Combinatorial recognition of clustered RNA elements by the multidomain RNA-binding protein IMP3

How multidomain RNA-binding proteins recognize their specific target sequences, based on a combinatorial code, represents a fundamental unsolved question and has not been studied systematically so far. Here we focus on a prototypical multidomain RNA-binding protein, IMP3 (also called IGF2BP3), which contains six RNA-binding domains (RBDs): four KH and two RRM domains. We establish an integrative systematic strategy, combining single-domain-resolved SELEX-seq, motif-spacing analyses, in vivo iCLIP, functional validation assays, and structural biology. This approach identifies the RNA-binding specificity and RNP topology of IMP3, involving all six RBDs and a cluster of up to five distinct and appropriately spaced CA-rich and GGC-core RNA elements, covering a >100 nucleotide-long target RNA region. Our generally applicable approach explains both specificity and flexibility of IMP3-RNA recognition, allows the prediction of IMP3 targets, and provides a paradigm for the function of multivalent interactions with multidomain RNA-binding proteins in gene regulation

Sammelaktivitäten im Grundschulalter – Studien zur pädagogischen Anthropologie der Kindheit

Auch heutzutage stellt das Sammeln eine Tätigkeit dar, der Kinder gerne und in unterschiedlicher Intensität nachgehen. Das kindliche Sammeln ist bereits schon in den Kindergärten und auch auf den Schulhöfen und Schulwegen zu beobachten. Dabei erstreckt sich die Vielfalt der Sammelstücke von nützlichen und wertlosen, unkommerziellen und kommerziellen bis hin zu lebendigen und abgestorbenen Dingen, die von Kindern gesammelt und aufbewahrt werden. Das Sammeln, als eine bewusste Tätigkeit, verlangt ein Höchstmaß an Aktivität und Leidenschaft. Es wird gesucht, gestöbert, geprüft, erworben, getauscht, bewahrt, entdeckt, geordnet, umsortiert und aussortiert. In der Auseinandersetzung mit der eigenen Sammlung oder auch im Austausch mit anderen Sammlern entstehen bei den Kindern Fragen über die Herkunft oder Bedeutung der Sammelstücke. Sie machen vielfältige Erfahrungen und eignen sich Wissen an. Der Umgang mit Dingen und somit auch die Auseinandersetzung mit Sammlungen spielt im Subjektwerdungsprozess der Kinder in vielfältiger Weise eine Rolle. Aus diesem Grund stellt die Erforschung des kindlichen Sammelverhaltens aus der Perspektive der pädagogischen Anthropologie ein interessantes Forschungsgebiet dar. Die vorliegende Arbeit konnte mithilfe von qualitativen Interviews das Sammelverhalten von Kindern im Grundschulalter über den Zeitraum von 3 Jahren erforschen, dokumentieren, bisherige Ergebnisse bestätigen und neue Erkenntnisse gewinnen

Prävalenz, Klassifizierung und Erblichkeit verschiedener Typen von lumbosakralen Übergangswirbeln beim Deutschen Schäferhund

Lumbosakrale Übergangswirbel (LÜW) stellen anatomisch fehlgebildete Wirbel am Übergang von der kaudalen Lendenwirbelsäule zum Kreuzbein dar. Für die Rasse des Deutschen Schäferhundes (DSH) konnte durch vorherige Untersuchungen eine Rasseprädisposition für das Vorliegen von LÜW festgestellt werden. In Abhängigkeit von ihrer Morphologie prädisponieren manche LÜW bei Hunden, vermutlich aufgrund einer Veränderung der Biomechanik des lumbosakralen Überganges, für die Entwicklung neurologischer und gegebenenfalls auch orthopädischer Folgeerkrankungen. Insbesondere der Zusammenhang zwischen dem Auftreten symmetrisch oder asymmetrisch stark von der Norm abweichender LÜW und dem Cauda equina Syndrom als sekundäre Erkrankung wurde in der Literatur eingehend beschrieben. Die Korrelation zu orthopädischen Erkrankungen, wie der Hüftgelenkdysplasie (HD) und der Coxarthrose, sind weniger eindeutig. Weniger die LÜW selbst als vielmehr die möglichen Folgeerkrankungen stellen eine negative Beeinflussung des Wohlbefindens und der Gesundheit betroffener Hunde dar. Auf Basis der durch Vorstudien nachgewiesenen mindestens moderaten Heritabilität von LÜW ist eine Erarbeitung effektiver Zuchtstrategien beim DSH möglich. Hierdurch ist eventuell neben einer Reduktion der Häufigkeit von LÜW im Speziellen auch eine Verringerung der Häufigkeit korrelierter Folgeerkrankungen möglich. Genetisch-statistische Analysen sollen als Grundlage für die Entwicklung angemessener, zielorientierter und wirkungsvoller Zuchtmaßnahmen dienen.Lumbosacral transitional vertebrae (LTV) are congenitally malformed vertebrae located at the transition between the lumbar spine and the sacrum. Previous research has repeatedly indicated a breed predisposition for German Shepherd Dogs. Depending on their conformation, LTV can promote neurologic disorders and potentially also orthopedic diseases. This has been assumed to be related to altered biomechanics in the affected part of the spine. Some studies suggest that more severely deformed LTV can be involved in the development and progression of Cauda equina syndrome (CES), regardless of being symmetrical or asymmetrical. The correlation between LTV and orthopedic diseases, such as canine hip dysplasia and coxarthrosis, is less evident. The secondary diseases represent the main negative influence of LTV on the welfare and health of the individual affected dog rather than the LTV themselves. However, the hereditary nature of LTV allows developing successful breeding strategies to reduce the prevalence of LTV and the development of related secondary neurologic and orthopedic diseases. Improved understanding of the genetics and characteristics of LTV will help to define such approaches that are reasonable, targeted and efficient

Die Rolle von Major-Histocompatibility-Complex Klasse II bei der Proliferation von gamma delta-T-Zellen nach (E)-4-Hydroxy-3-Methyl-But-2-Enyl-Pyrophosphat-Stimulation

Humane Vgamma9delta2-T-Zellen machen die einzige im peripheren Blut vorhandene T-Zell-Population aus, die durch sogenannte Phosphoantigene aktiviert werden können. Sie spielen eine sehr wichtige Rolle sowohl in der Immunantwort auf mikrobielle Infektionen als auch in der Tumorimmunologie. Als potentestes Phosphoantigen in der Aktivierung von Vgamma9delta2-T-Zellen ist das flüchtige Molekül (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMB-PP) identifiziert worden. Der genaue Mechanismus bei der Antigenerkennung war bislang unbekannt. Es wurde in mehreren Studien festgestellt, dass Vgamma9delta2-T-Zellen nicht ohne weiteren zellulären Partner das HMB-PP als Antigen erkennen können. Welche Eigenschaften die dann als antigenpräsentierenden Zellen fungierenden zellulären Partner besitzen müssen, war zur Beginn dieser Arbeit nicht definiert. In dieser Arbeit konnten wir durch den Einsatz von hochrein sortierten Zellen in vitro die Eigenschaften der antigenpräsentierenden Zellen eingrenzen. Nach unserer Kenntnis haben wir in dieser Arbeit erstmalig zeigen können, dass primär MHC-II-positive-Zellen unabdingbar sind bei der Antigenerkennung von HMB-PP und der anschließenden Proliferation der Vgamma9delta2-T-Zellen. Zunächst konnten wir zeigen, dass einen Expansion von Vgamma9delta2-T-Zellen in Kokultur mit MHC-II-positiven Zellen deutlich höher ausfällt als in Kokulturen mit Zellen, die MHC-II nicht exprimieren. Nach HMB-PP-Stimulation in Kokulturen mit MHC-II-negativen Zellen (ebenfalls hochrein sortiert) konnten wir sogar nachweisen, dass eine Expansion der Vgamma9delta2-T-Zellen gänzlich ausbleibt. In einem weiteren Schritt konnten wir nachweisen, dass eine Blockade des MHC-II zu einer deutlich niedrigeren Expansion der Vgamma9delta2-T-Zellen als Antwort auf eine Stimulation mit HMB-PP führt. Weitere, in dieser Arbeit nicht identifizierte Eigenschaften der antigenpräsentierenden Zellen, müssen jedoch auch vorhanden sein. Dies zeigten uns unsere Experimente mit CD4-positiven Zellen, bei denen durch vorherige Stimulation ein MHC-II-Expression in vitro ausgelöst worden war. In Kokulturen mit diesen CD4-positiven und gleichzeitig MHC-II-positiven Zellen kam es eben nicht zu einer Expansion der Vgamma9delta2-T-Zellen nach HMB-PP-Stimulation. Eine Bestätigung dieses Befundes konnten wir durch Kokulturen mit Zellreihen, die eine unterschiedliche MHC-II-Expression zeigten, erreichen. Eine Expansion der Vgamma9delta2-T-Zellen trat nur in Kokulturen mit MHC-II-positiven Zellreihen auf, jedoch nicht in allen Kokulturen mit MHC-II-positiven Zellreihen. Nach Kokultur mit Raji-Zellen (MHC-II-positiver Zellreihe) kam es nicht zu einer Expansion der Vgamma9delta2-T-Zellen. Zusammenfassend liefert diese Arbeit neue Einsichten in die Bedingungen an den zellulären Partner der Vgamma9delta2-T-Zellen bei der Erkennung und anschließenden Expansion nach Stimulation durch HMB-PP.Human Vgamma9delta2 T cells represent a unique T cell subset in humans, primates and a handfull of other vertebrates. In humans it is the only T cell subset present in the peripheral blood that can be activated by nonpeptide phosphoantigens. The Vgamma9delta2 T cells play an important role in tumor immunity and antimicrobial immunity. Of the many known phosphoantigens able to activate the Vgamma9delta2 T cells, (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphate (HMB-PP) is by far the most potent. The exact mechanism of antigen recognition and thus activation of the Vgamma9delta2 T cells remain elusive. It has been known, that cell-cell-contact with another cell type than Vgamma9delta2 T cells is necessary to initiate activation and proliferation of the Vgamma9delta2 T cells in vitro as a response to HMB-PP stimulation. The cellular requirements for HMB-PP driven Vgamma9delta2 T cell expansion in vivo have been unclear so far. We used high purity sorting to define the cells acting as antigen presenting cells in vitro. We were able to show, to our knowledge for the first time, that MHC-II positive cells are indispensable for HMB-PP-driven Vgamma9delta2 T cell expansion in vitro. When cultured together with high purity sorted MHC-II positive cell we were able to show high levels of proliferation of the Vgamma9delta2 T cells after HMB-PP stimulation. Vice versa a proliferative response did not occur when strictly MHC-II negative cells were cocultured with Vgamma9delta2 T cells. Using an MHC-II blocking antibody we were able to decrease the proliferative response after HMB-PP stimulation. This demonstrates that MHC-II itself plays an important role in the antigen recognition and presentation in the process of activating Vgamma9delta2 T cells. Further cellular requirements, apart from MHC-II positivity, must be fulfilled in order to activate the Vgamma9delta2 T cells. Through activation we were able to induce an MHC-II expression on CD4 positive cells in vitro. Although we reached high levels of MHC-II expression on the CD4 positive cells, there was no proliferative response after HMB-PP stimulation when cocultured with Vgamma9delta2 T cells. Supporting these observations, a proliferative response only occurred in some of the cocultures with different MHC-II positive cell lines. Supporting our observation of MHC-II dependency, a proliferation did not occur in any of the cocultures with MHC-II negative cell lines. Our results provide novel insights into the primary cell-specific requirements for human Vgamma9delta2 T cell expansion

Besnoitia besnoiti infection alters both endogenous cholesterol de novo synthesis and exogenous LDL uptake in host endothelial cells

Besnoitia besnoiti, an apicomplexan parasite of cattle being considered as emergent in Europe, replicates fast in host endothelial cells during acute infection and is in considerable need for energy, lipids and other building blocks for offspring formation. Apicomplexa are generally considered as defective in cholesterol synthesis and have to scavenge cholesterol from their host cells for successful replication. Therefore, we here analysed the influence of B. besnoiti on host cellular endogenous cholesterol synthesis and on sterol uptake from exogenous sources. GC-MS-based profiling of cholesterol-related sterols revealed enhanced cholesterol synthesis rates in B. besnoiti-infected cells. Accordingly, lovastatin and zaragozic acid treatments diminished tachyzoite production. Moreover, increased lipid droplet contents and enhanced cholesterol esterification was detected and inhibition of the latter significantly blocked parasite proliferation. Furthermore, artificial increase of host cellular lipid droplet disposability boosted parasite proliferation. Interestingly, lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor 1 expression was upregulated in infected endothelial hostcells, whilst low density lipoproteins (LDL) receptor was not affected by parasite infection. However, exogenous supplementations with non-modified and acetylated LDL both boosted B. besnoiti proliferation. Overall, current data show that B. besnoiti simultaneously exploits both, endogenous cholesterol biosynthesis and cholesterol uptake from exogenous sources, during asexual replication

Private video surveillance : an empirical study on video surveillance in the home environment

Innerhalb der Sozialwissenschaften wird vornehmlich der Bereich Videoüberwachung im öffentlichen Raum oder in öffentlich zugänglichen Räumen bearbeitet. Dieser Forschungslücke wird mit dieser Arbeit begegnet. Die zentralen Fragestellungen beziehen sich auf die Intentionen für die Verwendung privater Videoüberwachungstechniken und auf die Ziele dieser Art von Überwachung. Dabei interessiert auch die Systematik hinter der Videoüberwachung und die Frage, auf welche Art und Weise dabei technisch vorgegangen wird. Neben der empirischen Untersuchung des Themenfeldes wird das Phänomen der privaten Videoüberwachung im häuslichen Umfeld auch theoretisch betrachtet. Dabei werden sozialwissenschaftliche Konzepte identifiziert, die für das Forschungsfeld Erklärungskraft besitzen. Für die explorative empirische Untersuchung wurde als methodischer Zugang ein Triangulationsmodell entwickelt, das über episodische und strukturierte Anwender- und Experteninterviews sowie Opinion Mining durch Erhebung von Kundenrezensionen zu einschlägigen Videoüberwachungstechniken möglichst viele unterschiedliche Perspektiven auf den Forschungsgegenstand eröffnet und in sich einen ersten Validierungsprozess beinhaltet. Als Resultat dieses Vorgehens liegt nun eine große Anzahl strukturierter qualitativer empirischer Daten und Erkenntnisse zu dem bisher wissenschaftlich von Soziologen nur wenig bearbeiteten Phänomen der privaten Videoüberwachung im häuslichen Umfeld vor

Role of PhyR and growth phase-dependent regulation in Rhodobacter sphaeroides

The data obtained in this present work demonstrated that PhyR has no major role in the general stress response of the alphaproteobacterium R. sphaeroides, in contrast to other bacteria. We could attribute a role for PhyR in response to membrane stress and UV stress in the dark rather than in oxidative stress in R. sphaeroides, supporting a more specialized function in this bacterium. PhyR has no major contribution to the complex regulatory network (Billenkamp F, et al., 2015, Cabiscol E, et al., 2000, Glaeser J, et al., 2011, Hess WR, et al., 2014) of protein and sRNA regulators that control the oxidative stress response in R. sphaeroides. PhyR was found to have a function in cell viability in the stationary phase. In addition, the activity of three gene promoters (RSP_0557, sitA (RSP_0904) and ccR (RSP_0960)) was determined throughout the growth phase and outgrowth. These genes were selected on the basis of differential regulation as determined by microarray and RNAseq approaches. Transcriptional fusions were constructed between these promoters (genes RSP_0557, sitA (RSP_0904) and ccR (RSP_0960)) and the lacZ reporter system. The three promoters showed growth phase-dependent regulation. The sigma factors RpoHI and RpoHII are clearly important for the overall activity of the RSP_0557 promoter and the sitA promoter under microaerobic growth conditions. However, while RpoHI and RpoHII have a function on the activity of the RSP_0557 promoter in the stationary phase and following outgrowth, they have no function on the growth phase-dependent regulation of sitA under microaerobic growth conditions. Oxygen saturation also has an important role on the regulation of RSP_0557, sitA (RSP_0904) and ccR (RSP_0960) throughout the growth phase. The supercoiling activity of gyrase was also investigated throughout the growth phase. In the wild type strain, after 60h of growth, the cells almost completely lost supercoiling activity, but this was recovered as soon as nutrients became available. Furthermore, it was demonstrated that H-NS and IhfB had an influence on the supercoiling activity of gyrase in the late stationary phase and following outgrowth

Der Einfluss einer SMAD- und AP-1-Inhibition durch Überexpression von YB-1 und JDP2 auf die kontraktile Funktion des Herzens

Die Transkriptionsfaktoren AP-1 und SMAD sind klassische Signalmoleküle von TGF-β, welchem eine entscheidende Rolle im kardialen Remodelling zugeschrieben wird. Eine Inhibition dieser Faktoren mittels AP-1- und SMAD-spezifischen Decoy-Oligonukleotiden als auch durch Überexpression von YB-1 und JDP2, kann die Herzmuskelzellen vor der Apoptose- und Hypertrophie-Induktion durch TGF-β schützen. YB-1 ist sowohl in der Lage den SMAD-Signalweg zu inhibieren als auch die AP-1-abhängige Genexpression zu unterbinden. JDP2 dagegen inhibiert nur AP-1, indem es um die gleiche Bindungsstelle wie AP-1 konkurriert. Unklar war bisher, welche Auswirkungen die verschiedenen Möglichkeiten der Inhibition von AP-1 und SMAD auf die kontraktile Funktion von Herzmuskelzellen haben. Deshalb wurden Kontraktionsmessungen auf Zellebene nach YB-1- und JDP2-Überexpression sowie nach Transformation von Herzmuskelzellen mit AP-1- und SMAD-spezifischen Decoy-Oligonukleotiden angefertigt. Zudem wurde mittels Westernblot die Expression der Proteine des Calciumhaushaltes nach YB-1- und JDP2-Überexpression untersucht. In dieser Arbeit wurde JDP2 für die Kontraktionsversuche für eine Woche überexprimiert. Die Überexpression wurde in doppelt-transgenen Mäusen generiert, die unter der Kontrolle eines Transaktivators JDP2 herzspezifisch überexprimierten. Neben den Untersuchungen an den Herzen, die eine Woche JDP2 überexprimierten, wurde für die Westernblots die JDP2-Überexpression ebenfalls für vier und zehn Wochen generiert. Die YB-1-Überexpression wurde mittels eines adenoviralen Konstrukts in adulten, isolierten Kardiomyozyten der Ratte für 24 und 48 Stunden generiert. Die erhobenen Daten zeigen, dass sowohl nach einwöchiger JDP2-Überexpression die Kontraktilität auf Zellebene als auch in vivo in der Echokardiographie reduziert ist. Durch die YB-1-Überexpression wurde ebenfalls die Kontraktilität der isolierten Kardiomyozyten reduziert. In beiden Ansätzen blieb in vitro die β-adrenerge Ansprechbarkeit erhalten. Weder eine AP-1- noch SMAD-spezifische Inhibition durch Decoy-Oligonukleotide konnte die Kontraktilität negativ beeinflussen. Dies legt den Schluss nahe, dass die Reduktion der Kontraktilität durch JDP2 und YB-1 weder über AP-1 noch über SMADs vermittelt wird. Die Westernblots nach JDP2-Überexpression zeigten außerdem eine reduzierte SERCA-Expression, eine Reduktion des NCX und des β1-Adrenorezeptor nach zehn Wochen und eine verstärkte Expression des PLBs mit einem verminderten Phosphorylierungsstatus nach einer, vier und zehn Wochen JDP2-Überexpression. Dies könnte die reduzierte kontraktile Funktion erklären. Unter YB-1 dagegen konnte eine erhöhte SERCA- und NCX-Expression nach 48 Stunden nachgewiesen werden. Dies scheint eher ein reaktiver Effekt der YB-1-Überexpression zu sein. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass YB-1 und JDP2 durch ihren negativen Einfluss auf die kontraktile Funktion des Myokards nicht therapeutisch eingesetzt werden sollten. Andererseits wird deutlich, dass AP-1 und SMAD nach wie vor ein mögliches Target zur Verhinderung des kardialen Remodelings darstellen.The transcription factors AP-1 and SMAD were detected as typical signalling molecules of TGF-β and thereby they are mediators of cardiac remodelling. By use of decoy-oligonucleotides with specific binding site for AP-1 and SMAD, but also by overexpression of the transcription factors JDP2 and YB-1 processes of cardiac remodelling such as hypertrophy and apoptosis could be prevented in ventricular cardiomyocytes. JDP2 binds AP-1-subunits and AP-1-specific promoter elements. Both lead to inactivated transcription of AP-1. YB-1 is able to interfere in SMAD-signalling pathways and also inhibits the AP-1-signalling. The influence of JDP2- and YB-1-overexpression as well as specific AP-1- and SMAD-inhibition on the contractile function was still unclear. I, therefore, investigated, if overexpression of JDP2 in transgenic mice influences contractile function at the cellular level and in echocardiography. In another approach, cardiomyocytes were either transfected with adenovirus for YB-1 overexpression or transformed with decoy-oligonucleotides for specific SMAD- and AP-1-inhibition, and the contractile function was analysed. Furthermore the expression of the proteins from the calcium signalling pathway after YB-1- and JDP2-overexpression was examined by western blots. The results showed that JDP2-overexpression for one week as well as the YB-1-overexpression impair the contractility of cardiomyocytes. In both approaches β-adrenergic responsiveness was maintained in vitro. The echocardiography also showed a decreased cardiac output after one week JDP2-overexpression. Neither the AP-1- nor the SMAD-specific inhibition by decoy-oligonucleotides influenced the contractile function of the cardiomyocytes. These results indicate that the impact of YB-1 and JDP2 on the contractile function of cardiomyocytes is not mediated by AP-1 or SMAD, but is more likely mediated via other transcription inhibitory pathways. The western blots of cardiac proteins after one week JDP2-overexpression revealed a reduced SERCA-expression, a reduction of NCX and β1-adrenorezeptor after ten weeks and also an increased expression of PLB in association with a decreased phosphorylation of PLB after one, four and ten weeks JDP2-overexpression. All of these changes can be due to altered calcium handling and could, thus, explain the reduction of the contractile function of the myocardium under JDP2. On the other hand the results of the western blots after YB-1-overexpression showed an increased expression of SERCA and NCX after 48 hour. This seems to be a compensatory effect due to the decreased contractile function upon YB-1 overexpression. In conclusion, overexpression of JDP2 and YB-1 in transgenic mice or adult cardiomyocytes of rats leads to impairment of contractile function. These transcriptions factors should, therefore, not be used for therapeutically application. On the other hand the specific inhibition of AP-1 or SMADs for inhibition of hypertrophy and apoptosis in absence of contractile impairments is still possible target for prevention of cardiac remodelling