Использование праймеров с высокой степенью мечения в полимеразной цепной реакции

Abstract

The fluorescently-labeled DNA is widely used in various bioanalytical applications. For a number of applications, a high level of labeling could be beneficial. One of the ways to produce DNA fragments bearing multiple fluorescent tags is to use polymerase chain reaction (PCR) with primers heavily labeled with fluorophores. Here we tested how primers with multiple fluorescein tags perform in PCR. It has been found that the positioning of fluorescein tags at or near the 3′-end upon primer multiple labeling can inhibit DNA amplification (up to a complete stop when tags are placed at the 3′- or adjacent nucleotide). The mechanism, by which the presence of fluorescein tags at or near the primer 3′-end affects the PCR performance, is rather ambiguous and can involve both a steric hindrance for polymerase binding from the fluorescein moiety, as well as destabilization of a primer-template duplex. Nonetheless, if multiple fluorescein tags are attached so that at least three nucleotides from the primer 3′-end are unmodified, the production of DNA fragments bearing multiple fluorescein molecules is possible even if both primers are heavily labeled, though on the expense of amplicon yield.Флуоресцентно-меченую ДНК широко используют в различных биоаналитических приложениях. В ряде случаев высокий уровень меченья ДНК является преимуществом. Одним из способов получения фрагментов ДНК, несущих множественные флуоресцентные метки, является использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами с высокой степенью мечения. В данной работе мы исследовали, как присутствие многочисленных молекул флуоресцеина, прикреплённых к праймеру, влияет на результат ПЦР. Было обнаружено, что расположение флуоресцеиновой метки на 3′-конце праймера или вблизи него может ингибировать амплификацию (вплоть до полной остановки, когда метка находится непосредственно на 3′-концевом или соседнем с ним нуклеотиде). Механизм, посредством которого присутствие флуоресцеиновых меток на 3’-конце праймера или вблизи него влияет на эффективность ПЦР, довольно неоднозначен и может включать как стерическое препятствование связыванию полимеразы прикреплённой молекулой флуоресцеина, так и дестабилизацию дуплекса праймер-матрица. Тем не менее, если множественные флуоресцеиновые метки прикреплены к нуклеотидам праймера таким образом, что по меньшей мере три нуклеотида с его 3′-конца остаются немодифицированными, то получение фрагментов ДНК с высоким уровнем мечения возможно с помощью ПЦР, хотя и с заметно меньшим выходом, чем при использовании немодифицированных праймеров

Similar works

Full text

thumbnail-image

Biomedical Chemistry - Research and Methods (E-Journal)

redirect
Last time updated on 14/08/2023

Having an issue?

Is data on this page outdated, violates copyrights or anything else? Report the problem now and we will take corresponding actions after reviewing your request.