Aufklärung des Mechanismus der PhoQ-Hemmung durch das kleine Protein MgrB

Abstract

The PhoQ/PhoP two-component system plays an important role in sensing and responding to various environmental signals, including magnesium limitation, low pH, and antimicrobial peptides. Upon sensing the stimuli, the histidine kinase PhoQ undergoes autophosphorylation. The phosphoryl group is then transferred to a highly conserved aspartate of PhoP. The phosphorylated PhoP can bind to the PhoP-box within the promoter region of target DNAs, thereby regulating numerous gene expressions. The small membrane protein MgrB, regulated by PhoQ/PhoP, can inhibit PhoQ histidine kinase activity, thus forming a negative feedback loop. However, the mechanism of this inhibition remains largely unknown. Moreover, small proteins have been discovered across all domains of life, and small membrane proteins constitute a significant portion of newly discovered small proteins. However, functional studies of small membrane proteins are challenging due to their size limitation and hydrophobic nature. To address these questions, in this thesis, the results not only elucidate the inhibitory mechanism between PhoQ and MgrB in vivo but also present a robust approach to generate functional small membrane proteins for discovering their function. To elucidate this inhibition mechanism, the binding interface between PhoQ and MgrB was first identified using the chemical crosslinking approach, which was consistent with the AlphaFold2 model prediction. Subsequently, the crosslinking results showed that the binding of MgrB led to less crosslinking in the PhoQ transmembrane helix and linker region, indicating that MgrB pushed PhoQ transmembrane helices away from each other. The molecular dynamics simulation results also showed that the binding of MgrB led to the translocation of PhoQ's catalytic domain, which was necessary for PhoQ to bind adenosine triphosphate. These conformational changes ultimately resulted in an overall lowered PhoQ activity. Additionally, using combined approaches, our results revealed that MgrB appeared to mediate PhoQ sensing antimicrobial peptides under physiological magnesium conditions. To generate small membrane proteins in a robust approach, several small membrane proteins were synthesized functionally, such as MgrB, up to a micro-molar scale using a combination of the cell-free system and lipid sponge droplets. Additionally, the cell-free system proved to be versatile, allowing for the synthesis of small membrane proteins from both eukaryotes and prokaryotes. Furthermore, the synthesized small membrane proteins can be used for target discovery via in vitro co-immunoprecipitation. Taken together, the results demonstrate the inhibitory mechanism of PhoQ by the small membrane protein MgrB, and provide new insights into uncovering the potential functions of small membrane proteins.Das PhoQ/PhoP-Zwei-Komponenten-System spielt eine entscheidende Rolle bei der Erfassung und Reaktion auf verschiedene Umweltsignale, einschließlich Magnesiummangel, niedrigem pH-Wert und antimikrobiellen Peptiden. Nach der Erfassung der Reize unterzieht sich die Histidinkinase PhoQ der Autophosphorylierung. Die Phosphorylgruppe wird dann auf ein hoch konserviertes Aspartat von PhoP übertragen. Das phosphorylierte PhoP ist in der Lage, sich an die PhoP-Box im Promotorbereich von Ziel-DNAs zu binden und dadurch zahlreiche Genexpressionen zu regulieren. Das kleine Membranprotein MgrB, das von PhoQ/PhoP reguliert wird, kann die Histidinkinaseaktivität von PhoQ hemmen und dadurch eine negative Rückkopplungsschleife bilden. Der Mechanismus dieser Hemmung ist jedoch weitgehend unbekannt. Des Weiteren wurden kleine Proteine in sämtlichen Lebensbereichen entdeckt, wobei kleine Membranproteine einen signifikanten Anteil der neu entdeckten kleinen Proteine ausmachen. Die funktionelle Untersuchung von kleinen Membranproteinen erweist sich jedoch aufgrund ihrer Größenbegrenzung und hydrophoben Natur als anspruchsvoll. Die Ergebnisse dieser Arbeit dienen der Beantwortung der aufgeworfenen Fragen. Sie klären nicht nur den Hemmmechanismus zwischen PhoQ und MgrB in vivo auf, sondern präsentieren auch einen robusten Ansatz zur Generierung funktionaler kleiner Membranproteine zur Entdeckung ihrer Funktion. Zur Aufklärung des Hemmmechanismus wurde zunächst die Bindungsschnittstelle zwischen PhoQ und MgrB mithilfe des chemischen Crosslinking-Ansatzes identifiziert, was mit der Vorhersage des AlphaFold2-Modells übereinstimmte. Die Ergebnisse des Crosslinking zeigten, dass die Bindung von MgrB zu einer Reduktion des Crosslinking in der PhoQ-Transmembranhelix und im Verbindungsbereich führte. Dies lässt darauf schließen, dass MgrB die PhoQ-Transmembranhelices voneinander wegdrängte. Die Ergebnisse der Molekulardynamiksimulationen legen nahe, dass die Bindung von MgrB zur Translokation des katalytischen Bereichs von PhoQ führt, was für PhoQ notwendig ist, um Adenosintriphosphat zu binden. Diese konformationellen Änderungen resultieren letztlich in einer insgesamt verringerten PhoQ-Aktivität. Unsere Ergebnisse, die unter Verwendung kombinierter Ansätze gewonnen wurden, legen nahe, dass MgrB die Erfassung antimikrobieller Peptide durch PhoQ unter physiologischen Magnesiumbedingungen vermittelt. Um kleine Membranproteine robust zu generieren, wurden mehrere funktionelle kleine Membranproteine wie MgrB in einem mikromolaren Maßstab mithilfe einer Kombination aus dem zellfreien System und Lipid-Schwammtropfen synthetisiert. Darüber hinaus erwies sich das zellfreie System als vielseitig einsetzbar und ermöglichte die Synthese kleiner Membranproteine sowohl aus Eukaryoten als auch aus Prokaryoten. Des weiteren können die synthetisierten kleinen Membranproteine zur Zielerkennung mittels in vitro Co-Immunopräzipitation verwendet werden. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse den Hemmmechanismus von PhoQ durch das kleine Membranprotein MgrB und liefern neue Erkenntnisse zur Aufdeckung der potenziellen Funktionen kleiner Membranproteine