Platelets in equids - an underrated biomarker?

Erst mit Beginn dieses Jahrhunderts wurde deutlich, dass Thrombozyten neben ihrer essentiellen Bedeutung für die Blutgerinnung eine substantielle Rolle im Rahmen von Entzündungen spielen. So war es naheliegend, Untersuchungen zu Thrombozytenzahlen und -variablen sowie der Thrombozytenfunktion bei gesunden und kranken equinen Individuen durchzuführen. Da bei humanen Patienten positive Einflüsse einer Hemmung der Thrombozytenfunktion auf eine reduzierte Thromboseneigung und den Erkrankungsverlauf von SIRS-Patienten ermittelt werden konnten, sollte zudem die Möglichkeit der oralen medikamentösen Hemmung der Thrombozytenfunktion beim Pferd überprüft werden. Das Hämatologiegerät ADVIA® 2120 ist eine Standardmethode in der Messung von Thrombozytenzahlen sowie deren Variablen. Die eigenen Untersuchungen konnten jedoch zeigen, dass equine Thrombozyten durch die etablierten Antikoagulantien K3-EDTA und Zitrat nicht ausreichend aufgekugelt werden und die Messergebnisse insbesondere der Variablen MPV und MPC hierdurch beeinflusst sein können. In künftigen Studien könnte überprüft werden, ob durch Verwendung anderer Antikoagulantien wie dem CTAD (Citrate, Theophylline, Adenosine and Dipyridamole) validere Messergebnisse erreicht werden könnten. Die Etablierung von Referenzintervallen auf Basis einer klinisch unauffälligen Referenzpopulation ist in der Labordiagnostik oftmals ein logistisches und finanzielles Problem. Dies wird noch verstärkt, wenn wie in der vorliegenden Untersuchung für den ADVIA® 2120 und den Multiplate® Analyzer innerhalb einer Spezies zum Teil klinisch relevante rasseabhängige Unterschiede ermittelt werden können. Hier könnten statistische Verfahren aus der Humanmedizin, im Rahmen derer Referenzintervalle anhand aller in einem Labor vorhandenen Daten geschätzt werden, auch für die Veterinärmedizin ein sinnvolles Werkzeug darstellen. Thrombozytopenien und Thrombozytosen treten beim Pferd mit einer Prävalenz von 3,4 % bzw. 3,1 % im Vergleich mit anderen Spezies deutlich seltener auf. Da es sich in der vorliegenden Untersuchung um ein bereits vorselektiertes Patientenmaterial handelt, ist anzunehmen, dass die Prävalenz in der gesamten Pferdepopulation deutlich geringer ist. In Verbindung mit systemischen Entzündungen sowie Neoplasien sind die Abweichungen in der Thrombozytenzahl negativ prognostisch, wobei der Schweregrad keine Rückschlüsse auf das Überleben zulässt. Erstmals konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Prävalenz einer EDTA-induzierten Pseudothrombozytopenie beim Equiden bis zu 5 % beträgt. Sie sollte insbesondere bei einer Thrombozytopenie ohne klinische Anzeichen einer Blutungsneigung als Ursache in Betracht gezogen werden. Gleiches gilt für das Auftreten von > 250 Clumps (Thrombozytenaggregate) in Messungen mit dem ADVIA® 2120. Verifizieren lässt sich die EDTA-PTCP durch eine Messung aus mit Zitrat antikoagulierten Blut innerhalb von 4 bis 6 Stunden nach Blutentnahme. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es zum ersten Mal, beim Equiden aus Thrombozyten-Leukozyten-reichem Plasma aktivierte Thrombozyten sowie Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten mittels Fluoreszenz-Durchflusszytometrie unter Verwendung zweier geringfügig modifizierter humaner Protokolle nachzuweisen. Zudem konnte erstmals gezeigt werden, dass bei Aktivierung der Thrombozyten auch beim Pferd eine Exprimierung von CD154 (CD40L) stattfindet. Der Nachweis RNA-reicher Thrombozyten gelang auf diesem Wege jedoch nicht. Desgleichen konnten bei Pferden mit 2 humanen ELISAs lösliche Formen der Glykoproteine CD40L und CD62P im Serum nicht nachgewiesen werden. Eine Zunahme von Thrombozytenaktivierung und der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate konnte darüber hinaus erstmalig bei equinen Patienten mit SIRS gezeigt werden. Mittels Impedanzaggregometrie am Multiplate® Analyzer konnten jedoch bei diesen Patienten keine signifikanten Unterschiede der Thrombozytenfunktion ermittelt werden. Dies ist mutmaßlich darauf zurückzuführen, dass die Impedanzaggregometrie im Vollblut erheblich vom Schweregrad der Erkrankung beeinflusst ist. Während bei leichter erkrankten Patienten eine Erhöhung der Aggregationswerte erwartet werden kann, gilt für schwer erkrankte Patienten das Gegenteil. Da in der eigenen Untersuchung sehr wahrscheinlich alle Schweregrade einer SIRS vertreten waren, hoben sich die folglich entgegengesetzt auftretenden Aggregationen in der Summe mutmaßlich auf. Im Rahmen der Untersuchungen konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass niedrige Thrombozytenzahlen bei equinen SIRS-Patienten mit einer erhöhten Mortalität assoziiert sind. Darüber hinaus ergaben sich Hinweise, dass niedrige Aggregationswerte des COLtest, ADPtest und ADPtestHS am Multiplate® Analyzer sowie eine Erhöhung der prozentualen Anteile aktivierter Thrombozyten sowie Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate ebenfalls mit einer erhöhten Mortalität assoziiert sein könnten. Thrombozytenzahl, Thrombozytenaggregation, Thrombozytenaktivierung sowie Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate könnten somit auch beim Pferd aussagekräftige Variablen in diagnostischen Algorithmen zur Prognose bei SIRS-Patienten darstellen. Bei klinisch unauffälligen Warmblütern konnte durch die orale Gabe von Clopidogrel in einer einmaligen Anfangsdosis von 6-6,5 mg/kg sowie einer täglichen Erhaltungsdosis von 1,2-1,4 mg/kg sowohl die ADP-induzierte als auch die Arachidonsäure-induzierte Aggregation gehemmt werden. Die orale Verabreichung von Acetylsalicylsäure verursachte in der gleichen Pferdegruppe lediglich eine mäßige Hemmung der Arachidonsäure-induzierten Aggregation. Zudem konnte eine dauerhafte Hemmung nicht erreicht werden. Bei 3 der 10 Pferde konnte darüber hinaus eine Aspirin-Resistenz vermutet werden. So erscheint im Gegensatz zu Clopidogrel der Nutzen der ASS für einen Einsatz in der Thromboseprophylaxe und -therapie beim Pferd aufgrund des mutmaßlich eher geringen hemmenden Effektes fraglich. Es bleibt in weiteren Untersuchungen zu überprüfen, ob sich durch die orale Gabe von Clopidogrel die im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesenen Reaktionen insbesondere der Thrombozytenaktivierung und der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate bei equinen SIRS-Patienten beeinflussen lassen und ob hierdurch der Krankheitsverlauf positiv beeinflusst werden kann.It was not until the early 21st century that it became clear that, in addition to their primary role in hemostasis, platelets are multifunctional and act as key players in inflammatory processes. It therefore seemed apposite to investigate platelet biology in healthy and diseased horses. Since it had been demonstrated that inhibition of platelet function reduces the mortality of severe disease in human ICU patients, a further purpose of the studies was to determine the efficacy of oral antiplatelet drugs in horses. The ADVIA® 2120 automated hematology system is a standard method of measuring platelet numbers and variables in veterinary laboratory diagnostics. However, the results of the own study demonstrated that adequate sphering due to the established anti-coagulants K3-EDTA and citrate was not archived in equine platelets and that this phenomenon may influence measurement results, in particular the variables MPC and MPV. Further studies are required to investigate whether the use of other anticoagulants as CTAD (citrate, theophylline, adenosine and dipyridamole) could provide more valid results for the measurement of the platelet variables. The establishment of reference intervals based on a healthy clinical reference population often represents a logistical and financial challenge in laboratory diagnostics. This situation is further complicated by the fact that in the present study clinically relevant breed-related differences were determined for the ADVIA® 2120 and the Multiplate® Analyzer measurements. Statistical methods used in human medicine in which reference intervals are estimated on the basis of all the data available in a laboratory can probably pose an option as valuable tool in veterinary medicine too. The prevalence of thrombocytopenia and thrombocytosis determined in a German referral equine internal medicine center was, at levels of 3.4 % and 3.1 % respectively, lower than in other species. Given that a referral clinic population is subject to preselection, it seems extremely probable that the prevalence in the whole population is even lower. Although both thrombocytopenia and thrombocytosis are correlated with a negative outcome in horses with systemic inflammatory conditions and neoplastic disorders, survival is not impacted by the extent of the variation. For the first time, the present study demonstrated a prevalence of up to 5 % for the EDTA-induced pseudothrombocytopenia in equids. This in vitro phenomenon should be considered especially in patients with no clinical signs of an increased bleeding tendency and a thrombocytopenia or more than 250 clumps (platelet aggregates) measured with the ADVIA® 2120. The EDTA-PTCP may be verified by platelet counting in citrated blood samples within 4-6 hours after sampling. This is the first study to measure equine activated platelets and platelet-leukocyte-aggregates in platelet-rich-plasma with flow-cytometry using modified human protocols. It is also the first study to demonstrate that CD40L is expressed in equine platelets during activation. Measurement of juvenile, immature, RNA-rich platelets using this method nevertheless failed. Similarly, a soluble form of glycoproteins CD40L and CD62P could not be quantified in equine plasma samples using commercial human ELISAs. Moreover, for the first time the study identified increased numbers of activated platelets and platelet-leukocyte-aggregates in clinical cases of equine SIRS. Measurement of whole blood impedance aggregometry with the Multiplate® Analyzer failed to verify differences in these patients compared to healthy controls. This could be explained by the fact that whole blood impedance aggregometry is mainly influenced by the severity of disease. In less severe cases platelet aggregation is usually increased, whereas in severe cases the opposite reaction occurs. As the equids included in the SIRS group probably exhibited all the degrees of disease severity, it is probable that the higher and lower aggregations were offset on balance in the final count. As far as the survival of equids with SIRS is concerned, the study for the first time reveals a correlation between low platelet counts and increased mortality. Furthermore, there were indications of increased mortality in patients with decreased aggregations of the COLtest, ADPtest and ADPtestHS on the Multiplate® Analyzer and increased numbers of activated platelets and platelet-leukocyte-aggregates. Platelet count, platelet aggregation, platelet activation and platelet-leukocyte-aggregates may therefore represent valuable variables in diagnostic and prognostic algorithms in equine SIRS. Oral clopidogrel with a loading dose of 6-6.5 mg/kg and daily maintenance doses of 1.2-1.4 mg/kg induced an inhibition of ADP- and arachidonic acid-induced platelet function in healthy horses. Oral administration of acetylsalicylic acid (aspirin) in the same group of horses only led to a moderate inhibition of the arachidonic acid-induced platelet function. An aspirin resistance was suspected in three horses. In view of its presumably low inhibitory effects in contrast to clopidogrel, the efficacy of aspirin in preventing and treating thrombotic diseases in horses appears doubtful. Further studies are accordingly required to evaluate the efficacy of clopidogrel as a platelet inhibitor in equine SIRS and to evaluate the potentially positive impact of platelet inhibition on survival

Darstellung und Untersuchung von polyhydroxylierten Biphenylen als Topoisomerase II-alpha Inhibitoren

Hydroxylierte Biphenyle sind biologisch aktive Verbindungen, welche mit unterschiedlichen gesundheitsfördernden Eigenschaften in Verbindung gebracht werden. Eine davon beruht auf ihrer inhibierenden Wirkung des für die Zellproliferation essentiellen Enzyms Topoisomerase II- und macht diese Stoffklasse besonders für die Krebsforschung sehr wertvoll. Mit dem Wunsch die derzeitigen Forschungserkenntnisse in diesem Bereich zu erweitern, bestand daher das erste Ziel der vorliegenden Arbeit darin, eine möglichst große Substanzbibliothek aus diversen polyhydroxylierten Biphenylderivaten (Urolithinen, Phenanthridinonen) darzustellen. Um ein besseres Verständnis für die Struktur-Aktivitätsanforderungen dieser Verbindungen als Topoisomerasehemmstoffe ermitteln zu können, waren in vitro Untersuchungen hierzu der zweite Schwerpunkt dieser Dissertation

Characterization and fate of lipofibroblasts during lung development and fibrosis

As of today, lipofibroblasts remain as one of the most ill-defined cell populations is the lung. They are part of the lung mesenchyme and contain lipid droplets. Since they are located near alveolar epithelial type II cells, they shuttle the accumulated lipid droplets into AECII cells and support them with surfactant production. Our data revealed that lipofibroblasts start to emerge at E16.5 which is around the time that AECIIs start to appear. FGF10 acts in an autocrine and paracrine fashion on mesenchymal and epithelial cells which are crucial for the formation of LIFs and AECIIs. In the next step we have provided evidence regarding the contribution of lipofibroblasts to the pool of activated myofibroblasts during progression of fibrosis. In brief LIFs transdifferentiate to activated myofibroblasts due to hyperactivity of TGFbeta1 signaling. Following the fate of these cells, our lineage tracing using AdrpCre-ERT2; tdTomatoflox mouse line, confirmed that during resolution phase, activated myofibroblasts, which were resulted from transdifferentiation of lipofibroblasts, revert back to their original status. Activation of PPARg signaling via treatment of cells with rosiglitazone negated the effects of TGFbeta1 treatment and enforced the lipogenic phenotype in the pulmonary fibroblasts. Following this concept, we hypothesized that treatment of the fibrotic lungs with reagents which activate PPARg signaling and enforce lipogenic phenotype in the activated myofibroblasts would yield beneficial effects for the patients. However, since rosiglitazone might not be the best choice due to increased risk of ischemic heart failure in the patients, we set the journey to find other antidiabetic drugs which would manipulate the cellular metabolism of activated myofibroblasts in the favor of lipofibroblasts. Thus, we decided to investigate the potential of metformin in conducting such effects. Treatment of pulmonary fibroblasts with TGFbeta1 (forcefully transdifferentiating them to activated myofibroblasts) followed by metformin resulted in efficient suppression of TGFbeta1 signaling and transdifferentiation to lipofibroblasts. To better mimic the in vivo situation, we cultured fresh PCLSs from human IPF patients and treated them with metformin. The results showed obvious improvement of tissue architecture, reduction of COL1A1 and increasing number of lipofibroblasts. The same readouts were also confirmed via treatment of bleomycin injured ACTA2-CreERT2, tdTomatoflox mice starting at 14 d.p.i. for the next 14 days. Metformin is a well-known agonist of AMPK. While, our data showed that metformin reduces expression of COL1A1 in an AMPK-dependent manner, induction of lipogenic markers such as PLIN2 and PPARg via metformin treatment were independent of AMPK. To explore the molecular mechanism behind this event, the transcriptome of fibroblasts treated with metformin for 72 h was analyzed. KEGG analysis revealed that in addition to alteration of many of the metabolic pathways in favor of inducing lipid droplets, BMP2 was expressed in much higher levels compared to control group. Treatment of fibroblasts with BMP2 induced expression of lipogenic markers and accumulation of lipid droplets. However, BMP2 treatment was not enough to reduce expression of COL1A1. Post translational modification analysis of PPARg following BMP2 or metformin treatment, illustrated a significant increase in PPARg phosphorylation at Ser-112. Hence, metformin suppresses expression of COL1A1 through activation of AMPK, in parallel to induction of lipogenic markers via BMP2-PPARg axis.Nach dem heutigen Stand der Wissenschaft, gehören die Lipofibroblasten (LIF) zu den wenig untersuchten Zellpopulationen der Lunge. Sie sind ein Bestandteil des Mesenchyms und enthalten lipidhaltige Vesikel. Aufgrund ihrer Nähe zu den Alveolareptihelzellen Typ II (AECII), transferieren sie die akkumulierten lipidhaltigen Vesikel zu den AECII Zellen und unterstützen diese damit in der Surfactantproduktion. Unsere Daten zeigten, dass die terminale Differenzierung der Lipofibroblasten am Embryonaltag 16.5 (E16.5) stattfindet, zu dem Zeitpunkt, wo die AECII erstmals in Erscheinung treten. FGF10 wirkt in einer autokrinen und parakrinen Weise auf die mesenchymalen und epithelialen Zellen, die für die Entstehung von LIFs und AECs II essentiell sind. Im nächsten Schritt, haben wir Beweise dafür, dass die Lipofibroblasten während der Fibroseenstehung einen entscheidenden Anteil an der Population der aktivierten Myofibroblasten beitragen. Kurz gefasst, transdifferenzieren die LIFs aufgrund einer Hyperaktivität von TGFbeta1 Signalweg zu aktivierten Myofibroblasten. Mit Hilfe der AdrpCre-ERT2; tdTomatoflox Mauslinie verfolgten wir die Veränderungen der LIFs während der Fibroserückbildung. Wir konnten feststellen, dass die aktivierten Myofibroblasten, die durch Transdifferenzierung der LIFs entstanden sind, sich wieder in ihren Urpsrungsstatus des LIFs zurückbildeten. Die Aktivierung des PPARg Signalweges durch Behandlung der Zellen mit Rosiglitazone hebt den Effekt der TGFbeta1 Behandlung auf und verstärkt den lipogenen Phänotyp der pulmonalen Fibroblasten. Wir verfolgten dieses Konzept und stellten die Hypothese, dass eine Behandlung der fibrotischen Lunge mit Reagenzien, die den PPARg Signalweg aktivieren und den lipogenen Phänotyp in aktivierten Myofibroblasten forcieren, zu einem positiven Effekt für die Patienten führen könnten. Da Rosiglitazone jedoch ein erhöhtes Risiko für ischämisches Herzversagen darstellt, suchten wir nach anderen antidiabetischen Arzneimitteln, die den Zellmetabolismus der aktivierten Myofibroblasten zugunsten der Lipofibroblasten verändern. Infolgedessen, untersuchten wir Metformin im Hinblick auf diese Effekte. Die Behandlung von pulmonalen Fibroblasten mit TGFbeta1 führt zwingend zur Transdifferenzierung dieser zu aktivierten Myofibroblasten. Eine anschließende Behandlung mit Metformin resultiert in einer effizienten Suppression des TGFbeta1 Signalweges und eine Transdifferenzierung der aktivierten Myofibroblasten zu Lipofibroblasten. Um die Situation in humanen Lungen zu simulieren, wurden frisch kultivierte Lungenschnitte (precision cut lung slices = PCLS) von Patienten mit idiopathische Pulmonalfibrose (IPF) mit Metformin behandelt. Dies führte zu einer Verbesserung der pumonalen Mikrostruktur, Reduktion von COL1A1 und Zunahme der Lipofibroblasten. Dieselben Ergebnisse erzielten wir, als wir mit Bleomycin behandelte Mäuse der Linie ACTA2Cre-ERT2; tdTomatoflox, 14 Tage nach Bleomycin Gabe für 14 Tage mit Metformin behandelten. Metformin ist ein bekannter Agonist von AMPK. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Metformin über einen AMPK-abhängigen Mechanismus die Expression von COL1A1 reduziert. Andererseits ist die Induktion von lipogenen Marker wie PLIN2 und PPARg durch Metformin unabhängig von AMPK. Um den zu Grunde liegenden Mechanismus zu verstehen, wurden die Transkriptome der Fibroblasten 72 h nach Behandlung mit Metformin untersucht. KEGG Analysen zeigten neben der Aktivierung von vielen metabolischen “Pathways” zur Induktion von lipidhaltigen Vesikeln, eine deutlich erhöhte Expression von BMP2 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Eine Behandlung von Fibroblasten mit BMP2 induziert Expression von lipogenen Markern und führt zur Akkumulation von lipighaltigen Vesikeln. Jedoch führte BMP2 nicht zur reduzierten Expression von COL1A1. Eine posttranslationale Analyse von PPARg nach Behandlung mit BMP2 oder Metformin, zeigte einen drastischen Anstieg von Ser-112 in PPARg, die zu einer höheren Aktivierung des Proteins führt. Infolgedessen schlußfolgern wir, dass Metformin über die Aktivierung von AMPK die Expression von COL1A1 unterdrückt, während sie parallel die lipogenen Marker über die BMP2-PPARg Achse induziert

Food patterns and chronic obstructive pulmonary disease in the SAPALDIA cohort

Worldwide, the prevalence of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is dramatically increasing. COPD will account for the third leading cause of death by 2020, thus representing a major public health issue. COPD is not restricted to smokers and dietary habits may contribute to the disease occurrence. Epidemiological research points to a benefit of a diet rich in antioxidants and omega-3 fatty acids for protecting from loss of lung function and from COPD symptoms, and protective effects of fruit and vegetable intake have been shown in several cohort studies. The aims of the current study were to derive and analyze dietary patterns for Swiss adults and to assess their association with lung function and COPD in the Swiss Cohort Study on Air Pollution and Lung and Heart Diseases in Adults (SAPALDIA). Dietary intake was collected using a paper form food frequency questionnaire (FFQ) designed to assess average food intake over the previous 4 weeks (www.ernaehrungserhebung.ch). In order to apply a robust and reliable tool, the FFQ had to be validated first. The FFQ validation study therefore presents the “precondition study” for the main research questions in the context of food patterns and COPD in the SAPALDIA cohort. The study aimed at assessing the relative validity of a paper form FFQ with a 4-day FR. The validity was assessed both, at the energy and macronutrient and food group levels. Finally, data from 56 out of a total of 60 recruited participants were considered for the analysis. In conclusion, the 127-food item FFQ showed good relative validity for protein and various, commonly consumed food groups such as fruits, egg, meat, sausage, nuts, salty snacks and beverages. The applied FFQ was shown to be an appropriate tool for assessing and characterizing dietary intake and food habits of adults in epidemiological studies. For the main analysis, 2178 SAPALDIA participants with complete data on lung function, smoking history, physical activity and dietary intake were considered. The validated, semi-quantitative paper form FFQ was handed out to the study participants and filled in self- administered. To derive dietary patterns, principal component factor analysis was performed on 25 predefined food groups on the basis of similarity of type of food and nutrient composition. Three prominent food factors were identified: Factor 1 reflected a rather “healthy diet”, i.e. a “prudent pattern”, characterized by the main food groups vegetables, fruits, water, tea and coffee, fish and nuts. In contrast, factor 2 was described by a high intake of meat, sausage, egg, fish and alcohol, representing a rather “unhealthy diet”, i.e. a traditional “Western pattern”. In addition, a third factor was identified, which was characterized by a “high-carbohydrate diet”, i.e. a high intake of sweet spreads, bread, dessert and potatoes. In order to analyze the relationships between dietary patterns and lung function outcomes and COPD, multiple mixed linear and logistic regression models were applied. The main finding was the positive association of the “prudent pattern” with the lung function parameter FEV1. These results are in line with current literature on dietary patterns and lung function outcomes or COPD. Thus, our results also add to the general evidence of a protective effect of antioxidant intake in COPD. For COPD prevention, smoking cessation still presents the most relevant public health message. However, the results of the present study suggest diet as a modifiable potential risk factor of lung function decrease. The investigation of dietary patterns rather than single food items or nutrients has the advantage of addressing the influence of food habits in their lifestyle context; it therefore better captures the complex nature of diet. In addition to the nutritional guidelines for other NCDs (e.g. cardiovascular diseases, diabetes, cancer), recommendations for high fruit and vegetable intake and low meat and alcohol intake may become an important pillar of respiratory disease prevention. The present study design and methodical approach could be transferred to other studies analyzing the relationship of diet and a specific disease such as other NCDs (e.g. cardiovascular diseases). In order to elaborate national nutrition strategies and concrete recommendations, there is a need for epidemiological research as it presents a precondition for a solid data basis. In addition, the novelty of these results for Switzerland must be considered. Since there are currently no other data about the relationship between dietary patterns and COPD in Switzerland, the findings of the present study are crucial. They point out important results of a potential beneficial effect of a rather healthy diet in comparison to a rather unhealthy diet regarding the occurrence of COPD

Gene expression studies on organotypic cultures of adult mouse retina: a model system for gene therapeutic approaches

Zu den retinalen neurodegenerativen Erkrankungen zählt u.a. Retinitis Pigmentosa, eine Gruppe von erblichen retinalen Krankheiten, bei denen es durch das Absterben von Photorezeptoren zu einer Netzhautdegeneration kommt. Genome Editing stellt an dieser Stelle eine vielversprechende Therapiemöglichkeit dar. Durch den Einsatz hochspezifischer Nukleasen, die einen gezielten DSB in die DNA einfügen, kann mit Hilfe eines gesunden exogenen DNA-Templates das mutierte Gen ausgetauscht werden. Um die Anwendung und das Potenzial der Gentherapien zu überprüfen, bevor es am gesamten Organismus, der Maus, getestet wird, sollen organotypische Retinakulturen zum Einsatz kommen. Diese stellen ein Modellsystem dar, das physiologisch nah an der in vivo Situation ist, da neuronale Interaktionen der verschiedenen Zelltypen und –schichten erhalten bleiben. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Genexpression von DNA-Reparaturproteinen in der organotypischen Retinakultur von adulten Wt-, Rpgr conditional knock-out (B6J.Sv129-Rpgrtm1Sti) und Lbr2 knock-in Mäusen untersucht werden. Ziel war es eine Grundlage zu schaffen, diese Methode als Modellsystem für das Studium gentherapeutischer Anwendungen zu etablieren und den Status der DNA-Reparaturmechanismen aufzuklären. Dazu wurden Netzhäute von adulten Wildtyp-, Rpgr-, und Lbr2-Mäusen bis zu acht Tage in Kultur genommen die Genexpression mittels qPCR untersucht. Es wurden ganze Netzhäute oder einzelne retinale Schichten, nach Lasermikrodissektion, zur Analyse verwendet. Bei den Analysen standen die NHEJ-Gene 53bp1, Ku80 und DNA-PKcs sowie die HDR-Gene CtIP, Rad50 und Brca1 im Fokus. Die Untersuchungen ergaben, dass die Kulturbedingungen durchaus einen großen Einfluss auf den allgemeinen Zustand der Retina haben, was sich durch starken Verlust des RNA-Gehalts auswirkt. Es zeigte sich zudem eine starke Abnahme der Rhodopsin-Expression, was vermutlich auf den Verlust zahlreicher Außensegmente der Photorezeptoren und des RPE zurückzuführen ist. Die starke Zunahme der Expression von Glia-spezifischen Genen weist auf eine Gliose in der Retinakultur hin. Die nahezu unveränderten Expressionsraten der NHEJ Reparaturgene in den Untersuchungen der gesamten Retina könnte ein Indiz für die reduzierte Effizienz der Reparatur von DSB in den Photorezeptoren sein. Es gibt Hinweise darauf, dass MMEJ einen möglichen alternativen Reparaturweg in der Retina darstellt. Der Vergleich der drei Mauslinien untereinander zeigte keine signifikanten Unterschiede. Es wurde jedoch gezeigt, dass eine Zellschicht-spezifische Analyse der Expression der Retina nötig ist, um eine detaillierte Grundlage für geplante Genome Editing Therapien zu schaffen. Durch die hier geleisteten Expressionsanalysen, zusammen mit den histologischen Untersuchungen durch Müller et al. (2017) lässt sich postulieren, dass die organotypische Retinakultur bis etwa zum achten Tag der Kultur für die gentherapeutische Anwendung genutzt werden kann. Sie könnte somit dazu beitragen, die gentherapeutischen Ansätze zu optimieren, bevor sie in vivo im Tierversuch angewendet werden. Dies soll auch zu einer deutlich niedrigeren Zahl an Versuchstieren beitragen

Untersuchung zur Sensitivität und Spezifität verschiedener Methoden der Immunglobulin G-Messung im Blut beim neonatalen Kalb

Ziel dieser Arbeit war es, einen neuentwickelten Schnelltest auf der Grundlage eines semiquantitativen ELISAs zur Immunglobulin G-Bestimmung im Serum des Kalbes auf seine Sensitivität und Spezifität zur Erkennung einer Hypogammaglobulinämie hin zu überprüfen. Dies erfolgte anhand der Korrelation der Ergebnisse zur Immunglobulin G-Messung mit Hilfe eines laborgebundenen ELISAs als Goldstandard. Potentielle Einflüsse auf das Ergebnis des Schnelltestes wurden untersucht. Diese bestanden einerseits in Faktoren, die von den Proben ausgingen (Alter und Gesundheitszustand des Kalbes zum Zeitpunkt der Beprobung), andererseits in Beeinflussungen durch die Bearbeitung der Proben (Kryokonservierung) und durch den Ableser des Testes (subjektive Einflüsse, Zeitpunkt des Ablesens). Zusätzlich wurden weitere etablierte indirekte Meßverfahren zur Abschätzung der Immunglobulinversorgung des Kalbes (Gesamtproteinmessung mit Refraktometer im Serum, Messung der Aktivität der Gammaglutamyltransferase im Serum) im Vergleich zu dem Goldstandard überprüft, um die derzeit sicherste Schnellmeßmethode zur Abschätzung der kolostralen Antikörperversorgung beim Kalb zu identifizieren. Die 292 Serumproben von Kälbern im Alter von null bis zehn Tagen wurden von mehreren landwirtschaftlichen Betrieben in Hessen und Thüringen gewonnen. In dieser Studie konnten folgende relevanten Ergebnisse gewonnen werden: • Die Zusammenhänge zwischen dem Ergebnis des ELISAs und des Schnelltestes (p < 0,0001; r = -0,36), der Gesamtproteinbestimmung im Serum des Kalbes (p < 0,0001; r = 0,75), der Messung der Aktivität der Gammaglutamyltransferase im Serum des Kalbes (p < 0,0001; r = 0,76) sind statistisch signifikant. • Der Schnelltest weist eine schlechte Sensitivität (61,1 %) und Spezifität (58,7 %) in der Erkennung eines fehlerhaft immunisierten Kalbes auf. 39,7 % der Kälber werden falsch klassifiziert. • Es ergibt sich kein Einfluß des Gesundheitszustandes des Kalbes auf das Ergebnis des Schnelltestes (p = 0,98). • Abhängig vom Alter des Kalbes werden ältere Kälber häufiger als zu gut versorgt erkannt, obwohl dies in der Messung mittels ELISA nicht zutraf. Mit jedem zusätzlichen Lebenstag steigt die Wahrscheinlichkeit für eine Einstufung als ausreichend versorgt um den Faktor 1,22. • Eine Durchführung des Testes mit zuvor kryokonservierten und aufgetauten Serumproben ist nicht möglich. • Eine Auswertung des Testes nach einer verlängerten Inkubationszeit führt zu abweichenden Ergebnissen. • Die Messung des Serumgesamtproteins weist bei allen Kälbern (gesunde Kälber: FPT bei Gesamtprotein < 5,2 g/dl, kranke Kälber: FPT bei Gesamtprotein < 5,5 g/dl) eine mittlere Sensitivität (83,8 %) und gute Spezifität (90,5 %) in der Erkennung eines fehlerhaft immunisierten Kalbes auf. 86 % der Kälber werden richtig klassifiziert. • In der Gruppe der gesunden Kälber (FPT bei Gesamtprotein < 5,2 g/dl) wird eine Sensitivität zur Erkennung eines FPT von 80,9 % bei einer Spezifität von 94,7 % erreicht. 85,7 % der Kälber werden richtig klassifiziert. • In der Gruppe der erkrankten Kälber (FPT bei Gesamtprotein < 5,5 g/dl) wird eine Sensitivität zur Erkennung eines FPT von 91,1 % bei einer Spezifität von 73,7 % erreicht. 86,7 % der Kälber werden richtig klassifiziert. • Die Messung der Aktivität der Gammaglutamyltransferase im Serum weist eine mäßige Sensitivität (62,9 %) und gute Spezifität (87,4 %) in der Erkennung eines fehlerhaft immunisierten Kalbes auf. 70,9 % der Kälber werden richtig klassifiziert. Zusammenfassend ist festzustellen, daß der Schnelltest nicht die erwünschte Lösung zur Kontrolle der passiven Immunisierung beim neugeborenen Kalb ist. Bisher etablierte Schnelltestmethoden, insbesondere die Bestimmung der Serumgesamtproteinkonzentration mit Hilfe der Refraktometrie, zeigen deutlich genauere Ergebnisse in der Erkennung eines FPT und somit eine korrekte Einteilung der Kälber.The aim of this study was to evaluate the sensitivity and specificity of a newly developed test for analyzing hypogammaglobulinaemia in the serum of calves. The test is based on semiquantitative ELISA detection of immunoglobulin G. For this purpose the results, compared to those obtained by laboratory-based ELISA as gold standard method, were correlated. Potential effects on the results of the rapid test were investigated, basing on probands (age and general health condition of individuals at sampling time), treatment of samples (cryopreservation) and tester (subjective influences, read-off-time). Additionally, accepted indirect methods for assessment of immunoglobulin-supply in newborn calves (determination of total serum protein by refractometer, measurement of activity of serum gamma-glutamyl transferase) were performed and results compared to gold standard, in order to identify the currently most reliable rapid test method. 292 serum-samples of calves between 0 and 10 days of age were obtained from probands in several agricultural holdings in Hesse and Thuringia. Relevant results of the study: • Correlations between the results of ELISA and commercially available rapidtest (p < 0.0001; r = -0.36), total serum protein determination (p < 0.0001; r = 0.75), measurement of activity of serum gamma-glutamyl transferase (p < 0.0001; r = 0.76) indicate statistical significance. • The rapid-test demonstrates poor sensitivity (61.1 %) and specifity (58.7 %) in detection of low immunized calves. 39.7 % of probands are misclassified. • General health condition of calves does not influence the results of the rapidtest (p = 0.98). • Depending on age of probands the rapid-test classifies probands as adequately supplied with immunoglobulins, though results of ELISA show low concentrations. Each consecutive day of life increases the probability of classification as sufficiently supplied by the factor 1.22. • Testing of previously cryopreserved and thawed serum samples by rapid-test is not possible. • Evaluation of rapid-test after prolonged incubation period leads to discrepant results. • The readout of test results is subject to individual fluctuation. • Measured values of total serum protein show average sensitivity (83.8 %; healthy claves: FPT at values < 5.2 g/dl, ill calves: FPT at values < 5.5 g/dl) and good specifity (90.5 %) concerning detection of low immunized probands. 86 % of probands are classified correctly. • In healthy calves (FPT at total serum protein < 5.2 g/dl) sensitivity for detection of FPT measures 80.9 %, specifity 94.7 %. 85.7 % of probands are classified correctly. • In ill calves (FPT at total serum protein < 5.5 g/dl) sensitivity for detection of FPT measures 91.1 %, specifity 73.7 %. 86.7 % of probands are classified correctly. • Measurement of activity of serum gamma-glutamyl transferase shows moderate sensitivity (62.9 %) and good specifity (87.4 %) concerning detection of low immunized probands. 70.9 % of probands are classified correctly. As a conclusion, the commercially available rapid-test does not fulfil the requirements for monitoring the passive immunization in newborn calves. Accepted indirect methods for assessment of immunoglobulin-supply in newborn calves, particularly the determination of total serum protein by refractometer, show significant more precise results in the detection of FTP and therefore a correct classification of calves