The Role of Chunks in the Development of Speech Fluency in Teaching German as a Foreign Language in China

Die vorgelegte Dissertation untersucht empirisch anhand einer Interventionsstudie, ob und inwiefern chunkbasierter Unterricht einen Einfluss auf die Flüssigkeit von DaF-Lernenden hat. Hierzu wendet der Autor ein Prä-/Post-Test Design mit einer Interventions- und einer Kontrollgruppe an, die er nach einer sechswöchigen Intervention vergleichend untersucht.The present dissertation empirically examines, through an intervention study, whether and to what extent chunk-based instruction influences the fluency of learners of German as a foreign language. For this purpose, the author employs a pre-/post-test design with an intervention and a control group, which are compared after a six-week intervention

Vergleichende Analyse der Sequenzierung des Genoms der 16S ribosomalen RNA in voller Länge in menschlichen Fäkalproben unter Verwendung von Primer-Sets mit unterschiedlichem Degenerationsgrad

Die Nanopore-Sequenzierung hat in der Mikrobiomforschung bedeutende Fortschritte ermöglicht. Durch ihre Portabilität können Sequenzierungsgeräte in tragbaren Formaten hergestellt werden, was eine Vielzahl von Anwendungen eröffnet. Die Fähigkeit zur Echtzeit-Sequenzierung ermöglicht die direkte DNA- oder RNA-Analyse während des Sequenzierungsprozesses, was sowohl eine beschleunigte Diagnosestellung als auch die dynamische Überwachung biologischer Prozesse unterstützt. Ein wesentlicher Vorteil der Nanopore-Technologie liegt in den langen Leselängen, die eine vollständige Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens ermöglichen. Dies erlaubt eine differenzierte Charakterisierung komplexer mikrobieller Gemeinschaften sowie die Detektion seltener oder schwer sequenzierbarer Mikroorganismen. Die umfassendere Analyse der mikrobiellen Diversität in unterschiedlichen Umgebungen trägt entscheidend dazu bei, die biologischen Prozesse und Interaktionen innerhalb des Mikrobioms präziser zu erfassen und besser zu verstehen. In der vorliegenden Studie wurde die Leistungsfähigkeit zweier unterschiedlicher Primer-Sets für die vollständige Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens untersucht. Dazu wurden das Primer-Set (27F-I), das Teil des 16S Barcoding-Kit von Oxford Nanopore Technologies ist, und ein stärker degeneriertes Primer-Set (27F-II) miteinander verglichen. Die Analyse umfasste insgesamt 73 Stuhlproben. Es zeigten sich signifikante Unterschiede sowohl in der taxonomischen Vielfalt als auch in den relativen Häufigkeiten zwischen den beiden untersuchten Primer-Sets. Das Primer-Set 27F-I wies eine deutlich geringere Biodiversität auf, mit einer Dominanz von Firmicutes und Proteobakterien sowie einem erhöhten Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes im Vergleich zum stärker degenerierten Primer-Set (27F-II). Das stärker degenerierte Primer-Set 27F-II lieferte eine genauere Repräsentation der mikrobiellen Zusammensetzung, wie sie in westlichen Industriegebieten im Rahmen des American Gut Project dokumentiert wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das stärker degenerierte Primer-Set (27F-II) insbesondere für die Analyse des menschlichen Mikrobioms mittels Nanopore-Sequenzierung bevorzugt eingesetzt werden sollte. Die gewonnenen Erkenntnisse könnten die Präzision und Zuverlässigkeit von Mikrobiomstudien erheblich verbessern und dadurch wesentliche Auswirklungen auf die klinische Forschung im Bereich des Mikrobioms haben.Nanopore sequencing has enabled significant advancements in microbiome research. Its portability allows for the production of sequencing devices in compact formats, opening up a wide range of applications. The real-time sequencing capability facilitates direct DNA or RNA analysis during the sequencing process, supporting both accelerated diagnostics and dynamic monitoring of biological processes. A key advantage of Nanopore technology lies in its ability to generate long read lengths, enabling the complete sequencing of the 16S rRNA gene. This allows for a more detailed characterization of complex microbial communities and the detection of rare or difficult-to-sequence microorganisms. The comprehensive analysis of microbial diversity across various environments significantly contributes to a more precise and deeper understanding of biological processes and interactions within the microbiome. This investigation assessed the effectiveness of two different primer-sets for full-length sequencing of the 16S rRNA gene. Primer-set 27F-I, included in the Oxford Nanopore Technologies (ONT) 16S Barcoding Kit, was compared with a more degenerate primer-set, 27F-II. A total of 73 stool samples were analyzed. Notable differences in taxonomic diversity and relative abundance were found between the two primer-sets. The 27F-I primer-set showed significantly reduced biodiversity, with a predominance of Firmicutes and Proteobacteria, and a higher Firmicutes-to-Bacteroidetes ratio compared to the more degenerate 27F-II primer-set. The 27F-II set offered a more accurate depiction of the microbial composition found in Western industrialized populations, as outlined in the American Gut Project. These results indicate that the 27F-II primer-set is particularly effective for human microbiome analysis using Nanopore sequencing. The findings from this research could greatly improve the precision and dependability of microbiom

Aufklärung des Mechanismus der PhoQ-Hemmung durch das kleine Protein MgrB

The PhoQ/PhoP two-component system plays an important role in sensing and responding to various environmental signals, including magnesium limitation, low pH, and antimicrobial peptides. Upon sensing the stimuli, the histidine kinase PhoQ undergoes autophosphorylation. The phosphoryl group is then transferred to a highly conserved aspartate of PhoP. The phosphorylated PhoP can bind to the PhoP-box within the promoter region of target DNAs, thereby regulating numerous gene expressions. The small membrane protein MgrB, regulated by PhoQ/PhoP, can inhibit PhoQ histidine kinase activity, thus forming a negative feedback loop. However, the mechanism of this inhibition remains largely unknown. Moreover, small proteins have been discovered across all domains of life, and small membrane proteins constitute a significant portion of newly discovered small proteins. However, functional studies of small membrane proteins are challenging due to their size limitation and hydrophobic nature. To address these questions, in this thesis, the results not only elucidate the inhibitory mechanism between PhoQ and MgrB in vivo but also present a robust approach to generate functional small membrane proteins for discovering their function. To elucidate this inhibition mechanism, the binding interface between PhoQ and MgrB was first identified using the chemical crosslinking approach, which was consistent with the AlphaFold2 model prediction. Subsequently, the crosslinking results showed that the binding of MgrB led to less crosslinking in the PhoQ transmembrane helix and linker region, indicating that MgrB pushed PhoQ transmembrane helices away from each other. The molecular dynamics simulation results also showed that the binding of MgrB led to the translocation of PhoQ's catalytic domain, which was necessary for PhoQ to bind adenosine triphosphate. These conformational changes ultimately resulted in an overall lowered PhoQ activity. Additionally, using combined approaches, our results revealed that MgrB appeared to mediate PhoQ sensing antimicrobial peptides under physiological magnesium conditions. To generate small membrane proteins in a robust approach, several small membrane proteins were synthesized functionally, such as MgrB, up to a micro-molar scale using a combination of the cell-free system and lipid sponge droplets. Additionally, the cell-free system proved to be versatile, allowing for the synthesis of small membrane proteins from both eukaryotes and prokaryotes. Furthermore, the synthesized small membrane proteins can be used for target discovery via in vitro co-immunoprecipitation. Taken together, the results demonstrate the inhibitory mechanism of PhoQ by the small membrane protein MgrB, and provide new insights into uncovering the potential functions of small membrane proteins.Das PhoQ/PhoP-Zwei-Komponenten-System spielt eine entscheidende Rolle bei der Erfassung und Reaktion auf verschiedene Umweltsignale, einschließlich Magnesiummangel, niedrigem pH-Wert und antimikrobiellen Peptiden. Nach der Erfassung der Reize unterzieht sich die Histidinkinase PhoQ der Autophosphorylierung. Die Phosphorylgruppe wird dann auf ein hoch konserviertes Aspartat von PhoP übertragen. Das phosphorylierte PhoP ist in der Lage, sich an die PhoP-Box im Promotorbereich von Ziel-DNAs zu binden und dadurch zahlreiche Genexpressionen zu regulieren. Das kleine Membranprotein MgrB, das von PhoQ/PhoP reguliert wird, kann die Histidinkinaseaktivität von PhoQ hemmen und dadurch eine negative Rückkopplungsschleife bilden. Der Mechanismus dieser Hemmung ist jedoch weitgehend unbekannt. Des Weiteren wurden kleine Proteine in sämtlichen Lebensbereichen entdeckt, wobei kleine Membranproteine einen signifikanten Anteil der neu entdeckten kleinen Proteine ausmachen. Die funktionelle Untersuchung von kleinen Membranproteinen erweist sich jedoch aufgrund ihrer Größenbegrenzung und hydrophoben Natur als anspruchsvoll. Die Ergebnisse dieser Arbeit dienen der Beantwortung der aufgeworfenen Fragen. Sie klären nicht nur den Hemmmechanismus zwischen PhoQ und MgrB in vivo auf, sondern präsentieren auch einen robusten Ansatz zur Generierung funktionaler kleiner Membranproteine zur Entdeckung ihrer Funktion. Zur Aufklärung des Hemmmechanismus wurde zunächst die Bindungsschnittstelle zwischen PhoQ und MgrB mithilfe des chemischen Crosslinking-Ansatzes identifiziert, was mit der Vorhersage des AlphaFold2-Modells übereinstimmte. Die Ergebnisse des Crosslinking zeigten, dass die Bindung von MgrB zu einer Reduktion des Crosslinking in der PhoQ-Transmembranhelix und im Verbindungsbereich führte. Dies lässt darauf schließen, dass MgrB die PhoQ-Transmembranhelices voneinander wegdrängte. Die Ergebnisse der Molekulardynamiksimulationen legen nahe, dass die Bindung von MgrB zur Translokation des katalytischen Bereichs von PhoQ führt, was für PhoQ notwendig ist, um Adenosintriphosphat zu binden. Diese konformationellen Änderungen resultieren letztlich in einer insgesamt verringerten PhoQ-Aktivität. Unsere Ergebnisse, die unter Verwendung kombinierter Ansätze gewonnen wurden, legen nahe, dass MgrB die Erfassung antimikrobieller Peptide durch PhoQ unter physiologischen Magnesiumbedingungen vermittelt. Um kleine Membranproteine robust zu generieren, wurden mehrere funktionelle kleine Membranproteine wie MgrB in einem mikromolaren Maßstab mithilfe einer Kombination aus dem zellfreien System und Lipid-Schwammtropfen synthetisiert. Darüber hinaus erwies sich das zellfreie System als vielseitig einsetzbar und ermöglichte die Synthese kleiner Membranproteine sowohl aus Eukaryoten als auch aus Prokaryoten. Des weiteren können die synthetisierten kleinen Membranproteine zur Zielerkennung mittels in vitro Co-Immunopräzipitation verwendet werden. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse den Hemmmechanismus von PhoQ durch das kleine Membranprotein MgrB und liefern neue Erkenntnisse zur Aufdeckung der potenziellen Funktionen kleiner Membranproteine

Strukturelle Grundlage der CO2-Fixierung und Energieerhaltung in Acetogenen

Die Fixierung von Kohlendioxid (CO2) hat aufgrund des beginnenden Klimawandels große Aufmerksamkeit erlangt. Eine vielversprechende Lösung dieses Problems stellt die bio-organische CO2-Reduktion durch acetogene Bakterien (Acetogene) dar. Hierbei handelt es sich um eine Gruppe anaerober Bakterien, welche CO2 binden, um in einer Umgebung mit extremen Lebensbedingungen überleben zu können. Dies erfolgt mit Hilfe eines sehr alten Stoffwechselsweges, dem Wood-Ljungdahl-Weg, der auf einzigartige Weise CO₂-Fixierung mit zwei lebensnotwendigen Bedingungen verbindet: Energieerhaltung bei gleichzeitiger Produktion von Biomasse. Diese Kopplung ist von entscheidender Bedeutung, da die Acetatbildung aus H2 und CO2 zur Bildung von lediglich 0,3 Mol ATP pro Mol Acetat führt, was die thermodynamische Grenze des Überlebens darstellt. Um mit dieser geringen Menge ATP zu überleben, nutzen Acetogene eine hochkomplexe bioenergetische Maschinerie für die CO2-Fixierung, die sowohl die Respiration als auch die Homöostase von Reduktionsäquivalenten verbindet. Der erste Schritt der CO2-Fixierung erfolgt in einigen Acetogenen durch die wasserstoffabhängige Kohlendioxid-Reduktase (HDCR), während die Redoxäquivalente durch den Elektronen bifurkierenden FeFe-Hydrogenase-Komplex HydABC erzeugt und durch einen multi-modularen Transhydrogenase-Komplex StnABC im Gleichgewicht gehalten werden. Um einen Ionengradienten für die ATP-Synthese aufzubauen, verwenden einige Acetogene schließlich die Fd:NAD+-Oxidoreduktase (Rnf) als primäres Respirationsenzym. Die extrem sauerstoffempfindliche Beschaffenheit dieser Komplexe und ihrer Redox-Kofaktoren stellt eine Herausforderung dar, um sie einer strukturellen Analyse zu unterziehen. Im Zuge der Arbeiten zu der hier vorgelegten Dissertation habe ich eine Methode zur anaeroben Vitrifizierung unter kontrollierten Redoxbedingungen zur Strukturbestimmung sauerstoffsensitiver Proteine mit Einzelpartikelanalyse etabliert. Die Determinierung mehrerer katalytischer Zustände unter bestimmten Stoffwechselbedingungen, zusammen mit biochemischen Analysen, sowie Simulationsdaten verhalfen zu einem tiefgreifenden Verständnis dieser molekularen Maschinen. Durch das Aufzeigen einer filamentösen Struktur der HDCR konnte erstmals ein enzymatisch dekorierter Nanodraht nachgewiesen werden, der sich zu großen, zellulären Bündeln zusammenfügt, um mutmaßlich CO2 optimal binden zu können. Die Aufklärung der Mechanismen von HydABC und StnABC wiederum zeigte, dass beide Enzyme eine besondere modulare Untereinheit zur Elektronenbifurkation durch Redox-gesteuerte Konformationsänderungen nutzen. Die intramolekulare Bewegung steuert die endergone und exergone Reduktion, die sich von allen anderen bisher bekannten Bifurkationsenzymen unterscheidet. Beide Komplexe verwenden das Konzept der Modularität: Durch Fusion eines bifurkierenden Moduls mit verschiedenen Untereinheiten können unterschiedliche Elektronen-Donoren genutzt werden, um so die enzymatische Vielfalt zu vergrößern. Schließlich ergab die Analyse der katalytischen Zustände des Rnf-Komplexes, dass das Enzym eine Kombination aus Redox-gesteuerten Konformationsänderungen und einem abwechselnden Durchlassmechanismus nutzt, um den Elektronentransfer mit dem Pumpen von Natriumionen zu koppeln. Dies würde ein neuartiges Prinzip für Ionenpumpen darstellen, das sich grundlegend von bisher bekannten Mechanismen unterscheidet. Die in dieser Arbeit entschlüsselten molekularen Prinzipien der Redox-gesteuerten Konformationsänderungen, des Aufbaus von Superkomplexen und der Modularität können allgemein auf anaerobe Bakterien und Archaeen angewendet werden und sind daher von großer Bedeutung für das Verständnis der Energieerhaltung und der chemischen Reaktionen, die notwendig sind, um am thermodynamischen Limit des Lebens noch überlebensfähig zu sein.Carbon dioxide (CO2) fixation and sequestration has gained significant attention due to the existential threat of climate change (1–4). Among exciting alternatives to capture and fix CO2, biological CO2 reduction by acetogenic bacteria (acetogens) stands apart (5–9). Acetogens are a phylogenetically diverse group of strictly anaerobic bacteria that fix CO2 while thriving in extremely energy-limited environments (10–14). They perform CO2 reduction using an ancient metabolic pathway known as the Wood-Ljungdahl pathway (WLP), the only known pathway that links CO2 fixation with two life-sustaining conditions: energy conservation and biomass production (15–17). However, autotrophy on H2 and CO2 results in the formation of only 0.3 moles of ATP/acetate, marking the thermodynamic limit of life (10, 12). Therefore, acetogens need efficient mechanisms to conserve and save energy. To achieve this, acetogens utilize complex, multi-subunit bioenergetic machines for CO2 fixation, generation and balance of reducing equivalents, and respiration. In some acetogens, CO2 fixation is carried out by the novel hydrogen-dependent carbon dioxide reductase (HDCR) (18); whereas, the redox equivalents are generated by the electron bifurcating, FeFe hydrogenase HydABC complex (19) and balanced by a muti-modular transhydrogenase StnABC complex(20). Finally, to establish an ion gradient for ATP synthesis, some acetogens use a Fd:NAD+ oxidoreductase (Rnf) as a primary respiratory enzyme (21). Despite their biochemical and physiological characterization, structural insights into how these protein complex’s function have remained open questions in the field of bioenergetics. A challenge that currently prevents a comprehensive understanding is the highly oxygen-sensitive nature of these protein complexes and their enzymatic redox cofactors, which often prevents structure determination. In the course of my thesis, I established a method of redox-environment controlled, anaerobic vitrification for high-resolution structure determination of oxygen susceptible proteins through single particle analysis (SPA). Additionally, this enables to image redox machinery under enzymatic turnover conditions, facilitating the determination of multiple functional states. For a comprehensive understanding of these enzymes, their cryo-EM structures were integrated with biochemical and simulation data to reveal the molecular basis of their functioning. First, I determined the filamentous structure of HDCR, uncovering the first-ever enzymatic decorated nanowire that assembles into large cellular bundles, facilitating the capture and fixation of CO2. Further, elucidation of the HydABC and StnABC complexes’ mechanisms unveiled that both utilize a unique modular subunit to perform electron bifurcation by redox-driven conformational changes. This distinctive mechanism gates the endergonic and exergonic reductions, setting it apart from all other bifurcation enzymes. More importantly, these two enzymes exemplify the concept of modularity: how a modular bifurcating subcomplex attaches to various electron input subunits, broadening the enzymatic toolkit of anaerobes. Lastly, analysis of the Rnf complex’s catalytic states revealed that the enzyme uses a combination of redox-driven conformational changes and an alternating gating mechanism to couple long-range electron transfer with sodium ion pumping. The proposed mechanism introduces a novel ion pumping principle fundamentally different from other known ion pumps. The molecular principles of redox-driven conformational changes, super complex assembly, and modularity unravelled in this thesis are broadly applicable across anaerobes, and therefore significant for our comprehension of energy conservation and challenging chemical reactions needed to subsist at the thermodynamic limit of life

Structural connectivity of low-frequency subthalamic stimulation for improving stride length in Parkinson’s disease

Background: A reduction in stride length is considered a key characteristic of gait kinematics in Parkinson’s disease (PD) and has been identified as a predictor of falls. Although low-frequency stimulation (LFS) has been suggested as a method to improve gait characteristics, the underlying structural network is not well understood. Objective: This study aims to investigate the structural correlates of changes in stride length during LFS (85 Hz). Methods: Objective gait performance was retrospectively evaluated in 19 PD patients who underwent deep brain stimulation (DBS) at 85 Hz and 130 Hz. Individual DBS contacts and volumes of activated tissue (VAT) were computed using preoperative magnetic resonance imaging (MRI) and postoperative computed tomography (CT) scans. Structural connectivity profiles to predetermined cortical and mesencephalic areas were estimated using a normative connectome. Results: LFS led to a significant improvement in stride length compared to 130 Hz stimulation. The intersection between VAT and the associative subregion of the subthalamic nucleus (STN) was associated with an improvement in stride length and had structural connections to the supplementary motor area, prefrontal cortex, and pedunculopontine nucleus. Conversely, we found that a lack of improvement was linked to stimulation volumes connected to cortico-diencephalic fibers bypassing the STN dorsolaterally. The robustness of the connectivity model was verified through leave-one-patient-out, 5-, and 10-fold cross cross-validation paradigms. Conclusion: These findings offer new insights into the structural connectivity that underlies gait changes following LFS. Targeting the non-motor subregion of the STN with LFS on an individual level may present a potential therapeutic approach for PD patients with gait disorders.Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg

Establishing the Chlamydomonas reinhardtii chloroplast as a platform for photosynthesis engineering

The detrimental effects of human activities on the environment have been clearly documented, leading to a global effort to curb industrial pollution and decrease energy consumption. Human-generated pollutants, especially carbon dioxide (CO2), play a significant role in atmospheric degradation. The dramatic increase in industrial CO2 emissions over the centuries has resulted in a concerning accumulation in the atmosphere, adversely affecting human health and ecosystem stability. Despite this, CO2 is vital for phototrophic organisms like plants, algae, and cyanobacteria, which utilize CO2 and use the carbon to create organic molecules through photosynthesis. With its unique capacity to convert light energy into inorganic carbon assimilation, it has been a central subject of scientific research, offering substantial potential for fields such as agronomy and energy production, alongside fundamental studies. Enhancing photosynthesis is a complex challenge that demands a deep understanding of its mechanisms and the creation of advanced tools for practical use. This thesis seeks to dive into into the complexities of improving photosynthetic efficiency, employing innovative methodologies from synthetic biology to enhance our comprehension and application of this essential biological process. The aim is to establish Chlamydomonas reinhardtii as a chassis for carbon fixation engineering, through the development of new tools to engineer the plastome. This should be implemented using a proof of concept photorespiratory bypass in the chloroplast of C. reinhardtii and its characterization, and by relocating the small subunit of Rubisco rbcS from the nuclear genome to the chloroplast genome. This should contribute to fortifying the chloroplast genome of C. reinhardtii as a suitable testing ground for complex endeavors, while remaining translatable to higher plants through the conservation of chloroplasts throughout the tree of life. In the first part of the thesis we show the construction of a MoClo toolkit for the chloroplast genome of C. reinhardtii, through the establishment of high-throughput part characterization pipeline. This allowed us to screen for more than 300 parts, including untranslated regions (UTRs) and promoters. By testing unique combination of regulatory elements, we identified two transcritpion units suited for the implementation of the South pathway as a photorespiratory bypass. The pathway is constituted of two genes, a glycolate dehydrogenase and a malate synthase, that were assembled in the characterized transcription units. These transgenes were transformed in the chloroplast of a characterized mutant strain displaying increased photorespiration. Through genomic, proteomic, metabolomic and phenotypic characterization in photorespiratory conditions, we show the successful implementation of the pathway. Transplastomic strains displayed reduced doubling time and final cell density compared to the mutant strains, explained by lower intermediates of natural photorespiration suggesting an increased flux in the bypass. Finally, we set out to re-localize the small subunit of Rubisco from the nuclear genome to the chloroplast genome, by transforming the endogenous Crrbcs1 gene in the chloroplast of mutant strain for rbcS and the pyrenoid. Though the knock-out strain does not behave as expected and maintains growth in minimal phototrophic conditions, the presence of the transgene was confirmed and a drastic impact on growth and cell density was exhibited in the transplastomic strain, reducing its doubling time by three compared to the mutant and reaching cell densities comparable to wild-type levels. Overall in this thesis, I have establish the basic tools and proofs of concept to use the chloroplast of C. reinhardtii as a testbed for photosynthesis engineering. By showing that we can engineer a photorespiratory bypass and re-localize the small subunit of Rubisco in the chloroplast genome, we now open the possibility of testing multiple pathways, cycles and variants in a high-throughput manner, using the established pipeline and characterized mutants.Die schädlichen Auswirkungen menschlicher Aktivitäten auf die Umwelt sind eindeutig belegt und haben zu weltweiten Bemühungen geführt, die industrielle Verschmutzung einzudämmen und den Energieverbrauch zu senken. Vom Menschen erzeugte Schadstoffe, insbesondere Kohlendioxid (CO2), spielen eine bedeutende Rolle bei der Verschlechterung der Atmosphäre. Der dramatische Anstieg der industriellen CO2-Emissionen im Laufe der Jahrhunderte hat zu einer besorgniserregenden Akkumulation in der Atmosphäre geführt, die sich negativ auf die menschliche Gesundheit und die Stabilität des Ökosystems auswirkt. Trotzdem ist CO2 für phototrophe Organismen wie Pflanzen, Algen und Cyanobakterien lebenswichtig, die CO2 abbauen und den Kohlenstoff durch Photosynthese zur Herstellung organischer Moleküle verwenden. Aufgrund seiner einzigartigen Fähigkeit, Lichtenergie in anorganische Kohlenstoffassimilation umzuwandeln, ist es ein zentrales Thema wissenschaftlicher Forschung und bietet neben Grundlagenstudien auch erhebliches Potenzial für Bereiche wie Agronomie und Energieerzeugung. Die Verbesserung der Photosynthese ist eine komplexe Herausforderung, die ein tiefes Verständnis ihrer Mechanismen und die Entwicklung fortschrittlicher Werkzeuge für den praktischen Einsatz erfordert. Diese Arbeit befasst sich mit den Komplexitäten der Verbesserung der photosynthetischen Effizienz und verwendet innovative Methoden aus der synthetischen Biologie, um unser Verständnis und unsere Anwendung dieses wesentlichen biologischen Prozesses zu verbessern. Ziel ist es, Chlamydomonas reinhardtii als Grundlage für die Kohlenstofffixierungstechnik zu etablieren, und zwar durch die Entwicklung neuer Werkzeuge zur Konstruktion des Plastoms. Dies soll durch die Implementierung eines Proof-of-Concept-Photorespiratory-Bypasses im Chloroplasten von C. reinhardtii und dessen Charakterisierung sowie durch die Verlagerung der kleinen Untereinheit von Rubisco rbcS vom Kerngenom in das Chloroplastengenom gezeigt werden. Somit soll das Chloroplastengenom von C. reinhardtii als geeignetes Testgelände für komplexe Vorhaben gestärkt werden und gleichzeitig durch die Konservierung der Chloroplasten im gesamten Baum des Lebens auf höhere Pflanzen übertragbar bleiben. Im ersten Teil der Arbeit zeigen wir die Konstruktion eines MoClo-Toolkits für das Chloroplastengenom von C. reinhardtii durch die Einrichtung einer Hochdurchsatz-Pipeline zur Teilecharakterisierung. Dies ermöglichte uns ein Screening von mehr als 300 Teilen, darunter 5’UTRs, 3’UTRs und Promotoren. Durch Testen einer einzigartigen Kombination von regulatorischen Elementen identifizierten wir zwei Transkriptionseinheiten, die für die Implementierung des South-Pfades als photorespiratorischer Bypass geeignet sind. Der Pfad besteht aus zwei Genen, einer Glykolatdehydrogenase und einer Malatsynthase, die in den charakterisierten Transkriptionseinheiten zusammengesetzt wurden. Diese Transgene wurden in den Chloroplasten eines charakterisierten Mutantenstamms transformiert, der eine erhöhte Photorespiration aufweist. Durch genomische, proteomische, metabolomische und phänotypische Charakterisierung unter photorespiratorischen Bedingungen zeigen wir die erfolgreiche Implementierung des Pfades. Transplastomische Stämme zeigten eine kürzere Verdopplungszeit und höhere finale Zelldichte als die Mutantenstämme, was durch geringere Zwischenprodukte der natürlichen Photorespiration erklärt wurde, die auf einen erhöhten Fluss im Bypass hindeuten. Schließlich machten wir uns daran, die kleine Untereinheit von Rubisco vom Kerngenom in das Chloroplastengenom zu relokalisieren, indem wir das endogene Crrbcs1-Gen im Chloroplasten des Mutantenstamms für rbcS und das Pyrenoid transformierten. Obwohl sich der KO-Stamm nicht wie erwartet verhält und das Wachstum unter minimalen phototrophen Bedingungen aufrechterhält, wurde das Vorhandensein des Transgens bestätigt und ein drastischer Einfluss auf Wachstum und Zelldichte im transplastomischen Stamm festgestellt, der seine Verdopplungszeit im Vergleich zum Mutanten um das Vierfache reduzierte und Zelldichten erreichte, die mit den Niveaus des Wildtyps vergleichbar waren. Insgesamt haben wir in dieser Arbeit die grundlegenden Werkzeuge und Proofs of Concept entwickelt, um den Chloroplasten von C. reinhardtii als Testumgebung für die Photosynthesetechnik zu verwenden. Indem wir zeigen, dass wir einen photorespiratorischen Bypass konstruieren und die kleine Untereinheit von Rubisco im Chloroplastengenom neu lokalisieren können, eröffnen wir nun die Möglichkeit, mehrere Pfade, Zyklen und Varianten im Hochdurchsatzverfahren zu testen, unter Verwendung der etablierten Pipeline und charakterisierter Mutanten

Prevalence and Influence of Genetic Variants on Follow-Up Results in Patients Surviving Thoracic Aortic Therapy

Background/Objective: To investigate the prevalence and effects of genetic variants (GVs) in survivors of thoracic aortic dissection/aneurysm repair. Methods: Patients aged 18–80 years who survived follow-up after cardiosurgical or endovascular repair of thoracic aortic aneurysm or dissection at a single tertiary center between 2008 and 2019 and underwent genetic testing were enrolled. The exclusion criteria were age >60 years, no offspring, and inflammatory- or trauma-related pathogenesis. Follow-up entailed computed tomography-angiography at 3 and 9 months and annually thereafter. All patients underwent genetic analyses of nine genes using next-generation sequencing. In cases of specific suspicion, the analysis was expanded to include 32 genes. Results: The study included 95 patients. The follow-up period was 3 ± 2.5 years. GVs were detected in 40% of patients. Correlation analysis according to primary diagnosis showed no significant correlation in disease persistence, progression, or in reintervention rates in aneurysm patients and a correlation of disease persistence with genetic variants according to variant class in dissection patients (p = 0.037). Correlation analysis according to follow-up CD finding revealed that patients with detected dissection, irrespective of original pathology, showed a strong correlation with genetic variants regarding disease progression and reintervention rates (p = 0.012 and p = 0.047, respectively). Conclusions: The prevalence of VUS is high in patients with aortic pathology. In patients with dissected aorta in the follow-up, irrespective of original pathology, genetic variants correlate with higher reintervention rates, warranting extended-spectrum genetic testing. The role of VUS may be greater than is currently known.Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg

Entwicklung einer Real-Time PCR zum Nachweis von Streptococcus agalactiae auf Basis der 16S rRNA unter Verwendung der Reverse-Transkriptase Reaktion

Als Ergänzung zur klassischen mikrobiologischen Diagnostik wurden in den letzten Jahrzehnten vermehrt molekularbiologische Methoden etabliert, die den Nachweis von Nukleinsäuren direkt aus dem Patientenmaterial innerhalb kurzer Zeit ermöglichen. Die DNA-basierte PCR-Analytik ist die am meisten verbreitete Methode. Bei Proben mit geringer Erregerdichte und einem daraus resultierenden hohen Risiko für falsch-negative Ergebnisse bietet die Verwendung der zahlenmäßig weit überlegenen ribosomalen RNA als Zielmolekül einen vielversprechenden Ansatz. Abhängig vom Bakterium liegt die Anzahl der Ribosomen pro Zelle zwischen 100 und 10.000. Bisher jedoch fand dieses Konzept keine breite Anwendung. Bis heute existiert kein kommerzieller Test zur Identifizierung von Pathogenen, der auf spezies-spezifischer 16S rRNA basiert. Das steht im Widerspruch zu Erfahrungen auf dem benachbarten Gebiet der medizinischen Virologie, wo virale RNA im gleichen Maße wie DNA als Zielmolekül dient. Diese Arbeit untersuchte das Potenzial der 16S rRNA als neuen molekularen Marker für den PCR-basierten Nachweis am Beispiel des Erregers Streptococcus agalactiae. Ein zentraler Fokus lag auf der Entwicklung und Optimierung einer 16S rRNA-basierten Reverse-Transkriptase-qPCR und der Darstellung der Sensitivitätssteigerung gegenüber der Standard-qPCR. Ribosomale RNA-Moleküle weisen strukturelle Besonderheiten auf, wie chemische Modifikationen und komplexe Faltungen, die die Reaktionsdynamik beeinflussen können und daher berücksichtigt werden müssen. Eine softwaregestützte Analyse auf DNA- und RNA-Ebene wurde benutzt, um den potenziellen Einfluss der räumlichen Anordnungen der 16S-Sequenz auf einzelne Schritte der RT-qPCR-Reaktion zu untersuchen. Mithilfe von In-silico-Simulationen wurde eine Auswahl an Primern für das Screening getroffen und vorläufige Reaktionsparameter für die RT-qPCR ermittelt. Die Etablierung einer robusten Real-Time-PCR (qPCR) war ein essenzieller Zwischenschritt in dieser Arbeit. Diese Standard-qPCR sollte im späteren Verlauf als Referenzmethode dienen und einen direkten Vergleich mit der Reverse-Transkriptase-qPCR ermöglichen. Darüber hinaus sollte sie als Werkzeug zur Quantifizierung von Einflussfaktoren und zur Optimierung der Variablen in der reversen Transkription fungieren. Anschließend erfolgte die Etablierung und Charakterisierung der reversen Transkription. Durch experimentelle Primer-Selektion in Kombination mit der Auswahl an Enzymen und Optimierung der Reaktionsbedingungen konnte eine Real-Time PCR etabliert werden, die zum Nachweis der bakteriellen genomischen DNA sowie der von rRNA abgeleiteten cDNA diente und eine Sensitivität von bis zu 50 Genomäquivalenten erreichte. Die der qPCR vorgeschaltete reverse Transkription führte zu einer Steigerung der Gesamtmenge an DNA-Matrizen um Faktor 100 bis 1000 und bestätigte die Ergebnisse einer japanischen Arbeitsgruppe, die eine ähnliche Erhöhung der diagnostischen Sensitivität bei Einsatz von rRNA anstelle von DNA am Beispiel von S. aureus und P. aeruginosa gezeigt hatten. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die angestrebte Steigerung der Sensitivität im RT-qPCR-Verfahren im Vergleich zur herkömmlichen qPCR-Methode entscheidend von der Menge der cDNA-Moleküle und somit von der Effizienz der reversen Transkription abhängt. Diese Arbeit unterstützt weiterhin die Hypothese, dass 16S rRNA als Target für diagnostische Anwendungen dienen kann. Der potenzielle Nutzen liegt darin, dass die vorgeschaltete reverse Transkription die Nachweisgrenze der qPCR erweitern und die Häufigkeit falsch-negativer Ergebnisse, insbesondere bei Proben mit geringen Mengen an genomischer DNA, reduzieren kann. Weitere Studien sind notwendig, um die Methode für den klinischen Alltag weiter zu optimieren und zu evaluieren.In addition to classical microbiological diagnostics, molecular biological methods have increasingly been developed over the past decades, enabling the detection of nucleic acids directly from patient material within a short period of time. DNA-based PCR analysis is the most widely used method. In samples with low bacterial counts and a high risk of false-negative results, the use of multi-copy targets like the abundant ribosomal RNA offers a promising approach for the diagnosis of neonatal sepsis. Depending on the target bacterium, the number of ribosomes per cell ranges from 100 to 10,000. To date, this concept has not been widely adopted. At present, there are no commercially available tests for pathogen identification based on species-specific 16S rRNA. This is in contrast to medical virology, where viral RNA is used as frequently as DNA. This study investigated the potential of 16S rRNA as a novel molecular marker for PCR-based detection, using the example of the pathogen Streptococcus agalactiae. A central focus was on the development and optimization of a 16S rRNA-based reverse transcription polymerase chain reaction with the aim of demonstrating increased sensitivity compared to DNA-based qPCR method. In contrast to DNA, ribosomal RNA molecules exhibit distinctive structural characteristics, such as chemical modifications and complex folding patterns, which can impact reaction dynamics and thus require careful consideration. A software-assisted analysis at the DNA and RNA levels was utilized to examine the potential influence of secondary structures of the 16S sequence on specific steps of the RT-qPCR reaction. Using in-silico simulations a set of primers was chosen for screening, and preliminary reaction parameters for the RT-qPCR were determined. The development of a robust real-time PCR (qPCR) was an essential intermediate step in this study. This standard qPCR was intended to serve as a reference method for direct comparison with the reverse transcription qPCR. Additionally, it was to be used as a tool for quantifying influencing factors and optimizing variables in reverse transcription process. Following this, the reverse transcription step was developed and characterized. Using experimental primer selection, combined with the choice of enzymes and optimization of reaction conditions, a real-time PCR (qPCR) was developed for detecting both bacterial genomic DNA and cDNA derived from rRNA. This method achieved a sensitivity of up to 50 genome equivalents. The reverse transcription step preceding the qPCR resulted in a 100 to 1000-fold increase in the total amount of DNA templates. This confirmed the results of a Japanese research group, which reported a similar increase in diagnostic sensitivity when using rRNA instead of DNA for the detection of S. aureus and P. aeruginosa. The results of this study demonstrate that the sensitivity increase in the RT-qPCR method, compared to the qPCR, is significantly dependent on the amount of cDNA molecules and thus on the efficiency of reverse transcription. This study further supports the hypothesis proposing 16S rRNA as a useful additional target for diagnostic applications. The potential benefit lies in the fact that the preceding reverse transcription can extend the detection limit of qPCR and reduce the frequency of false-negative results, especially in samples with low amounts of genomic DNA. Further invistgations are necessary to optimize and evaluate the method for suitability in routine clinical practice

Max Kirmsses Forschungen und ihre Bedeutung für eine Geschichte der Sonderpädagogik

Die historischen Forschungen Max KIRMSSEs haben dazu angeregt, die Frage aufzuwerfen, welche Prinzipien ihnen zugrunde lagen und worauf es KIRMSSE letzten Endes ankam

Bond strength of chromadaptive composites in Class-I cavities

Ziel der Studie Ziel dieser In-vitro-Studie ist es, das 2019 auf den Markt gebrachte chromadaptive Komposit Omnichroma und den zugehörigen Blocker auf seinen Haftverbund zu Dentin zu testen. Als Adhäsivsystem wird Syntac Classic im Selective-Etch- und im Etch-and- rinse-Verfahren angewendet. In Referenzgruppen kommen die langjährig etablierten stopfbaren Komposite von Venus Diamond und Tetric Prime zum Einsatz. In den Tetric Prime-Gruppen wird zusätzlich untersucht, welche Auswirkungen die Erhöhung der Inkrementstärke von den zugelassenen 2 mm auf vom Hersteller nicht zugelassene 4 mm hat. Material und Methoden In 50 karies- und füllungsfreie menschliche bleibende dritte Molaren werden 4 x 4 x 4 mm große Klasse-I-Kavitäten präpariert, welche im Anschluss randomisiert in 10 Versuchsgruppen eingeteilt werden. Bei der einen Hälfte der Gruppen wird das Vier- Schritt-Adhäsivsystem Syntac im Selective-Etch-Modus (SE) verwendet, bei der anderen Hälfte das Vier-Schritt-Etch-and-rinse-Adhäsivsystem (TE). Im Anschluss wird jeweils eine der Gruppen mit den modellierbaren Kompositen Omnichroma, Omnichroma in Kombination mit dem zugehörigen Blocker, Venus Diamond in 2 mm-Inkrementen sowie Tetric Prime in 2 und 4 mm-Inkrementen gefüllt. Im Sägeprozess entstehen Dentin- Komposit-Stäbchen mit 1 x 1 mm Querschnitt, deren Haftkraft im folgenden Mikrozugversuch bestimmt wird. Zuletzt erfolgt die elektronenmikroskopische Untersuchung der Bruchfläche des Dentinstäbchens. Für die statistische Analyse wird das Programm IBM SPSS Statistics (IBM, New York) benutzt. Es werden Tests wie der Kolmogorow-Smirnow-Test, der Mann-Whitney-Wilcoxon-Test und die a-Fehler- Inflation durchgeführt. Ergebnisse Die Ergebnisse des vorliegenden Versuchs zeigen, dass die Anwendung von Syntac Classic im Etch-and-rinse-Verfahren zu höheren Haftwerten zwischen Dentin und Komposit führt als im Selective-Etch-Verfahren. Des Weiteren wird bestätigt, dass bei Tetric Prime eine Erhöhung der Inkrementstärke von 2 mm auf vom Hersteller nicht zugelassene 4 mm zu einer Verschlechterung der Haftwerte führt. Das chromadaptive Komposit Omnichroma und der zugehörige Blocker können im Etch-and-rinse-Modus ähnliche Haftwerte erzielen wie die vergleichbaren Gruppen von Venus Diamond und Tetric Prime. Schlussfolgerung Aus der vorliegenden Studie können folgende drei Schlussfolgerungen gezogen werden: Erstens sollte das Adhäsivsystem Syntac Classic im Vier-Schritt-Etch-and-rinse-Verfahren angewendet werden. Dadurch wird die Haftfestigkeit verbessert und der Zahnarzt hat im Vergleich zur Selective-Etch-Technik keinen zeitlichen Mehraufwand. Zweitens sollte sich bei der Anwendung der Produkte an die Herstellerangaben gehalten werden, da sich eine Erhöhung der Inkrementstärke auf 4 mm statt den zugelassenen 2 mm negativ auf den Haftverbund auswirkt. Zuletzt zeigen die Ergebnisse, dass das 2019 auf dem Markt erschienene chromadaptive Komposit Omnichroma mit dem zugehörigen Blocker im Etch-and-rinse-Verfahren ähnliche Haftwerte erzielen kann wie die stopfbaren Komposite Venus Diamond und Tetric Prime. Ob Omnichroma auch langfristig klinisch vergleichbare Ergebnisse in Bezug auf die mechanischen Eigenschaften und Farbbeständigkeit erzielen kann, muss in weiteren Studien erforscht werden.Aim of the study Aim of this in-vitro study was to evaluate the chromadaptive resin composite Omnichroma, which was launched on the market in 2019, and the associated blocker regarding it´s adhesion to deep dentin. Syntac was used as an adhesive system in the selective-etch and etch-and-rinse approaches. The long-established packable composites Venus Diamond and Tetric Prime have been used in reference groups. In the Tetric Prime groups, the effects of increasing increment thickness from 2 mm to 4 mm, which is not recommended by the manufacturer, was also investigated. Materials and methods 4 x 4 x 4 mm Class-I cavities were prepared in 50 caries- and filling-free human permanent third molars, which were then randomly assigned to 10 test groups. One half of the groups was bonded with Syntac in selective-etch mode (SE), while the other half used it as four-step etch-and-rinse adhesive system (TE). Subsequently, one of these groups was filled with the sculptable composites Omnichroma, Omnichroma in combination with the corresponding blocker, Venus Diamond in 2 mm increments and Tetric Prime in 2 and 4 mm increments. The cutting process produced dentin composite beams with a cross-section area of 1 x 1 mm, which were loaded until failure in the subsequent microtensile test. Finally, the fracture surface of the dentin parts was examined under a scanning electron microscope (SEM). SPSS was used for the statistical analysis. Tests such as the Kolmogorov-Smirnov test, the Mann-Whitney-Wilcoxon test and the a error inflation were carried out. Results The results of the present investigation revealed that the application of Syntac in the etch-and-rinse technique leads to higher bond strengths between dentin and composite than in the selective-etch technique. Furthermore, it was confirmed that an increase in the increment thickness of Tetric Prime from 2 mm to 4 mm, which is not approved by the manufacturer, leads to a deterioration of bond strength. The chromadaptive composite Omnichroma and the associated blocker can achieve similar bond strengths in the etch-and-rinse mode as the comparable groups of Venus Diamond and Tetric Prime. Conclusion The following conclusions can be drawn from the present study: Syntac should be applied using the four-step etch-and-rinse technique. This improves the bond strength and the dentist does not have to spend any additional time compared to the selective- etch technique. The manufacturer's instructions should be strictly followed when using the products, as increasing the increment thickness to 4 mm instead of the permitted 2 mm had a negative effect on bond strength. Finally, the results show that the chroma- adaptive resin composite Omnichroma can achieve comparable bond strengths as the packable resin composites Venus Diamond and Tetric Prime using the etch-and-rinse technique with the corresponding blocker. Whether Omnichroma can also achieve clinically comparable results in terms of mechanical properties and colour stability in the long term must be investigated in further studies