Otimização gradual da biossíntese de curcumina em Saccharomyces cerevisiae usando técnicas de biologia sintética

Abstract

Tese de doutoramento em Chemical and Biological EngineeringCurcumin is the main active compound found in the rhizomes of turmeric (Curcuma longa). The reported biological activities of curcumin include anti-inflammatory, antioxidant, and anti-cancer. Hereupon, curcumin has seen a substantial market growth emerging as one of the most studied natural therapeutic products. However, curcumin extraction from turmeric remains challenging. Therefore, the microbial production emerges as a viable solution for curcumin production. The biosynthesis of curcumin starts with the phenylpropanoid pathway where tyrosine/phenylalanine are converted to ferulic acid. Ferulic acid is then activated through condensation with a CoA molecule and diketide-CoA synthase (DCS) and curcumin synthase (CURS), synthesize curcumin from two molecules of activated ferulic acid and one malonyl-CoA molecule. Metabolic engineering of microorganisms to produce curcumin was mainly achieved in Escherichia coli. Herein, we intend to synthesize curcumin in a genetic modified Saccharomyces cerevisiae. Firstly, the biosynthesis of curcumin from ferulic acid was evaluated in yeast using a plasmid system. The highest curcumin titers were obtained by expressing a feruloyl-CoA synthase (FerA) from Pseudomonas paucimobilis and DCS and CURS from C. longa. The deletion of ferulic acid decarboxylase improved curcumin production reaching 2.7 mg/L from 30 mg/L of ferulic acid. Next, the artificial pathway composed by FerA, DCS and CURS was integrated into yeast genome using a CRISPR-Cas9. To convert p-coumaric acid into curcumin, caffeic acid Omethyltransferase from Arabidopsis thaliana and 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase oxygenase from Pseudomonas aeruginosa, along with the reductase component from Salmonella enterica were introduced. The pathway was integrated into a p-coumaric acid overproducing strain leading to de novo curcumin biosynthesis. The enhancement of fluxes through the phenylpropanoid pathway led to the synthesis of 4.2 mg/L of curcumin with methionine supplementation. Bioreactor experiments significantly improved curcumin production relatively to flask experiments. Additionally, extracts from rice residues were used as substrates for curcumin production, surpassing the levels obtained with standard media. The curcumin levels reported in this study are the highest documented thus far in genetically engineered yeast. Overall, this thesis marks progress in advancing the development of an efficient S. cerevisiae cell factory for curcumin production.A curcumina é o principal composto ativo encontrado nos rizomas do açafrão (Curcuma longa). As atividades biológicas reportadas da curcumina incluem ação anti-inflamatória, antioxidante e anticancerígena. O mercado da curcumina tem aumentando substancialmente sendo atualmente um dos produtos terapêuticos naturais mais estudados. Contudo, a extração natural de curcumina tem limitações associadas. A produção microbiana surge como uma solução viável para a sua produção. A biossíntese da curcumina começa com a via dos fenilpropanóides, onde a tirosina/fenilalanina são convertidas em ácido ferúlico. Este é ativado através da condensação com uma molécula de CoA, e a dicetídeo-CoA sintase (DCS) e a curcumina sintase (CURS) sintetizam curcumina a partir de duas moléculas de ácido ferúlico ativado e uma de malonil-CoA. A modificação genética de microrganismos para produzir curcumina foi principalmente estudada em Escherichia coli. Neste trabalho, pretendemos sintetizar curcumina em Saccharomyces cerevisiae. Inicialmente, a biossíntese de curcumina em levedura foi avaliada a partir do ácido ferúlico usando um sistema em plasmídeo. As maiores concentrações de curcumina foram obtidas ao expressar a feruloyl-CoA sintase (FerA) de Pseudomonas paucimobilis e DCS e CURS de C. longa. A deleção da ácido ferúlico descarboxílase melhorou a produção de curcumina, atingindo 2,7 mg/L a partir de 30 mg/L de ácido ferúlico. Em seguida, a via artificial composta por FerA, DCS e CURS foi integrada no genoma de levedura usando CRISPR-Cas9. Para conversão de ácido cumárico em curcumina, foram introduzidas a ácido cafeico O-metiltransferase de Arabidosis thaliana e a 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase de Pseudomonas aeruginosa juntamente com a componente redutase de Salmonella enterica. A via foi integrada numa estirpe produtora de ácido cumárico, alcançando a biossíntese de curcumina a partir de glucose. O aumento dos fluxos na via dos fenilpropanóides levou à produção de 4,2 mg/L de curcumina após suplementação de metionina. Os ensaios em reator aumentaram significativamente a produção de curcumina relativamente aos obtidos em frasco. Além disso, extratos de resíduos da indústria do arroz foram usados como substratos para produção de curcumina, tendo sido obtidos melhores resultados comparativamente com o meio tradicional. Os níveis de curcumina reportados aqui são os mais altos documentados até o momento em levedura geneticamente modificada. No geral, esta tese marca o progresso no desenvolvimento de uma fábrica celular para a produção de curcumina.This study was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) under the scope of the strategic funding of UIDB/BIO/04469/2020 unit with DOI 10.54499/UIDB/04469/2020. I would also like to acknowledge FCT for funding the individual PhD scholarship SFRH/BD/138325/2018 and consequent extension COVID/BD/153247/2023