Generación y caracterización de alelos mutantes Ras1V12 en el locus Ras1 de Drosophila

Abstract

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 22-11-2024Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 22-05-2026Las proteínas Ras son GTPasas monoméricas que alternan entre un estado activo (unidas a GTP) y un estado inactivo (unidas a GDP). Estas proteínas han sido extensamente estudiadas tanto por su implicación en procesos fisiológicos como patológicos. En el primer caso destaca su participación en proliferación, supervivencia y diferenciación celular, y en el segundo caso su asociación a patologías como el cáncer y diferentes RASopatías. El empleo recurrente de aproximaciones experimentales basadas en la expresión ectópica de los oncogenes Ras ha llevado a la noción de que sus mutaciones de ganancia de función promueven una activación constitutiva de la proteína, resultando en una hiperactivación de la vía de señalización Ras/Raf/ERK. Este es el caso de los estudios hechos en Drosophila melanogaster, donde la sobre-expresión de versiones activadas de la proteína Ras1, la única ortóloga a las proteínas RAS humanas, genera alteraciones en comportamientos celulares que emulan los observados en cáncer. Sin embargo, los niveles supra-fisiológicos no recapitulan las condiciones patológicas humanas más frecuentes, donde las mutaciones en RAS no van acompañadas de cambios en sus niveles de expresión y donde la expresión ectópica puede tener consecuencias tanto en la dinámica de señalización de Ras como en su interactoma. En este trabajo hemos generado líneas transgénicas de Drosophila en las que el gen Ras1 ha sido reemplazado por diferentes construcciones silvestres y mutantes de Ras1 y de la isoforma KRASB humana. La expresión a partir del promotor endógeno del mutante Ras1V12 produce un aumento de la proporción de moléculas Ras activas (unidas a GTP), lo que se traduce en fenotipos de ganancia de función relacionados con una mayor actividad de la vía de señalización Ras/Raf/ERK. Además, los mutantes Ras1V12 son capaces de cooperar con pérdidas de función en genes candidatos para promover comportamientos tumorales. Sin embargo, al contrario que la sobreexpresión de Ras1V12, la expresión endógena de Ras1V12 conserva los niveles y el patrón de activación de la vía Ras/Raf/ERK normales. Así, la proteína mutante Ras1V12 es capaz de responder a la estimulación del receptor EGFR y requiere de la función de éste para promover niveles máximos de activación de la ruta Ras/Raf/ERK in vivo. Estos resultados indican que la mutación G12V no produce la activación constitutiva de Ras in vivo y destacan la importancia de la actividad del receptor en la biología de los mutantes RasV12, lo que podría tener implicaciones clínicas debido a la ausencia de terapias eficaces contra tumores con estas mutacionesRas proteins are monomeric GTPase proteins that alternate between an active state (GTP-bound) and an inactive state (GDP-bound). These proteins have been extensively studied because of their roles in both physiologic and pathologic conditions. They play relevant roles in the control of cell proliferation, viability and differentiation, and their disregulation is associated to pathologies such as cancer and different RASopahies. The use of ectopic expression for studying Ras oncogenes led to the view of mutated Ras as a constitutively active version of the protein, which hence produce hyperactivation of the Ras/Raf/ ERK signalling pathway. This is the case of most studies performed in Drosophila melanogaster, where the overexpression of activated versions of Ras1, the only ortholog to human RAS genes, leads to cellular behaviours similar to those found in cancer. However, high levels of activated Ras expression do not recapitulate human pathological conditions, where RAS mutations are not associated to higher expression levels and where ectopic expression can alter the normal dynamics of Ras signalling and its interactome. In this work, we have generated transgenic flies in which the Ras1 gene has been replaced by different wild type and G12V mutant versions of both fly Ras1 gene and human KRASB isoform. The expression from the endogenous Ras1 promoter of mutant Ras1V12 promotes a higher accumulation of Ras molecules in the active GTP-bound form. Furthermore, Ras1V12 mutant flies display several phenotypes related to Ras/ Raf/ERK pathway gain-of-function and can cooperate with selected candidate genes to promote tumorlike behaviours. However, in contrast to overexpressed Ras1V12, endogenous expression does not modify the normal level and activation pattern of the Ras/Raf/ERK signalling pathway. Thus, the Ras1V12 mutant protein can respond to receptor stimulation and requires its activity to acquire maximal activation of the Ras/Raf/ERK signaling pathway in vivo. Altogether, these results indicate that Ras1V12 mutants are not constitutively active and highlight the relevance of the EGFR receptor for Ras1V12 activation, which may have clinical implications, as there is still no effective therapy against RAS-mutant cancer