GUIMARAES, C. T.

PADILHA, L.

PAIVA, E.

Portuguese

Infoteca-e

Avaliação da Pureza Genética em Sementes deMilho Utilizando Marcadores MicrossatélitesSete Lagoas, MGDezembro,200330ISSN 1518-4269AutoresLilian PadilhaClaudia Teixeira GuimarãesPh.D. Biotecnologia Vegetalclaudia@cnpms.embrapa.brEdilson PaivaPh.D.Biotecnologia Vegetaledilson@cnpms.embrapa.br Os sistemas de produção de sementes de milho são caracterizados porserem extremamente competitivos, fornecendo um produto final comalto valor agregado, com alta qualidade genética, física, fisiológica esanitária. A valorização da qualidade das sementes foi intensificadacom a aprovação da Lei de Sementes, n°10.711 de 05 de agosto de2003, que fortalece a fiscalização da produção e a comercialização desementes no país, além de abrir o sistema de certificação a entidadesprivadas e aos próprios produtores de sementes.Nas etapas de obtenção e multiplicação das sementes, atenção especialé dada à sua pureza genética, pois esta irá garantir que ascaracterísticas de interesse acrescentadas aos materiais comerciaissejam mantidas e expressas nos cultivos subseqüentes. Como, nacultura do milho, a grande maioria das cultivares comercializadas éhíbrida, obtidas a partir de cruzamentos entre linhagens, acontaminação ocorre principalmente pela autofecundação do parentalfêmea nos campos de produção de sementes. Tal contaminação temconseqüências indesejáveis, como a redução na qualidade fisiológicadas sementes e na produção final de grãos da cultura do milho (VonPinho, 1996). No caso de híbridos simples, produzidos pelo cruzamentoentre linhagens endogâmicas, existe ainda o risco da liberação dassementes das linhagens autofecundadas misturadas ao híbrido. Esse éum fato preocupante para a empresa detentora do híbrido, uma vez quenas linhagens reside grande parte da tecnologia e dos esforços demelhoramento da empresa, que ficariam expostos às apropriaçõesindevidas. Assim, torna-se essencial um sistema que permita monitorare rastrear contaminações genéticas que ocorrem no campo, permitindoo fornecimento de sementes com elevados padrões de pureza genéticaaos produtores de sementes certificadas e, conseqüentemente, aosprodutores de grãos.A avaliação da pureza genética tem sido realizada por meio demarcadores morfológicos baseados em características das sementes,plântulas, plantas em desenvolvimento e espigas. Com o rápidoaperfeiçoamento das técnicas moleculares, fundamentadas naCircTéc30.p65 12/03/04, 09:2712 Avaliação da pureza genética em sementes de milho utilizando marcadores microssatélitesamplificação de fragmentos de DNA, grandesavanços têm sido alcançados na área dosmarcadores de DNA. Dentre as técnicas demarcadores de DNA disponíveis, pode serdestacada a de microssatélites ou SSR(Seqüências Simples Repetidas), em quesegmentos de seqüência repetida,distribuídos aleatoriamente no genoma, sãoamplificados utilizando-se pares de primersespecíficos. A técnica de microssatélites écaracterizada pela simplicidade, rapidez eprecisão na geração dos perfis genéticos,sendo, ainda, facilmente automatizada. Essesmarcadores são os mais indicados para omonitoramento da pureza genética, devido àssuas características de multialelismo e co-dominância, apresentando um elevadoconteúdo de informação genética por loco. Acaracterística de co-dominância permite quesejam detectadas as diferentes contribuiçõesparentais nas progênies. Vários trabalhos têmapresentado a aplicação de marcadoresmicrossatélites no monitoramento da purezagenética de sementes (Salgado, 2001;Padilha, 2002). Outra vantagem dosmicrossatélites é que eles requerem umapequena quantidade de DNA e o mesmopode ser extraído de qualquer materialbiológico, sementes ou plântulas emdiferentes fases do desenvolvimento,permitindo uma avaliação precoce e eficientedos lotes de sementes.A Figura 1 exemplifica as características demultialelismo e de co-dominância dosmarcadores SSR, em que um par de primer,representando um loco genético, amplificavários alelos em diferentes materiaisgenéticos distintos, permitindo, assim, adistinção entre os híbridos simples e as suasrespectivas linhagens parentais. A avaliaçãoda pureza genética de um lote de sementesde um híbrido simples comercial éapresentada na Figura 2, em que foi utilizadoum par de primer microssatélite paraamplificar dois alelos distintos entre aslinhagens parentais. Assim, a contaminação édetectada quando o perfil genético dealguma semente não equivale ao do híbridosimples. Na Figura 2, observa-se que asemente 10 foi originada da autofecundaçãoda linhagem parental fêmea L2.No processo de manutenção do estoque delinhagens elites utilizadas nos programas demelhoramento de cultivares, é necessário queas linhagens sejam mantidas com um elevadograu de homozigose e de pureza. Da mesmaforma, os marcadores SSR permitemmonitorar o nível de homozigose daslinhagens e acelerar o processo de obtençãodas mesmas, identificando os indivíduos queapresentam maior número de locos emhomozigose (Gethi et al., 2002; Padilha,2002; Prasad et al., 2000; Senior et al.,1998; Smith et al.,1997). Uma vezidentificada a heterozigosidade residual emuma linhagem, elas podem ser submetidas aum avanço na geração de autofecundação, apartir de indivíduos únicos que apresentemníveis elevados de homozigose entre os locosavaliados. Na Figura 3, sementes genéticas de28 indivíduos das linhagens L1 e L2 foramgenotipadas com o loco microssatélitebnlg589 para avaliação do nível de endogamiadas mesmas. O padrão de amplificaçãodemonstrou que todos os indivíduos dalinhagem L1 eram homozigotos, ao contrárioda linhagem L2, onde foi verificado que osindivíduos 6, 7, 8, 15 e 18 apresentavam esseloco em heterozigose. A combinação de umconjunto de locos microssatélites permite oacompanhamento do nível de homozigosedas linhagens.A adaptação e a incorporação da tecnologiade marcadores microssatélites às atividadesdo programa de melhoramento é umaestratégia precisa e eficiente, que pode serutilizada para garantir elevados padrões depureza genética das linhagens elite e dassementes híbridas de milho. Além dascaracterísticas fenotípicas, o melhorista teráacesso às informações sobre a variabilidadegenética, advindas diretamente do DNA,sendo um grande diferencial na seleção dasplantas que serão utilizadas como fonte dassementes genéticas. Por se tratar de umatécnica de análise rápida, precisa eindependente do ambiente, ela supera aslimitações inerentes aos marcadoresmorfológicos utilizados para tais propósitosaté então.Figura 1. Perfis genéticos gerados com um par de primermicrossatélite, diferenciando três híbridos simples HS1, HS2e HS3 das suas respectivas linhagens L1, L2, L3, L 4, L 5 e L6.L1   L2     HS1    L 3    L 4   HS2    L 5   L6   HS3 CircTéc30.p65 12/03/04, 09:2723Avaliação da pureza genética em sementes de milho utilizando marcadores microssatélitesExemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Milho e SorgoEndereço: Rod. MG 424 km 45 - Caixa Postal 151Fone: (31) 3779-1000Fax: (31) 3779-1088E-mail: sac@cnpms.embrapa.br1a edição1a impressão (2003): 200 exemplaresPresidente: Ivan CruzSecretário-Executivo: Frederico Ozanan M. DurãesMembros: Antônio Carlos de Oliveira, Arnaldo Ferreirada Silva, Carlos Roberto Casela, Fernando TavaresFernandes e Paulo Afonso VianaSupervisor editorial: José Heitor VasconcellosRevisão de texto: Dilermando Lúcio de OliveiraTratamento das ilustrações: Tânia Mara A. BarbosaEditoração eletrônica: Tânia Mara A. BarbosaComitê depublicaçõesExpedienteCircularTécnica, 30Referências BibliográficasL1     L2       HS     1     2      3      4      5       6     7      8      9     10     11    12   13  Padrões         Amostra de Sementes de Milho Híbrido Comercial Figura 2. Perfil genético obtido pela amplificação de um parde primer microssatélite para avaliação de uma amostra desementes do híbrido simples (HS) comercial de milho. A L1 éa linhagem parental macho, a L2 é a linhagem parental fêmeae os números de 1 a 13 são as sementes do lote. Nota-seque a semente 10 possui apenas o alelo da linhagem L2,indicando que a sua origem é a autofecundação da linhagemfêmea L2 e, portanto, é uma contaminação genética. B  1     2    3    4     5    6    7    8    9  10  11  12  13   14   1 5  16  17  18 19  20   21   2 2  2 3  24  25  2 6 2 7 28   A  1   2     3    4    5    6     7   8    9    10  11 12  13  14   1 5  16  17 18  19   2 0  2 1  22  23 24 2 526  2 7  28  Figura 3 -  Avaliação do nível de endogamia das linhagens L1(A) e L2 (B). A linhagem L1 apresenta um elevado nível dehomozigose, ao passo que na linhagem L2 são identificadosindivíduos em heterozigose (indicados pelas setas).GETHI, J. G.; LABATE, J. A.; LAMKEY, K. R.;SMITH, M. E.; KRESOVICH, S. SSR variationin important U. S. maize inbred lines. CropScience, Madison, v. 42, n. 4, p. 952-957,2002.PADILHA, L. 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Avaliação da pureza genética em sementes de milho utilizando marcadores microssatélites.

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Avaliação da pureza genética em sementes de milho utilizando marcadores microssatélites.

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