Papel de la agregación y la dinámica del receptor CXCR4 en la entrada del virus de la inmunodeficiencia humana

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de Lectura: 04-04-2025Esta Tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 04-10-2026La pandemia provocada por el VIH ha supuesto uno de los mayores retos para la salud pública en los últimos años. Las dificultades para encontrar una vacuna eficaz y la continua aparición de cepas resistentes a las drogas empleadas en las terapias combinatorias de los tratamientos antirretrovirales, hacen necesario el continuo desarrollo de nuevos fármacos que permitan la contención del virus. Para que el VIH entre en las células, es necesaria una primera interacción entre la glicoproteína de la envuelta viral gp120 y el receptor celular CD4, que permite la interacción posterior entre la glicoproteína y su correspondiente correceptor, un receptor de quimioquinas (CCR5 y/o CXCR4). Esta interacción promueve una serie de cambios conformacionales que afectan a la glicoproteína viral gp41 y permite la fusión entre las membranas viral y celular, liberándose el contenido del virus al citoplasma de la célula y estableciéndose el inicio del proceso de infección. Una de las aproximaciones empleadas en el bloqueo de la entrada viral es impedir la interacción entre los viriones y el CXCR4. Aunque existen fármacos capaces de bloquear el sitio de unión de este receptor y, por tanto, la entrada del VIH-1 en las células, éstos también inhiben la unión del ligando natural del receptor, la quimioquina CXCL12. Esto conlleva la aparición de efectos secundarios severos que impiden la utilización de estas drogas como tratamiento crónico de los pacientes. Diversos estudios han demostrado que la reorganización espacial de CXCR4 en la membrana celular, resulta crítica para el correcto funcionamiento del receptor. Ante la imposibilidad de utilizar fármacos que bloqueen el sitio de unión de CXCL12, nos planteamos si la modulación de la dinámica de CXCR4 podía resultar una diana terapéutica en el control de la entrada del VIH en las células. Mediante el empleo de técnicas de microscopía óptica avanzada describimos cómo la presencia de la gp120 en su conformación monomérica o trimérica nativa, fomenta el grado de agregación de CXCR4 y reduce su dinámica en la superficie celular, activando rutas de señalización y procesos celulares, similares a los desencadenados por la quimioquina. El empleo de aproximaciones que impiden la agregación del receptor CXCR4 en presencia de CXCL12, como son la utilización del mutante natural CXCR4R334X y el tratamiento con pequeños compuestos aromáticos, que se unen a residuos implicados en la oligomerización del receptor, no impidieron la oligomerización promovida por la glicoproteína viral, observándose en ambos casos, una estabilización de los heterodímeros CXCR4/CD4 y un incremento de la infección viral. Las glicoproteínas del VIH-1 promueven una oligomerización de CXCR4 que parece diferir de la observada en presencia de CXCL12. Nuestros resultados apuntan a que es la agregación de los complejos CD4/CXCR4 la que facilita la infección y que su desestabilización puede ser una potencial diana terapéuticaEsta tesis ha sido desarrollada gracias a la financiación proporcionada por la beca FPI (PRE2019-087966) del Ministerio de Ciencias e Innovación del Gobierno de España enmarcada en el proyecto SEV-2017-0712-19-

CD44v6 as a novel target in precision medicine approaches for advanced bladder cancer

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 10-04-2025Esta Tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 10-10-2026Los limitados avances en el manejo del cáncer de vejiga (CV) representan un problema de salud y social muy importante. Por lo tanto, la identificación de nuevas dianas terapéuticas con el fin de promover la medicina personalizada en el área del CV constituye una necesidad urgente. CD44v6 (una isoforma de la glicoproteína CD44) se ha asociado con un mal pronóstico, en paralelo con el incremento de la invasión, migración y metástasis en una amplia variedad de tipos de cáncer. Sin embargo, hasta la fecha, hay muy poca investigación de estas asociaciones para el caso del CV. En este estudio, hemos caracterizado CD44v6 como un biomarcador potencial y un objetivo terapéutico en el CV. En la primera parte de esta tesis, hemos evaluado la asociación de la expresión de CD44v6 con la patología del CV. El análisis de la expresión proteica de CD44v6 en tumores primarios de vejiga reveló que aproximadamente el 80% de estos tumores eran positivos para CD44v6, y esta expresión estaba vinculada con la recurrencia de la enfermedad, su progresión y la metástasis. El análisis transcriptómico de tumores derivados de pacientes identificó, además, una asociación con subtipos moleculares específicos y relacionados con un mal pronóstico. Un análisis transcriptómico detallado, que integró datos de líneas celulares con expresión diferencial de los receptores CD44 y CD44v6 con datos de tumores de pacientes, mostró que la expresión de CD44v6 se asocia con un enriquecimiento de vías dependientes de p53 (p53 y Tap63), así como procesos de adhesión focal y celular, incluyendo interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular. De esta manera, los datos obtenidos sugieren una asociación entre la expresión de CD44v6 y la progresión del CV, a través de una mayor capacidad de invasión y metástasis, que se corroboró mediante ensayos funcionales tanto in vitro como in vivo, encontrándose que la expresión de CD44v6 facilita el injerto y crecimiento. Finalmente, a través de estudios de expresión de micro-ARN, análisis transcriptómico y ensayos funcionales in vitro hemos comprobado la implicación de CD44v6 en la adquisición de resistencia a cisplatino en el CV. En la segunda parte de este estudio, evaluamos el valor potencial de un fragmento de anticuerpo de cadena única específico para CD44v6 (scFv anti-CD44v6) como elemento de direccionamiento en terapias basadas en anticuerpos o en terapia celular adoptiva para el tratamiento dirigido del CV. Mediante diferentes aproximaciones de interacciones en tiempo real y ensayos funcionales in vitro e in vivo, se observó que el scFv anti-CD44v6 presenta un perfil cinético favorable y una unión altamente específica al receptor en células de CV. En base a estas características, se han generado células NK con el receptor de antígeno quimérico (CAR-NK) específicas para CD44v6 empleando el scFv anti-CD44v6 como elemento de reconocimiento del tumor vesical. Se ha podido observar un direccionamiento altamente selectivo hacia el receptor CD44v6 en células de CV por parte de las células CAR-NK específicas para CD44v6, pudiendo comprobar asimismo su funcionalidad y actividad citotóxica frente a células de CV con alta densidad del receptor CD44v6, así como la capacidad mejorada de direccionamiento de las CAR-NK frente a tumores in vivo. En conjunto, nuestros hallazgos destacan el valor del CAR específico contra CD44v6 en la dirección de células CAR-NK para atacar tumores vesicales. Colectivamente, nuestros estudios refuerzan el papel fundamental de CD44v6 como biomarcador y diana terapéutica prometedora en CV. CD44v6 puede representar la base para futuras terapias orientadas a mejorar el manejo y los resultados de los pacientes con CV mediante la implantación de medicina de precisión basadas en anticuerpos específicos y células CAR-NK dirigidas a CD44v6Para su ejecución, este trabajo de investigación ha contado con la financiación de los siguientes proyectos: - Unión Europea; Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) Subvenciones del Ministerio de Ciencia e Innovación: SAF2015-66015-R, PID2019- 110758RB-I00 y PID2023-147517OB-I00, a Jesús M. Paramio. - Instituto de Salud Carlos III (ISCIII): CIBERONC no. CB16/12/00228 a Jesús M. Paramio, Proyecto " FINANCED BY NEXTGENERATIONEU FUNDS, WHICH FINANCE THE ACTIONS OF THE RECOVERY AND RESILIENCE MECHANISM (MRR)". - ISCIII: AC22/00015-TRANSCAN3-JTC22AECC a Marta Dueñas Porto, Proyecto "Circulating tumor microenvironment components as predictors of response to immunotherapy in urothelial cancer". Proyecto también financiado por la Fundación Científica de la Asociación Española Contra el Cáncer (FCAECC), con ID del proyecto TRNSC213883DUEN, Transcan-3 JTC2022. - ISCIII: PI20/000813 y PI23/000392, a Marta Dueñas Porto. - Fundación Eugenio Rodríguez Pascual: FERP-2022-79 a Carolina Rubio

Qualitative approach to the normalization of gambling amongst adolescents and young adults in Extremadura (Spain)

Gambling and betting are increasingly prevalent activities among adolescents and young adults. This qualitative study aims to explore the integration of gambling into the peer dynamics of young individuals in Extremadura, located in southwestern Spain, as well as to elucidate its interpretation as a normalized facet of socialization among this demographic. A total of seventy-seven adolescents and young adults from Extremadura partook in various focus group discussions. The findings of this investigation yield several noteworthy insights into the role of gambling establishments, which appear to have filled a void in youth leisure offerings, particularly in both urban and rural settings, with a notable gender disparity wherein males demonstrate a greater propensity for engagement in such locales compared to females. Additionally, scratch cards, distributed by the charitable organization ONCE (the Spanish National Society for the Blind), emerge as one of the predominant forms of gambling among young people, showcasing a rare parity in participation rates between genders. Narratives from participants suggest that initial exposure to this form of gambling commonly occurs within familial contextsThis work was supported by Centro Reina Sofía [V Convocatoria de las Ayudas a la Investigación

Cell phone use and its incidence on sociemotional skills in adolescents from rural educational institutions

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Formación del Profesorado y Educación, Departamento Interfacultativo de Psicología Evolutiva y de la Educación. Fecha de Lectura: 11-10-2024Esta Tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 11-04-2026Esta Tesis se focaliza en identificar el nivel de incidencia del uso desmedido de canales virtuales de comunicación, y particularmente el celular, sobre las habilidades socioemocionales. Para ello se contó con la participación de estudiantes de los grados 9º, 10º y 11º de dos centros educativos del municipio de Duitama - Boyacá, Colombia, el equipo docente y las familias. El enfoque metodológico utilizado ha sido de tipo mixto en dos fases, una cualitativa y otra cuantitativa. En primer lugar, se abordó el objetivo desde una línea cualitativa con perspectiva fenomenológica; para la recogida de información se utilizaron las técnicas de grupos focales en la que participaron 98 personas, observaciones no participantes a 151 estudiantes y 18 entrevistas semi-estructuradas. En una segunda fase cuantitativa y con el fin de conocer si las percepciones de esos participantes eran compartidas y generalizables a un mayor número de estudiantes, familias y profesorado se elaboró una encuesta que se administró a 92 jóvenes, 21 docentes y 63 docentes. Los resultados de ambas fases señalan que el tiempo de uso del celular por parte de los adolescentes influye en sus habilidades socioemocionales tendiendo a minimizar la interacción con personas de su entorno. Estudiantes, docentes y familias coinciden en admitir que la preferencia de los jóvenes por la comunicación virtual afecta tanto a la dinámica familiar como a las relaciones sociales en el aula y, por tanto, las relaciones interpersonales. Asimismo, las conclusiones de este estudio permiten elaborar orientaciones generales para que docentes y familias puedan guiar a los jóvenes en la resignificación del uso del celula

Desarrollo de inhibidores de IFN-I inspirados en poxvirus con potencial terapéutico

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 21-03-2025Esta Tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 21-09-2026Además de su acción antiviral, el interferón de tipo I (IFN-I) desempeña un papel clave en la inducción de la respuesta inflamatoria y la patología en un grupo de trastornos autoinflamatorios conocidos como interferonopatías. El desarrollo de nuevas terapias para estas enfermedades se ha centrado en el desarrollo de anticuerpos específicos contra el IFN-I o el receptor celular del IFN-I (IFNAR), pero con un éxito limitado. A lo largo de la evolución, los poxvirus han desarrollado numerosos mecanismos de evasión para eludir la respuesta inmunitaria del huésped, especialmente interfiriendo con las funciones efectoras inmunes. Entre ellos han desarrollado los “receptores señuelo”, proteínas solubles secretadas por las células infectadas para unirse y bloquear las citoquinas clave del huésped e impedir la respuesta inmunitaria. La proteína de unión a IFN-I de poxvirus (vIFNbp) es un receptor soluble único, conservado entre orthopoxvirus y no relacionado con IFNAR, capaz de unirse y bloquear muchos subtipos de IFN-I con amplia especificidad de especie. Su deleción resulta en una clara atenuación en diferentes modelos de infección, demostrando la importancia de este mecanismo para la infección por poxvirus. Además, este receptor señuelo es capaz de unirse a glicosaminoglicanos (GAGs) en la superficie celular mientras se une a IFN-I, lo que parece aumentar su potencial inmunomodulador al permitir la retención de este receptor alrededor del lugar de la infección. En esta tesis, hemos profundizado en cómo la vIFNbp de poxvirus modula el IFN-I durante la infección con el fin de aplicar este conocimiento al desarrollo de nuevas terapias anti-IFN. Para ello hemos diseñado y expresado un conjunto de proteínas recombinantes basadas en la vIFNbp y caracterizado extensamente su capacidad para neutralizar el IFN-I y unirse a la superficie celular in vitro. También hemos estudiado las proteínas recombinantes basadas en la vIFNbp en el modelo de patogénesis de la viruela del ratón usando virus ectromelia mutantes. Además, hemos estudiado la inducción de IFN-I en tiempo real durante la infección en ratones con virus vaccinia mutantes. Por último, hemos estudiado por primera vez el potencial terapéutico de los inhibidores solubles del IFN-I en dos modelos murinos diferentes de enfermedad autoinflamatoria, la psoriasis inducida por imiquimod y el lupus inducido por pristan

Generación y caracterización de alelos mutantes Ras1V12 en el locus Ras1 de Drosophila

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 22-11-2024Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 22-05-2026Las proteínas Ras son GTPasas monoméricas que alternan entre un estado activo (unidas a GTP) y un estado inactivo (unidas a GDP). Estas proteínas han sido extensamente estudiadas tanto por su implicación en procesos fisiológicos como patológicos. En el primer caso destaca su participación en proliferación, supervivencia y diferenciación celular, y en el segundo caso su asociación a patologías como el cáncer y diferentes RASopatías. El empleo recurrente de aproximaciones experimentales basadas en la expresión ectópica de los oncogenes Ras ha llevado a la noción de que sus mutaciones de ganancia de función promueven una activación constitutiva de la proteína, resultando en una hiperactivación de la vía de señalización Ras/Raf/ERK. Este es el caso de los estudios hechos en Drosophila melanogaster, donde la sobre-expresión de versiones activadas de la proteína Ras1, la única ortóloga a las proteínas RAS humanas, genera alteraciones en comportamientos celulares que emulan los observados en cáncer. Sin embargo, los niveles supra-fisiológicos no recapitulan las condiciones patológicas humanas más frecuentes, donde las mutaciones en RAS no van acompañadas de cambios en sus niveles de expresión y donde la expresión ectópica puede tener consecuencias tanto en la dinámica de señalización de Ras como en su interactoma. En este trabajo hemos generado líneas transgénicas de Drosophila en las que el gen Ras1 ha sido reemplazado por diferentes construcciones silvestres y mutantes de Ras1 y de la isoforma KRASB humana. La expresión a partir del promotor endógeno del mutante Ras1V12 produce un aumento de la proporción de moléculas Ras activas (unidas a GTP), lo que se traduce en fenotipos de ganancia de función relacionados con una mayor actividad de la vía de señalización Ras/Raf/ERK. Además, los mutantes Ras1V12 son capaces de cooperar con pérdidas de función en genes candidatos para promover comportamientos tumorales. Sin embargo, al contrario que la sobreexpresión de Ras1V12, la expresión endógena de Ras1V12 conserva los niveles y el patrón de activación de la vía Ras/Raf/ERK normales. Así, la proteína mutante Ras1V12 es capaz de responder a la estimulación del receptor EGFR y requiere de la función de éste para promover niveles máximos de activación de la ruta Ras/Raf/ERK in vivo. Estos resultados indican que la mutación G12V no produce la activación constitutiva de Ras in vivo y destacan la importancia de la actividad del receptor en la biología de los mutantes RasV12, lo que podría tener implicaciones clínicas debido a la ausencia de terapias eficaces contra tumores con estas mutacionesRas proteins are monomeric GTPase proteins that alternate between an active state (GTP-bound) and an inactive state (GDP-bound). These proteins have been extensively studied because of their roles in both physiologic and pathologic conditions. They play relevant roles in the control of cell proliferation, viability and differentiation, and their disregulation is associated to pathologies such as cancer and different RASopahies. The use of ectopic expression for studying Ras oncogenes led to the view of mutated Ras as a constitutively active version of the protein, which hence produce hyperactivation of the Ras/Raf/ ERK signalling pathway. This is the case of most studies performed in Drosophila melanogaster, where the overexpression of activated versions of Ras1, the only ortholog to human RAS genes, leads to cellular behaviours similar to those found in cancer. However, high levels of activated Ras expression do not recapitulate human pathological conditions, where RAS mutations are not associated to higher expression levels and where ectopic expression can alter the normal dynamics of Ras signalling and its interactome. In this work, we have generated transgenic flies in which the Ras1 gene has been replaced by different wild type and G12V mutant versions of both fly Ras1 gene and human KRASB isoform. The expression from the endogenous Ras1 promoter of mutant Ras1V12 promotes a higher accumulation of Ras molecules in the active GTP-bound form. Furthermore, Ras1V12 mutant flies display several phenotypes related to Ras/ Raf/ERK pathway gain-of-function and can cooperate with selected candidate genes to promote tumorlike behaviours. However, in contrast to overexpressed Ras1V12, endogenous expression does not modify the normal level and activation pattern of the Ras/Raf/ERK signalling pathway. Thus, the Ras1V12 mutant protein can respond to receptor stimulation and requires its activity to acquire maximal activation of the Ras/Raf/ERK signaling pathway in vivo. Altogether, these results indicate that Ras1V12 mutants are not constitutively active and highlight the relevance of the EGFR receptor for Ras1V12 activation, which may have clinical implications, as there is still no effective therapy against RAS-mutant cancer

Redes de proteínas asociadas a GRK2 en la interacción de las células de cáncer de cama con el microambiente tumoral

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 23-10-2024Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 23-04-2026La realización de esta Tesis ha sido posible gracias a la financiación obtenida de la unión europea (H2020-MSCA Programme, Grant agreement 860229-ONCORNET 2.0) y a fondos del proyecto INTEGRAMUNE (P2022/BMD-7209) de la Comunidad de Madri

Mecanismos arritmogénicos del síndrome de QT corto Tipo 3

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de Lectura: 07-10-2024Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 07-04-2026Short QT Syndrome Type 3 (SQTS3) is a rare arrhythmogenic c hannelopathy c aused by g ain -of -function mutations in K CNJ2 , the gene coding the inward rectifier potassium channel Kir2.1 responsible for the repolarizing current IK 1 . The main characteristics of S QTS3 are substantial abbreviation of the QT interval on the electrocardiogram (ECG ) and life -t hreatening arrhythmias. Due to its recent description and lethality, there are not enough individuals for clinical trials, so animal models are highly needed and desirable. The main objective of my Thesis project was to enhance the understanding of S QTS3 b y i nvestigating its electrophysiologic and arrhythmogenic mechanisms . It is characterized by variable expressivity , which led me to test the hypothesis that the phenotype depend son the specific gain -of -function mechanisms triggered by each mutation . Iused in-vivo mouse model s of three different pathogenic SQTS3 mutations (Kir2.1D 172N , Kir2.1 E 299V a nd Kir2.1 M 301K ). The last two were identified in patients presenting with the most extremely abbreviated QT intervals described in the literature. On ECG, the QT i nterval was significantlys hortened in all S QTS3 models, recapitulating the electrical phenotype of the patients . Intracardiac stimulation showed variable inducibility among S QTS3 subtypes . Kir2.1 D 172N animals presented the mildest phenotype, but Kir2.1 E 299V mice manifested atrial -specific arrhythmias, whereas Kir2.1 M 301K mice presented the most severe ventricular episodes . Patch-clamping demonstrated extremely abbreviated action potentials in Kir2.1 E 299V and Kir2.1 M 301K cardiomyocytes due to lack of inward -going rectification and increased IK 1 at voltages positive to -8 0mV. The specific interaction of Kir2.1 with other proteins contributed to the explicit cardiac manifestations in each S QTS3 mouse model . Among these, the f unctional interactions of Kir2.1 with the voltage -gated cardiac sodium channel Na V 1.5 r esponsible for IN a stand out . On one hand, Kir2.1 E 299V increase d IN a in Purkinje fibers and shifted ventricular IN a a ctivation and inactivation, increasing the excitability a nd protecting t he ventricle against arrhythmia. On the other, Kir2.1 M 301K reduced the availability of NaV 1.5, reducing I N a density a nd cardiac excitability. Altogether, my research served to i mprove the understanding of S QTS3 , and to demonstrate that its cardiac manifestations are different depending on the specific molecular defects produced by each mutation. Moreover, isoprenaline and spermine demonstrated to be effective in prolonging the QT interval of SQTS3 models, without altering other ECG parameters , so my results may contribute to identify novel a ntiarrhythmic drugs in an inheritable cardiac disease with no defined therapyMoreover, the present PhD project was supported by La Caixa Banking Foundation [ LCF/PR/HR19/52160013]; grant PI -FIS -2 020 of the public call “Proyectos de Investigación en Salud 2020” [PI20/01220 ] and “Proyectos de Investigación en Salud 2 023” [PI23/01039] funded by Instituto de Salud Carlos III (ISCIII); the Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (M CIU ) grant BFU2016 -7 5144 -R and PID2020 - 1 16935RB -I 00, and co-f nded by Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); and Fundación La Marató de TV3 [736/C/2020]. W e also receive support from the European Union's Horizon 2020 Research and Innovation programme [grant agreement GA - 9 65286]. CNIC is supported by the ISCIII, the Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) and the Pro CNIC Foundation, and is a Severo Ochoa Center of Excellence grant CEX2020 - 0 01041 -S funded by MICIN/AEI/10.13039/50110001103