Прямая детекция микроРНК mir-34a, -145 и -218 с помощью CRISPR/Cas13a-нуклеазы

Abstract

Using CRISPR/Cas13a-nuclease we have demonstrated a feasibility of direct detection of three miRNAs, miR-34a, -145, and -218 (their molecular signature is suggested as a diagnostic and prognostic biomarker in cervical cancer),. The detection is based on registration of a cleavage of molecular reporters bearing a fluorophore and a quencher by the complex of CRISPR/Cas13a-nuclease and guide RNA (gRNA) with a spacer of 21-23 nucleotides long. The detection sensitivity varied among miRNAs tested by 10-fold, presumably due to the unwanted intramolecular partial base paring of gRNA. The miRNA detection with Cas13a nuclease strongly depended on the presence of background RNA thus potentially compromising its direct application to complex media in a general case. Further optimization of measurement conditions including probably an additional amplification of the signal generated by collateral activity of Cas13a nuclease is necessary to directly detect miR-34a, -145, and -218 in biological samples.Показана возможность прямой детекции трех микроРНК, miR-34a, -145 и -218 (чья молекулярная сигнатура предлагается как диагностический и прогностический биомаркер при раке шейки матки), с помощью CRISPR/Cas13a-нуклеазы. Детекция основано на регистрации расщепления молекулярных «репортеров» – коротких РНК-олигонуклеотидов, несущих флуорофор и гаситель – комплексом CRISPR/Cas13a-нуклеазы и направляющей РНК (нРНК) со спейсером длиной 21-23 нуклеотида. Чувствительность обнаружения варьировала 10-кратно среди тестированных микроРНК, предположительно из-за нежелательного внутримолекулярного частичного спаривания оснований нРНК. Обнаружено, что детекция микроРНК с помощью нуклеазы Cas13a сильно зависит от присутствия фоновой РНК, что в общем случае может затруднить такую детекцию в сложном матриксе. Дальнейшая оптимизация условий измерения, включая, вероятно, дополнительное усиление сигнала, генерируемого коллатеральной активностью нуклеазы Cas13a, необходима для прямой детекции miR-34a, -145 и -218 в биологических образцах

Similar works

Full text

thumbnail-image

Biomedical Chemistry - Research and Methods (E-Journal)

redirect
Last time updated on 08/02/2024

Having an issue?

Is data on this page outdated, violates copyrights or anything else? Report the problem now and we will take corresponding actions after reviewing your request.