Development of polymeric nanoparticles by microfluidic technologies as functional drug delivery devices

Tese de doutoramento em Engenharia de Tecidos, Medicina Regenerativa e Células EstaminaisNanoparticles (NPs) are entities with dimensions ranging from 1 and 100 nanometers (nm) in size. As a result of their narrow dimension, NPs exhibit a large surface area-to-volume ratio compared to bulk material, which lead to improved properties. Indeed, NPs have been widely explored in different research fields, demonstrating a strong potential in nanomedicine as drug delivery systems. However, their performance is strictly related to their physicochemical characteristics. Among the different parameters that can be tuned in the resulting NPs, the size stands out for its key role in determining NPs fate, biodistribution, cell interaction and resulting biological effects. However, the ability to produce NPs with precise and defined sizes remains a challenge for the most common and traditional synthesis techniques. Polymeric NPs are mainly synthesized through the nanoprecipitation process. This reaction leads to the production of NPs through the nucleation of the individual polymer chains until their growth into the final entities. During this process, one of the main factors that affects the resulting product size is the mixing of the organic and the aqueous phase. Indeed, the mixing guides the diffusion process between the two miscible phases and, consequently, the formation of NPs. To achieve high mixing performances, the work herein presented leverages microfluidic technology to obtain NPs with a defined size. Indeed, microfluidics allow to investigate the behavior of fluids flowing through microscale channels and can be efficiently applied to NPs production. At first, we assessed the impact of several experimental parameters (polymer concentration, flow rates, and flow rate ratio between the aqueous and organic solutions) on the resulting NPs features, in particular their size. Then, three sizes of interest were selected (30, 50 and 70 nm) to investigate the role of the NPs size on drug delivery and biological effects. Additionally, it was explored the NPs size influence on their ability for biological barriers crossing, as well as cellular internalization and trafficking. The employed micromixer also revealed being a powerful platform for the handling of high molecular weight polymers. Indeed, the synthesis of chitosan-hyaluronic acid NPs was successfully carried out by the microfluidic chip, leading to smaller NPs compared to the conventional method (dropwise). The data herein reported indicates that the NPs size can have a significant impact in their pharmacokinetics and cells response, suggesting that the precise control of NPs features can tailor the delivery of bioactive agents and enhance their biological efficacy.As nanopartículas (NPs) são estruturas com dimensões entre 1 e 100 nanómetros (nm). Devido à sua dimensão, as NPs exibem uma grande relação área de superfície-volume, o que melhora as suas propriedades para diferentes aplicações. As NPs têm sido exploradas em diferentes áreas de investigação, demonstrando um forte potencial na nanomedicina como sistemas de libertação de fármacos. O desempenho das NPs está estritamente relacionado com as suas características físico químicas. Entre as diferentes características das NPs, o tamanho tem importantes implicações na biodistribuição, interação celular e consequentes efeitos biológicos. Porém, a capacidade de produzir NPs com tamanhos precisos e definidos continua a ser um desafio para as técnicas de síntese atuais. As NPs poliméricas são sintetizadas principalmente através do processo de nanoprecipitação. Neste processo, as NPs começam a formar-se através da nucleação das cadeias poliméricas individuais, até atingir o seu tamanho final. Durante este processo, um dos principais fatores que afetam o tamanho das NPs é a eficiência da mistura da fase orgânica com a aquosa. De facto, a mistura guia o processo de difusão entre as duas fases miscíveis e, consequentemente, a formação das NPs. Para alcançar altas performances de mistura, neste trabalho aproveitou-se a tecnologia de microfluídica para obter NPs com um tamanho definido. A tecnologia de microfluídica permite manipular o comportamento de fluidos em canais com geometria à microescala, e pode ser aplicada de forma eficiente na produção de NPs. Primeiramente, avaliou-se o impacto de vários parâmetros experimentais (concentração de polímero, fluxos e rácio de fluxos entre a solução aquosa e orgânica) nas características das NPs, nomeadamente no seu tamanho. Seguidamente, foram selecionados três tamanhos (30, 50 e 70 nm) para estudar diferentes questões, nomeadamente, o papel do tamanho das NPs na entrega de fármacos e consequentemente os seus efeitos biológicos. A influência do tamanho das NPs na capacidade destas atravessarem barreiras biológicas, direcionar vias de internalização, e localização intracelular, foi também estudada. O micro-misturador utilizado revelou ser uma poderosa plataforma para a manipulação de polímeros de elevado peso molecular. A síntese de NPs de quitosano-ácido hialurónico foi alcançada com sucesso pelo chip, levando a NPs menores em comparação com o método tradicional (adição gota a gota). Os resultados obtidos indicam que o tamanho das NPs pode ter um impacto significativo na farmacocinética e na resposta celular, sugerindo que o controle preciso das características das NPs pode permitir ajustar a entrega de agentes ativos e aumentar sua eficácia biológica.I would like to acknowledge the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) for my PhD scholarship (PD/BD/143140/2019)

Alterações climáticas e recursos hídricos: avaliação dos impactos e implementação de soluções sustentáveis

Programa doutoral em Molecular and Environmental Biology (ramo do conhecimento em Evolution, Biodiversity and Ecology)As alterações climáticas são um problema global premente que coloca ameaças significativas aos recursos hídricos. O aumento da temperatura, as mudanças nos padrões de precipitação, e a maior frequência e intensidade de eventos climáticos extremos estão a afetar a quantidade, qualidade e disponibilidade de água, com implicações profundas em setores vitais como a agricultura, a energia e o abastecimento de água potável. Antecipar os impactos das alterações climáticas nos recursos hídricos e identificar estratégias de adaptação viáveis, como práticas agrícolas sustentáveis, tornou-se assim uma área de investigação de extrema importância. Nesta tese de doutoramento, foram analisados os impactos das alterações climáticas em usos múltiplos da água, juntamente com a eficácia de práticas agrícolas sustentáveis como estratégia de adaptação, usando o modelo hidrológico SWAT na bacia do Rio Cávado, uma área de elevada importância para os recursos hídricos em Portugal. O nosso estudo revelou que as alterações climáticas devem reduzir a entrada de água nos reservatórios e a produção de energia hidroelétrica, o que pode prejudicar a transição energética para fontes renováveis. Também foi verificado que uma combinação de práticas agrícolas sustentáveis, incluindo a incorporação de fertilizantes, mobilização reduzida do solo, e faixas de vegetação ripária, podem reduzir substancialmente a exportação de sedimentos e nutrientes, e melhorar a qualidade da água. Em cenários de alterações climáticas, as práticas agrícolas sustentáveis foram eficazes na mitigação dos impactos na qualidade da água, mas práticas múltiplas serão necessárias para alcançar benefícios mais elevados. Além disso, este estudo mostrou que as alterações climáticas devem intensificar a frequência de meses em que o caudal do rio fica abaixo do limiar do caudal ecológico, após a captação de água para abastecimento, o que significa que o abastecimento de água, a serem mantidos os níveis de captação de águas atuais, ocorrerá às custas de uma maior degradação ambiental. No geral, os nossos resultados destacam a importância de considerar os impactos das alterações climáticas em usos múltiplos da água e a necessidade de abordagens integradas de gestão de recursos hídricos que considerem as interações entre as alterações climáticas, práticas agrícolas e quantidade e qualidade da água. Os resultados deste estudo podem auxiliar na formulação de políticas e na tomada de decisão para proteger os recursos hídricos e desenvolver estratégias de adaptação eficazes às alterações climáticas.Climate change has emerged as a pressing global issue posing significant threats to water resources. Rising temperatures, altered precipitation patterns, and increased frequency and intensity of extreme weather events are affecting the quantity, quality, and availability of water, with profound implications for vital sectors such as agriculture, energy, and drinking water supply. Anticipating the impacts of climate change on water resources and identifying viable adaptation strategies, such as sustainable agricultural practices, has become a critical research area. In this PhD thesis, the impacts of climate change on multiple water uses are examined and the effectiveness of sustainable agricultural practices as an adaptation strategy is assessed, using the SWAT hydrological model in the Cávado River basin, a strategically important area for water resources in Portugal. Results showed that climate change is projected to reduce reservoir inflow and hydropower generation, potentially hampering the renewable energy transition. Moreover, the combination of sustainable agricultural practices, including fertilizer incorporation, conservation tillage, and filter strips, can substantially reduce sediments and nutrient export, and improve water quality. In the realm of future climate projections, sustainable agricultural practices were proven effective in mitigating the impacts of climate change on water quality, but multiple practices are necessary to achieve higher benefits. Furthermore, climate change is expected to intensify the frequency of months when river flow falls below the ecological threshold following water abstraction for drinking water treatment, meaning that drinking water supply, if current water abstraction levels are maintained, will occur at the expense of additional environmental degradation. Overall, results highlight the importance of considering the impacts of climate change on multiple water uses and the need for adopting integrated water resource management strategies that consider the interactions between climate change, agricultural practices, and water quantity and quality. The results of this study can inform policy and decision-making processes for safeguarding water resources and developing effective adaptation strategies in response to the challenges posed by climate change.Finally, I would like to express my gratitude to the funding agencies and institutions that have supported my research work, namely Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) (SFRH/BD/141486/2018) and the European Social Fund through the “Programa Operacional Regional do Norte” of the European Commission. Without their financial support, this research would not have been possible. I also thank the support of the CLIMALERT project: Climate AlertSmart System for Sustainable Water and Agriculture, an ERA-NET initiated by JPI Climate (ERA4CS programme) co-funded by the EU commission (Grant Agreement 690462) and FCT (ERA4CS/0004/2016), the STREAMECO project (PTDC/CTA-AMB/31245/2017), funded by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) and the European Regional Development Fund (ERDF) through the COMPETE2020—Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI), and the River2Ocean project (NORTE-01-0145- FEDER 000068), co-financed by the European Regional Development Fund (ERDF), through Programa Operacional Regional do Norte (NORTE 2020)

Effect of hyaluronan molecular weight on the stability and biofunctionality of microfibers assembled by interfacial polyelectrolyte complexation

Nervous system disorders are characterized by a progressive loss of function and structure of neurons that ultimately leads to a decline in cognitive and motor functions. In this study, we used interfacial polyelectrolyte complexation (IPC) to produce fibers for neural tissue regeneration. IPC is a processing method that allows spinning of sensitive biopolymers. The rate of spinning and the properties of the used biopolymers (charge and molecular weight) influence different characteristics of the fibers such as size and stability, among others. We used two major components of the neuronal stem cell niche, the polycationic collagen (Col) and the polyanionic hyaluronic acid (HA), to obtain bioactive fibers. We tested HA with different molecular weights and found that HA with medium and high molecular weights (350 and 1200 kDa, respectively) enabled drawing of microfibers with a homogeneous distribution of Col and HA, whereas low-molecular-weight HA (40 kDa) did not allow spinning. The obtained microfibers showed high swelling ability in a physiological buffer: their diameters increased more than 5-fold from their dry state. At these conditions, the tensile storage moduli of the fibers were similar to nervous tissues. Collagenase and hyaluronidase did not change the morphology of the fibers for up to 3 days but reduced their moduli 2- to 3-fold. Assays with PC12 neuronal-like cells showed that IPC microfibers support cell adhesion and viability regardless of the molecular weight of the used HA.This work was supported by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (project OncoNeoTreat, grant number PTDC/CTM-REF/0022/2020), cofinanced by FCT─OE component (DOI: 10.54499/PTDC/CTM-REF/0022/2020), Funding “Base” (DOI: 10.54499/UIDB/50026/2020), Funding “Programático” (DOI: 10.54499/UIDP/50026/2020), and Funding “Complementar─LA” (DOI: 10.54499/LA/P/0050/2020). R.R.C. acknowledges FCT for support through grant 2022.00764.CEECIND/CP1718/CT0020 (DOI: 10.54499/2022.00764.CEECIND/CP1718/CT0020). D.S.C. acknowledges FCT for support through grant DL57/2016/CP1377/CT0092 (DOI: 10.54499/DL57/2016/CP1377/CT0092). C.C. acknowledges FCT for support through grant SFRH/BD/143209/2019. The authors would like to thank the contributions to this research from the project “TERM RES Hub–Scientific Infrastructure for Tissue Engineering and Regenerative Medicine,” reference PINFRA/22190/2016 (Norte-01-0145-FEDER-022190), funded by the Portuguese National Science Foundation (FCT) in cooperation with the Northern Portugal Regional Coordination and Development Commission (CCDR-N), for providing relevant lab facilities, state-of-the art equipment, and highly qualified human resources

Finding the tail of a distribution: analysis of a method based on the coefficient of variation

Estimation at extreme values focuses on the tail of the data distribution, where observations are scarce. One of the key issues in inference on extreme values is knowing where this tail begins. This is a widely studied topic in the literature, with various methods available for this purpose. This study aims to investigate one of these methods presented in the literature. The performance of the method will be evaluated based on a computational simulation study. We identify strengths and/or constraints of the method which may be useful for users. The method will be applied to real data, with the goal of estimating parameters of rare events, like the risky measures, Value-at-Risk and Expected Shortfall

Brazilian trans artivism, comics and communities, between digital and print: the cases of Pequenas felicidades trans and Transistorizada

This article looks at the intersection of web-based comics and print graphic memoirs authored by transgender Brazilian comics artists. Brazilian comics have in recent years opened up to internet platforms, a change that has proved particularly fruitful for LGBTQ+ artists, traditionally marginalised by the Brazilian comics industry. The article examines two case studies – those of Luiza Lemos and Alice Pereira, both authors of comics originally posted on social media and later published in print. By means of a mixed methodology that brings together semi-structured interviews with the authors and close readings, this contribution investigates the dynamics regulating the creative and publishing processes of these works, as well as the relationship that they entertain with the practice of transsexual self-narration and self-portraiture

Otimização das condições de expressão de péptidos para formulações cosméticas

Dissertação de mestrado em BiotecnologiaNas últimas décadas, os péptidos e proteínas têm sido cada vez mais reconhecidos pelos seus efeitos benéficos em formulações cosméticas. A tecnologia de DNA recombinante tem desempenhado um papel fundamental na síntese destes compostos, frequentemente derivados de bactérias, leveduras ou células de mamíferos. A levedura Pichia pastoris destaca-se como um sistema de expressão popular, graças à sua rápida taxa de crescimento, facilidade de manipulação e eficiência em modificações pós tradução. A presença do promotor PAOX1 potencializa a expressão da proteína recombinante quando induzida com metanol. Apesar das vantagens mencionadas, desafios como o enrolamento incorreto de proteínas e a degradação por protéases podem afetar os rendimentos na produção de péptidos. Para superar estes obstáculos, diversas estratégias são utilizadas, incluindo a otimização de estirpes, modulação das condições de crescimento e expressão, bem como processos de purificação. Neste estudo, utilizou-se a estirpe P. pastoris GS115, que incorporava a sequência da albumina sérica humana (HSA) fundida com a repetição de um (1P), quatro (4P) e sete (7P) péptidos, na região C-terminal. A taxa de crescimento destas quatro estirpes foi inicialmente avaliada em quatro meios de cultura diferentes (BMGY, MGY, BSM e FM22), em que o meio BMGY demonstrou uma maior taxa específica de crescimento e tempos de duplicação mais rápidos. Posteriormente, o meio BMMY foi utilizado para os ensaios de expressão proteica. As técnicas de SDS-PAGE e Western blot revelaram, que nos primeiros ensaios com uma concentração de 0,5% (v/v) de metanol, apenas a estirpe GS115-HSA-4P apresentou expressão da proteína ao longo de 72 horas. Consequentemente, a concentração de metanol foi aumentada para 2,5% (v/v), o que fez com que a estirpe GS115-HSA-1P expressasse a proteína de interesse, após 48 horas, embora numa forma degradada. Além disso, diversas fontes de azoto foram testadas, incluindo ureia, glicina, acetato de amónio e sulfato de amónio, sendo que este último apresentou melhores resultados. Com base nestas descobertas, o sulfato de amónio foi utilizado como fonte de azoto para futuras experiências. Ao explorar diferentes valores de pH (6, 7 e 8), observou-se que o pH 8 foi o mais favorável para a expressão. Em conclusão, estes resultados contribuíram significativamente para o desenvolvimento de uma plataforma mais eficiente para a produção de péptidos, com potencial promissor para aplicações em formulações cosméticas.Over the last decades, peptides and proteins have gained recognition for their beneficial effects in cosmetic formulations. Recombinant DNA technology has played a pivotal role in synthesizing these compounds, often derived from bacteria, yeast, or mammalian cells. Pichia pastoris, a yeast, stands out as a popular expression system due to its rapid growth rate, ease of manipulation, and proficiency in post-translational modifications. The presence of the PAOX1 promoter enhances recombinant protein expression when induced with methanol. Despite these advantages, challengessuch as protein misfolding and degradation by proteases can impact peptide production yields. To address these challenges, various strategies, including strain optimization, modulation of growth and expression conditions, and refining purification processes, can be employed. This study focuses on the P. pastoris GS115 strain, incorporating the human serum albumin (HSA) sequence fused with the repetition of one (1P), four (4P), and seven (7P) peptides in the C-terminal region. The growth rate of these four strains was initially evaluated in four different culture media (BMGY, MGY, BSM, and FM22), with BMGY demonstrating higher specific growth rate and faster doubling times. Subsequently, BMMY medium was used for protein expression assays. SDS-PAGE and Western blot techniques revealed that, in the first assays with 0.5% (v/v) methanol concentration, only the GS115-HSA 4P strain exhibited protein expression within 72 hours. Consequently, methanol concentration was increased to 2.5% (v/v), leading to GS115-HSA-1P expressing the protein of interest after 48 hours, albeit in a degraded form. Additionally, different nitrogen sources (urea, glycine, ammonium acetate, and ammonium sulfate) were tested, with ammonium sulfate yielding better results. Based on these findings, ammonium sulfate was utilized as a nitrogen source for subsequent experiments. Exploring different pH values (6, 7, and 8), revealed that pH 8 was more favourable to expression. In conclusion, these insights significantly contributed to the development of a more efficient platform for peptide production, holding promising potential for applications in cosmetic formulations

Relações para-sociais no âmbito dos entusiastas de celebridades tradicionais, ficcionais e micro: explorar os seus efeitos ao nível do comportamento do consumidor e emoções

Tese de doutoramento em Business AdministrationWith the proliferation of social media, there is an increasing presence of media figures and celebrities online, ranging from 1) real human celebrities, termed traditional celebrities (e.g. Adele); 2) microcelebrities or influencers (e.g. someone with a large follower base on social media platforms) to 3) fictional celebrities (e.g. Harry Potter). This increasingly drives the development of PSRs. Yet while scholarship on PSRs continually expanded, its effectiveness on consumer behaviors in new media contexts and among different celebrity types has received little attention. To address this gap three complementary studies are conducted. The first two studies are quantitative, focusing on the impact of PSRs with micro and traditional celebrities on online source credibility, brand credibility, and purchase intention, specifically on Instagram. The third study is qualitative, focusing on the hedonic aspects of PSR with fictional celebrities, specifically in virtual environments. This research contributes to theory by providing a comprehensive understanding of PSRs with three celebrity types. Moreover, it validates Djafarova and Trofimenko’s (2019) online source credibility model and highlights the limitations of using the traditional Ohanian (1990) source credibility model in online contexts. Results show increasing similarities between micro-celebrities and traditional celebrities affecting the development of PSRs, perceived credibility, and purchase intentions. Furthermore, findings show how hedonic aspects of PSR with fictional celebrities in virtual contexts affect consumers’ well-being. These findings offer valuable marketing insights for practitioners and highlight the importance of ethical considerations.A proliferação do uso de redes sociais no domínio do social media aumentou a presença de personagens e celebridades online, variando entre 1) celebridades humanas (pessoas reais) (e.g., Adele); 2) micro-celebridades ou influencers (e.g., alguém que dispõe de uma base de seguidores relevante nas diversas plataformas) e 3) celebridades ficcionais (e.g., Harry Potter). Estes diferentes tipos de celebridades têm um papel relevante no desenvolvimento de relacionamentos de natureza parassocial (RP). Todavia, apesar do conhecimento académico desta realidade estar em expansão, a sua compreensão no domínio do comportamento do consumidor em novos contextos de media social, designadamente os diferentes tipos de celebridades ainda não têm sido alvo de grande estudo e interesse. Com a finalidade de preencher este gap foram conduzidos três estudos distintos mas complementares. Os primeiros dois estudos de natureza mais quantitativa, focam-se no impacto dos relacionamentos parassociais. Mais especificamente, numa primeira etapa nas micro-celebridades e, numa segunda etapa, na comparação entre celebridades do tipo micro vs tradicionais. Para o efeito, desenvolveu-se um modelo que incorporou três grandes conceitos, designadamente: a credibilidade da fonte, a credibilidade da marca e a intenção de compra, mais especificamente no âmbito do Instagram. O terceiro estudo, por seu turno, tem uma natureza qualitativa, e centra-se numa vertente mais hedónica dos relacionamentos parassociais, em particular no que se refere às celebridades ficcionais em ambientes virtuais. Neste sentido, esta pesquisa contribui para o conhecimento (ou teoria) proporcionando uma melhor compreensão da natureza dos relacionamentos parassociais tendo em conta três tipos de celebridades. Para além disso, o estudo valida o modelo de credibilidade da fonte proposto por Djafarova e Tronfimenko (2019) sublinhando algumas limitações do modelo tradicional proposto por Ohanian (1990) sobre a temática relativa à credibilidade da fonte em contextos online. Os resultados evidenciam inúmeras semelhanças entre o grupo das micro-celebridades e das celebridades tradicionais, ambos afetando o desenvolvimento de relacionamentos parassociais, de credibilidade percebida e inteção de compra. Para além disto, os resultados revelaram como é que os aspetos hedónicos dos relacionamentos parassociais com as celebridades ficcionais em ambientes virtuais influenciam o bem estar dos consumidores. Estes resultados afiguram-se particularmente relevantes para os académicos e marketeers, reforçando a importância da vertente ética

Otimização gradual da biossíntese de curcumina em Saccharomyces cerevisiae usando técnicas de biologia sintética

Tese de doutoramento em Chemical and Biological EngineeringCurcumin is the main active compound found in the rhizomes of turmeric (Curcuma longa). The reported biological activities of curcumin include anti-inflammatory, antioxidant, and anti-cancer. Hereupon, curcumin has seen a substantial market growth emerging as one of the most studied natural therapeutic products. However, curcumin extraction from turmeric remains challenging. Therefore, the microbial production emerges as a viable solution for curcumin production. The biosynthesis of curcumin starts with the phenylpropanoid pathway where tyrosine/phenylalanine are converted to ferulic acid. Ferulic acid is then activated through condensation with a CoA molecule and diketide-CoA synthase (DCS) and curcumin synthase (CURS), synthesize curcumin from two molecules of activated ferulic acid and one malonyl-CoA molecule. Metabolic engineering of microorganisms to produce curcumin was mainly achieved in Escherichia coli. Herein, we intend to synthesize curcumin in a genetic modified Saccharomyces cerevisiae. Firstly, the biosynthesis of curcumin from ferulic acid was evaluated in yeast using a plasmid system. The highest curcumin titers were obtained by expressing a feruloyl-CoA synthase (FerA) from Pseudomonas paucimobilis and DCS and CURS from C. longa. The deletion of ferulic acid decarboxylase improved curcumin production reaching 2.7 mg/L from 30 mg/L of ferulic acid. Next, the artificial pathway composed by FerA, DCS and CURS was integrated into yeast genome using a CRISPR-Cas9. To convert p-coumaric acid into curcumin, caffeic acid Omethyltransferase from Arabidopsis thaliana and 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase from Pseudomonas aeruginosa, along with the reductase component from Salmonella enterica were introduced. The pathway was integrated into a p-coumaric acid overproducing strain leading to de novo curcumin biosynthesis. The enhancement of fluxes through the phenylpropanoid pathway led to the synthesis of 4.2 mg/L of curcumin with methionine supplementation. Bioreactor experiments significantly improved curcumin production relatively to flask experiments. Additionally, extracts from rice residues were used as substrates for curcumin production, surpassing the levels obtained with standard media. The curcumin levels reported in this study are the highest documented thus far in genetically engineered yeast. Overall, this thesis marks progress in advancing the development of an efficient S. cerevisiae cell factory for curcumin production.A curcumina é o principal composto ativo encontrado nos rizomas do açafrão (Curcuma longa). As atividades biológicas reportadas da curcumina incluem ação anti-inflamatória, antioxidante e anticancerígena. O mercado da curcumina tem aumentando substancialmente sendo atualmente um dos produtos terapêuticos naturais mais estudados. Contudo, a extração natural de curcumina tem limitações associadas. A produção microbiana surge como uma solução viável para a sua produção. A biossíntese da curcumina começa com a via dos fenilpropanóides, onde a tirosina/fenilalanina são convertidas em ácido ferúlico. Este é ativado através da condensação com uma molécula de CoA, e a dicetídeo-CoA sintase (DCS) e a curcumina sintase (CURS) sintetizam curcumina a partir de duas moléculas de ácido ferúlico ativado e uma de malonil-CoA. A modificação genética de microrganismos para produzir curcumina foi principalmente estudada em Escherichia coli. Neste trabalho, pretendemos sintetizar curcumina em Saccharomyces cerevisiae. Inicialmente, a biossíntese de curcumina em levedura foi avaliada a partir do ácido ferúlico usando um sistema em plasmídeo. As maiores concentrações de curcumina foram obtidas ao expressar a feruloyl-CoA sintase (FerA) de Pseudomonas paucimobilis e DCS e CURS de C. longa. A deleção da ácido ferúlico descarboxílase melhorou a produção de curcumina, atingindo 2,7 mg/L a partir de 30 mg/L de ácido ferúlico. Em seguida, a via artificial composta por FerA, DCS e CURS foi integrada no genoma de levedura usando CRISPR-Cas9. Para conversão de ácido cumárico em curcumina, foram introduzidas a ácido cafeico O-metiltransferase de Arabidosis thaliana e a 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase de Pseudomonas aeruginosa juntamente com a componente redutase de Salmonella enterica. A via foi integrada numa estirpe produtora de ácido cumárico, alcançando a biossíntese de curcumina a partir de glucose. O aumento dos fluxos na via dos fenilpropanóides levou à produção de 4,2 mg/L de curcumina após suplementação de metionina. Os ensaios em reator aumentaram significativamente a produção de curcumina relativamente aos obtidos em frasco. Além disso, extratos de resíduos da indústria do arroz foram usados como substratos para produção de curcumina, tendo sido obtidos melhores resultados comparativamente com o meio tradicional. Os níveis de curcumina reportados aqui são os mais altos documentados até o momento em levedura geneticamente modificada. No geral, esta tese marca o progresso no desenvolvimento de uma fábrica celular para a produção de curcumina.This study was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) under the scope of the strategic funding of UIDB/BIO/04469/2020 unit with DOI 10.54499/UIDB/04469/2020. I would also like to acknowledge FCT for funding the individual PhD scholarship SFRH/BD/138325/2018 and consequent extension COVID/BD/153247/2023

Development and implementation of a costing system in a furniture company

Dissertação de Mestrado Integrado em Engenharia e Gestão IndustrialAtualmente, a gestão de custos assume um papel fundamental nas empresas modernas, especialmente nas Pequenas e Médias Empresas (PME) nacionais, sobretudo naquelas integradas na indústria do comércio de móveis, pois vivenciam um aumento da competitividade e complexidade dos seus processos produtivos. Deste modo, surgiu a necessidade de os gestores melhor compreenderem a natureza dos custos e de que forma estes afetam as organizações. Assim, os sistemas de custeio surgiram como forma de auxiliar na gestão e no controlo dos custos nas empresas. Os custos podem assumir várias formas e, portanto, existem também diversos métodos de apuramento. Deste modo, foi selecionada uma amostra de diferentes custos e métodos de apuramento para a realização deste projeto. Com a presente dissertação, pretendeu-se desenvolver um modelo de custeio que permita o cálculo e a análise de todos os custos que serão imputados à empresa, ao mesmo tempo que permite associar estes custos aos produtos produzidos. Com esse propósito, a metodologia foi implementada em ambiente empresarial, através da Investigação-Ação, que serviu como forma de trabalho mais direta com a empresa. Os principais resultados obtidos mostram que o sistema de custeio da empresa foi melhorado, permitindo ter uma maior perceção dos custo de cada produto, assim como do custo de cada operação. Também se verificou que o sistema de custo atualmente utilizado pela empresa não orçamenta da forma mais correta os móveis, pois constatou-se que determinados móveis apresentavam um custo efetivo superior e outros inferior. O facto de o modelo de custeio desenvolvido apresentar todas as operações, e o seu respetivo custo, permite ainda à empresa verificar se existe, ou não, vantagem em realizar cada uma das operações ou se é mais vantajoso subcontratar.Currently, cost management plays a key role in modern companies, especially in Small and Medium-sized Enterprises (SME), namely those in the furniture market industry, as they experience an increase in the competitiveness and complexity of their production processes. Therefore, the need for managers to better understand the nature of costs and how they affect organizations was recognized, and, costing systems emerged to assist in the management and control of costs in companies. Costs can take many forms and, consequently, there are also different methods of calculating costs, that will be presented throughout this dissertation. With this dissertation, it was aimed to develop a costing model that allows the calculation and analysis of all costs that will be charged to the company and associate these costs with the produced products. The methodology was implemented in a business environment, through Investigation-Action, allowing a straighter work with the company. The main results obtained show that the company’s costing system was improved, allowing the company to have a better perception of the cost of each product, as well as the cost of each operation. It was also found that the costing system currently used by the company does not budget the furniture in the most correct way, since certain furniture have a higher effective cost and others lower. Considering the fact that this developed costing model includes all operations and their respective cost, it also allows the company to verify whether or not there is an advantage in carrying out each operation or whether it is more advantageous to subcontract

Engenharia metabólica para a produção sustentável de ácidos gordos insaturados de cadeia ramificada em Saccharomyces cerevisiae

Tese de doutoramento em BiologyOs ácidos gordos e derivados são moléculas com crescente relevância biotecnológica e económica. A levedura Saccharomyces cerevisiae destaca-se como uma plataforma promissora para a produção de ácidos gordos em grande escala e especializados através de engenharia metabólica. Em particular, os ácidos gordos de cadeia média são essenciais para a síntese de capsaicinoides, alcaloides bioativos com propriedades anti-inflamatórias. Esta tese aborda a produção dos ácidos gordos que constituem os cap saicinoides em S. cerevisiae usando um sistema híbrido de síntese de ácidos gordos II (FASII) de origem bacteriana e Arabidopsis thaliana. O FASII é composto por polipéptidos individuais e monofuncionais, e uma tioesterase (TE) é responsável por libertar o ácido gordo do sistema, controlando o comprimento do ácido gordo livre. Nesta tese, o FASII foi coexpresso com quatro TEs de plantas, específicas para ácidos gordos de cadeia média. A maioria dos capsaicinoides, possui ácidos gordos de cadeia ramifi cada. Portanto, desenvolvemos um sistema para produzir os iniciadores ramificados da síntese usando desidrogenases de α-cetoácidos de cadeia ramificada (BCKDH). A atividade da BCKDH de Bacillus subtilis e Yarrowia lipolytica não foi observada, nem a complementação de fenótipos ao incorporar o complexo numa via de degradação de leucina ou de síntese de mevalonato. Os substratos lignocelulósicos, poten cial matéria-prima de combustível renovável e produtos químicos, contêm quantidades significativas do açúcar D-xilose. Para metabolizar D-xilose, clonamos em S. cerevisiae uma nova isomerase de D-xilose (XI) derivada de microorganismos do intestino do escaravelho que se alimenta de madeira Odontotae nius disjunctus. A expressão da nova XI resultou num crescimento aeróbico mais rápido do que a XI de Piromyces sp. E2 em meio com D-xilose. A nova XI apresentou atividade específica 2.6 vezes maior, um KM para D-xilose 37% menor e exibiu maior atividade numa gama de temperatura mais ampla, retendo 51% da atividade máxima a 30 ºC, em comparação com apenas 29% de atividade para a XI de Piromyces.Fatty acids and their derivatives are molecules with growing biotechnological and economic relevance. The yeast Saccharomyces cerevisiae stands as a promising platform for the production of bulk and spe cialty fatty acids through metabolic engineering. In particular, medium-chain fatty acids are essential for the synthesis of capsaicinoids, a class of bioactive alkaloids with anti-inflammatory properties. This thesis addresses the production of the fatty acid moieties of the capsaicinoids in S. cerevisiae using a hybrid bacterial/Arabidopsis thaliana fatty acid synthase system II (FASII). The FASII consists of discrete, mono functional polypeptides and is thus easily customizable. A thioesterase (TE) is responsible for releasing the fatty acyl from the system controlling the length of the free fatty acid. Here, the FASII was co-expressed with four plant TEs specific for medium-chain acyls. Most capsaicinoids, including capsaicin, carry branched chain acyls. Hence, we also engineered a system for producing the branched starters of the synthesis by means of branched-chain α-keto acid dehydrogenases (BCKDH). The in vitro activity of the BCKDH from Bacillus subtilis and Yarrowia lipolytica could not be discerned, nor phenotype complementation by incorporating the complex into a leucine degradation pathway and a mevalonate synthesis pathway. Ligno cellulosic substrates, a primary source of potentially renewable fuel and bulk chemicals, contain significant amounts of the pentose sugar D-xylose. To confer S. cerevisiae the ability to metabolize D-xylose, a new D xylose isomerase (XI) derived from microorganisms in the gut of the wood feeding beetle Odontotaenius disjunctus was synthesized and cloned. Expression of the new XI resulted in faster aerobic growth than the XI from Piromyces sp. E2 on D xylose media. The newly described XI displayed 2.6 times higher spe cific activity, 37% lower KM for D xylose, and exhibited higher activity over a broader temperature range, retaining 51% of maximal activity at 30 °C compared with only 29% activity for the Piromyces XI