規定第 4 条第 2 項該当 学 位 論 文 名 乳癌術前化学療法の治療効果予測因子に関する研究  論 文 審 査 委 員 (委員長) 教 授 今 野   良  (委 員) 教 授 丹 波 嘉一郎  教 授 屋 代   隆    論文内容の要旨 1 研究目的 乳癌術前化学療法の効果を、免疫組織学所見に基づいたサブタイプ分類毎に検討し、HER2 陽性乳癌サブタイプ症例の治療前生検検体を用いてマイクロ RNA の網羅的解析を行う。治療の効果に関連するマイクロ RNA とサブタイプ分類を組み合わせることで、より効率の良い治療効果予測を目指す。細胞株を用いた実験では、HER2 陽性乳癌細胞株において miR-205 の機能解析を行う。  2 研究方法 自治医科大学遺伝子解析研究倫理審査委員会の承認を受けて行った。術前化学療法が施行された患者の臨床病理学的解析を行い、HER2 陽性乳癌についてはホルマリン固定パラフィン包埋組織から抽出した RNA でマイクロ RNA マイクロアレイを行った。マイクロ RNA の発現を網羅的に解析し、治療の効果と関連するマイクロ RNA を抽出し治療効果予測モデルの構築を目指す。細胞株を用いた実験では、miR-205 Mimic を乳癌細胞株にトランスフェクションさせて機能解析を行う。  3 研究成果 術前化学療法の効果は免疫組織学検査所見によって分類されたサブタイプ毎に異なった。マイクロRNAの網羅的解析から病理学的効果と関連のあるマイクロRNAが抽出され、マイクロRNAの種類はサブタイプ毎に異なった。抽出されたマイクロ RNA から構築された病理学的効果予測モデルは良好な予測能を示した。miR-205 Mimic をトランスフェクションさせた乳癌細胞株BT474 ではトラスツマブ感受性が変化し、細胞外に IL-6 を分泌した。  4 考察 病理学的効果と関連のあるマイクロ RNA はサブタイプ毎に異なり、予測モデルの効率も異なった。まずサブタイプ分類を行ってからマイクロ RNA 解析を行うことで、より効率の良い効果予測を行うことが出来ると考えられた。細胞株を用いた実験では、miR-205 Mimic のトランスフェクションで IL-6 が分泌されたことから、IL-6 が薬剤感受性に影響を与えると示唆された。miR-205 と IL-6 との関連は未だ報告されていないので、今後の実験で明らかにしていく必要がある。  5 結論  マイクロ RNA の機能や発現は乳癌細胞株やサブタイプによって異なり、臨床ではサブタイプ分類とマイクロ RNA 発現を組み合わせることで、より正確で効率的に病理学的効果を予測し、乳癌治療の個別化に貢献できると考えられた。  論文審査の結果の要旨  本研究の目的は、乳癌術前化学療法の効果を、臨床で頻用されている免疫組織学所見に基づいてサブタイプ分類を行い検討すること、さらに、2 つの HER2 陽性乳癌サブタイプについては、治療前生検検体における miRNA 発現を網羅的に調べ、pCR 症例と非 pCR 症例間で発現差のある miRNA とサブタイプ分類を組み合わせることで、より効率の良い治療効果予測を目指すこと、とされた。これまでに、HER2 陽性乳癌の術前化学療法の治療効果予測に miRNA 発現を利用した文献は無く、新たな治療効果予測因子を見出す可能性がある。同時に、HER2 陽性乳癌の調節機構に関わることが報告されている miR-205 と HER2 陽性乳癌細胞株を用いて、薬剤耐性機序を探索する機能解析実験を行うことであった。その結果、乳癌術前化学療法の効果はサブタイプ別に異なっていること、2 つの HER2 陽性乳癌サブタイプ間で病理学的効果と関連する miRNA発現は異なり、発現差のある miRNA を利用して構築した病理学的効果予測モデルは良好な予測能を示していること、を明らかにした。  HER2 陽性乳癌の調節機構に関係する miR-205 は、薬剤感受性の変化には IL-6 が関与している可能性を示唆し、臨床ではサブタイプ分類と miRNA 発現を組み合わせることで、より正確で効率的に病理学的効果を予測し、乳癌の個別化医療に貢献できると思われる、という結論に達した。  乳癌の最近の化学療法の限界と新たな分子生物学的根拠に基づく視点で企画された研究であり、その内容及び手法は科学的で、かつ、医学博士論文として十分に評価できるものである。  ただし、審査委員会の討議を踏まえ、以下の点での修正が望まれることを申請者に提言し、その改善された結果を確認した。 1．背景を短くして、目的の記載を変更した。  2．誤字を修正した。  3．治療効果の予測モデルの部分に、バリデーションの方法と、サンプルのデータを再度使用し  て結果を出した旨を記載した。  4. 参考文献内のウェブサイトの記載にアクセスした日付を加えた。  5. 参考文献の番号を変更した。 以上より、本論文を合格と判定する。         最終試験の結果の要旨  研究者は、最初に乳癌の疫学、乳癌の術前化学療法、サブタイプ分類マイクロ RNA などについて、概説した後、本研究の目的、方法、考察、まとめと研究成果を報告した。  本研究では、臨床ではサブタイプ分類と miRNA 発現を組み合わせることで、より正確で効率的に病理学的効果を予測し、乳癌の個別化医療に貢献できると思われる、という結論に達した。  学位申請者の乳癌に関する基礎的・臨床的知識と経験は、医学博士取得に値する十分なものであった。また、本研究の内容も臨床検体および細胞株を用いる基礎ならびに臨床の双方に視点を置いた建設的な内容であった。  提出された論文の科学的レベルならびに発表の態度は、医学博士として適切で、審査委員全員が最終試験において、合格と判定した。  

乳癌術前化学療法の治療効果予測因子に関する研究

宮田, 五月

  氏 名 宮田 Eみ や たA AE五月 Eさ つ き 学 位 の 種 類 博士 (医学) 学 位 記 番 号 甲第 467号 学位授与年月日 平成 26年 3月 19日 学位授与の要件 自治医科大学学位規定第 4条第 2項該当 学 位 論 文 名 脳腫瘍におけるイソクエン酸脱水素酵素遺伝子変異の網羅的代謝解析 論 文 審 査 委 員 (委員長)  教 授 山 形 崇 倫   (委 員)  教 授 浜 本 敏 郎  准教授 藤 原 寛 行    論文内容の要旨 1 研究目的 イソクエン酸脱水素酵素遺伝子（IDH）の変異を有する神経膠腫（グリオーマ）は、変異を有さない場合よりも予後が良い。その理由を示した報告は少ない。今回我々は脳腫瘍の網羅的代謝解析を行うことで、イソクエン酸脱水素酵素変異を有するグリオーマがなぜ予後が良いのか検討した。  2 研究方法 ① 培養細胞解析：培養グリオブラストーマ細胞株に変異型 IDH、正常型 IDH プラスミドをそれぞれ用意しトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を RNA マイクロアレイ法、定量的 RT-PCR 法、キャピラリー電気泳動質量分析法、液体クロマトグラフィー質量分析法を用いて解析した。 ② 脳腫瘍組織解析：外科手術的に摘出した患者サンプルから DNA を抽出しダイレクトシークエンス法にて IDH の変異解析を行った。そして IDH 変異群 5 群と IDH 正常群 5 群をキャピラリー電気泳動質量分析法、液体クロマトグラフィー質量分析法にて解析した。解析では両群間で脳腫瘍患者の条件が異なるため、細胞実験の結果と矛盾しない結果をデータとした。  3 研究成果 1) 変異型 IDH グリオーマは解糖系が亢進し TCA 回路が抑制され Warburg 腫瘍であった。 2) 変異型 IDH グリオーマでは細胞分裂に必要な材料（アミノ酸、核酸、エネルギー）の低下を認めた。 3) 変異型 IDH グリオーマでは脂質代謝は亢進していた。細胞実験において、脂質代謝を司る転写因子 sterol regulatory element-binding protein (SREBP)の上昇を確認し、SREBPが細胞周期調節蛋白 p21 の調節をしていることを確認した。 4) 変異型 IDH グリオーマでは酸化ストレスの傾向にあった。  4 考察  変異型 IDH グリオーマは TCA 回路が抑制され、解糖系が亢進している。その結果様々な代謝の変化を生じている。我々が示した上記結果は網羅的代謝解析を行うことで初めて示すことが出来た事実で極めて新規性は高い。Warburg 腫瘍ではミトコンドリア外膜の安定性を増強しアポトーシス抵抗性となる。そのため、予後良好の機序としてアポトーシスとの関連性は少ないと思われた。また TCA 回路が抑制されているためエネルギー産生の欠如があると考えられるが、TCA回路を詳細に検討すると TCA 回路後半部分の蛋白量が増加していた。このことは変異型 IDH 腫瘍細胞におけるフマル酸呼吸の存在の可能性を初めて示唆する。  5 結論 変異型 IDH グリオーマは何故予後が良いのか、代謝を中心に検討した。IDH 変異があるとSREBP1 発現が亢進し、細胞周期制御因子の一つである p21 の発現増加が細胞分裂を抑制している可能性があることが分かった。また、IDH 変異が存在すると培養グリオブラストーマ細胞、脳腫瘍組織のメタボローム解析から、細胞増殖、分裂に必須の核酸、アミノ酸が枯渇する傾向にあることが分かった。このことも IDH 変異脳腫瘍の細胞増殖性低下に寄与していると考えられた。     論文審査の結果の要旨 脳腫瘍の中でも悪性度の高い神経膠腫（グリオブラストーマ）において、イソクエン酸脱水素酵素（isocitrate dehydrogenase：IDH）の R132H 変異を持つ例が変異を持たない例よりも比較的予後が良好であることに関する機序を解析した論文である。宮田氏は、IDH の変異により、糖・脂質代謝が変化することが予後の改善に影響しているとの推定から、代謝系の網羅的な解析を行い、新たな知見を含む多くの結果を得た。 解析手法として、培養グリオブラストーマ細胞に IDH1wt あるいは IDH1R132H cDNA を導入した細胞系を樹立し、両者での代謝系の遺伝子発現を RNA マイクロアレーを用いて比較し、結果を定量的 RT-PCR で確認した。さらに、脂質代謝動態のメタボローム解析を行うなど、IDHの変異による代謝の変化を広範に、網羅的に解析した。 その結果、IDH 変異導入細胞では、TCA 回路が抑制され、acetyl CoA の増加から acyl CoA が上昇し、脂質代謝系が亢進している結果を得た。さらに、新たな知見として、脂質代謝が亢進することにより脂質代謝を調節する転写因子である sterol regulatory element-binding protein (SREBP)1 および SREBP2 の発現増強を確認し、その結果として、細胞周期を G1 期で停止させる p21 が上昇することを示した。これらの細胞内エネルギーの低下や p21 の上昇等が腫瘍増殖を遅らせると推定した。 また、手術で摘出した IDH 変異を持つグリオーマ細胞を用いて、同様に、網羅的代謝解析を行い、変異型 IDH グリオーマでは、脂質代謝系の亢進と、細胞増殖、分裂に必要なアミノ酸、核酸およびエネルギーの低下を確認した。また、変異型 IDH グリオーマでは酸化ストレスが亢進している傾向にあることも示した。これらの知見は、今後の治療法開発にもつながる重要な知見である。 本研究内容は、Neurologia medico-chirugica 誌に原著論文として受理された。 IDH 変異に伴う代謝の変化を、培養細胞および腫瘍細胞両者で、この様に網羅的に解析した報告はなく、また、SREBP や p21 の上昇などの新たな治験も得ており、審査員一同、本論文は学位論文に相応しいと判断された。   最終試験の結果の要旨 最終審査では、IDH の R132H 変異を持つ神経膠腫が変異を持たない腫瘍よりも予後がいい機序について、代謝系の変化に着目して網羅的に解析した研究内容について発表した後、質疑応答がなされた。発表においては、学位論文の内容に加えて、その後の研究の進展状況と、診断マーカーとして新たな分子を同定し、特許出願中であることも報告され、研究内容の重要さと共に、申請者が高い研究能力を有し、今後も研究を発展させていく力を十分に持ち合わせていると判断された。質問に対しても、研究内容と解釈について的確に返答し、関連分野の知識も十分あることが示された。 以上から、申請者は、本学の学位授与に値する研究業績と学識を有すると、審査員全員により判断された。   

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