Orian-Rousseau, V.

Ponta, H.

KITopen

Als wir uns vor mehr als 20 Jahrenentschlossen, nach Genen zu su-chen, die spezifisch in metasta-sierenden Tumorzellen aktiv sind,hatten wir zwei Hoffnungen: Er-stens könnten solche „Markerge-ne“, speziell natürlich die von ihnenhergestellten Proteine, diagnosti-sche und eventuell auch therapeu-tische Bedeutung im Kampf gegenMetastasen bekommen. Zweitenskönnten uns die von solchen Ge-nen abgeleiteten Proteine Auf-schluss über die molekularen Wirk-mechanismen geben, die zur Me-tastasierung von Tumorzellen füh-ren. Mit der Identifizierung vonCD44 v6 als einem der ersten me-tastasenspezifischen Proteinehatten wir sehr bald die Möglich-keit, beide Linien zu verfolgen. Der erste Aspekt, der der medizi-nischen Relevanz, war vielver-sprechend nachdem wir gezeigthatten, dass ein homologes CD44-Gen auch beim Menschen vor-kommt (wir hatten es ursprünglichin der Ratte identifiziert, da wir jain einem geeigneten Modellorga-nismus seine metastasenspezifi-schen Eigenschaften testen woll-ten) und in einer Reihe von mensch-lichen Tumoren ein Indiz für bös-artiges Wachstum – also Metasta-sierung – ist. Über ein Patent ge-lang es uns, eine große pharma-zeutische Firma ins Boot zu be-kommen, die uns tatkräftig unter-stützte. Mit deren Hilfe haben wireine ganze Palette von Antikör-pern hergestellt, also Proteine, diespezifische Strukturen auf anderenProteinen, in unserem Fall CD44 v6,erkennen und binden können. Die-se Antikörper wurden dann zumNachweis von CD44 v6 und zur In-hibition seiner Funktion eingesetzt.Nachdem alle Versuche erfolgver-sprechend verliefen, hat diesepharmazeutische Firma das Projektgestartet, CD44 v6 als therapeuti-sches Zielmolekül zur Bekämp-fung von Metastasen zu verwen-den. Dies ist ein langwieriger undextrem kostenaufwändiger Weg.Es wurden so genannte „humani-sierte“ Antikörper hergestellt, diehumanes CD44 v6 erkennen undvon menschlichen Immunzellen to-leriert werden. Diese Antikörpermüssen in großen Mengen und un-ter besonderen Sicherheitsvor-kehrungen synthetisiert werden(sie dürfen z. B. nicht mit Viren kon-taminiert sein), und wurden dann inersten klinischen Tests auf phar-makologische Eignung in Tumor-patienten eingesetzt. Nachdemauch diese Tests zufriedenstellendverlaufen waren, wurden die Anti-körper durch Fusion mit einem To-xin so verändert, dass ihre Bin-dung an Zellen (bevorzugt natürlichTumorzellen), die Tötung der Zel-len bewirkt. Sieben unheilbar anKrebs erkrankte Patienten wurdenmit diesen Toxinantikörpern be-handelt. Leider zeigten diese Pa-tienten neben der Hemmung desTumorwachstums Krankheits-symptome auf der Haut, die einesder normalen Organe ist, die eben-falls CD44 v6 tragen. Einer der Pa-tienten verstarb an diesen Symp-tomen und daher wurde die ge-samte Testreihe abgebrochen [1].Damit war eine Entwicklung, diemehr als 10 Jahre gedauert hat-te, in den Sand gesetzt. Gleichzei-tig war es zunächst das Aus für CD44 v6 als therapeutisches Me-tastasenzielgen, weil man erwartenmusste, dass die Behandlung vonPatienten mit zu vielen und zuschwerwiegenden Nebenwirkun-gen verbunden ist. Die zweite Möglichkeit, die uns dieIdentifizierung von CD44 v6 eröff-nete, nämlich Wirkmechanismen zuentdecken, die relevant für Meta-stasierung sind, war zwar ebensolangwierig wie der erste Ansatz,dafür aber weit weniger risikobe-haftet und wissenschaftlich sehr er-folgreich. Über die Identifizierungder Wirkmechanismen stießen wiraber auch auf neue Möglichkeitender Intervention mit ihrer Wirkungund damit auf neue therapeutischeZiele. Im Folgenden soll ein solcherAnsatz beschrieben werden. Das CD44-v6-Protein ist ein Trans-membranprotein auf der Ober-fläche von Zellen mit einem extra-zellulären Abschnitt, einem trans-membranen Teil und einem intra-zellulären Abschnitt (Abb. 1). Inden letzten fünf Jahren ist es unsgelungen, diejenige Funktion vonCD44 v6 zu identifizieren, die für dieBildung von Metastasen von Tu-morzellen verantwortlich ist. Es istnämlich ein Korezeptor für Wachs-tumsfaktorrezeptoren, spezifischdes Met-Rezeptors, der für Zell-wanderung und Zellvermehrungund invasives Wachstum verant-wortlich sein kann – Eigenschaften,die auch eine metastasierende Tu-morzelle benötigt. Wachstums-faktorrezeptoren sind generellOberflächenproteine, die durch dieBindung eines Liganden (einesWachstumsfaktors) aktiviert wer-den (siehe auch die Abb. 1). DieseAktivierung führt zu einer Ketten-reaktion im Zellinnern (man sprichtvon „Signaltransduktion“) wobeimehrere Proteine nacheinanderaktiviert werden. Am Ende der Ket-te befindet sich ein Protein, das,wenn aktiviert, im Zellkern Gene ak-tivieren oder reprimieren kann undauf diese Weise zelluläres Wachs-123(123)Von der Grundlagenforschung zur Entwicklungmetastasenspezifischer PeptideH. Ponta, V. Orian-Rousseau, ITGNACHRICHTEN - Forschungszentrum Karlsruhe  Jahrg. 39  2/2007  S. 123–127 tum oder Bewegung steuert. Nach-dem man lange Zeit dachte, dasssolche Wachstumsfaktorrezepto-ren nur über die Bindung ihres Li-ganden reguliert werden, zeigt sichnun, dass es darüber hinaus nocheine Feinregulation über Korezep-toren gibt – und ein solcher Kore-zeptor ist CD44 v6. Über die phy-siologische Bedeutung dieser Fein-regulation haben wir in den Nach-richten 1/2002 berichtet [2]. Siekontrollieren, ob in einer gegebe-nen physiologischen Situation dieAktivierung des Rezeptors durchseinen Liganden überhaupt pas-sieren soll. In diesem Artikel soll nunerhellt werden, wie CD44 v6 alsKorezeptor funktioniert. Antikörperproteine, die spezifischan den extrazellulären Teil vonCD44 v6 binden, waren ursprüng-lich als Hemmer der Metastasie-rung von Tumorzellen im Tiermo-dell Ratte identifiziert worden [3].Die gleichen Antikörper hemmenauch die Aktivierung des Met-Re-zeptors durch seinen Liganden.Das bedeutet, dass die extrazel-luläre Domäne von CD44 v6 an derAktivierung von Met beteiligt ist.Entweder benötigt der Met-Re-zeptor die Bindung an CD44 v6, da-mit er von seinem Liganden er-kannt werden kann, oder CD44 v6muss den Liganden primär bindenund ihn dann seinem Rezeptor„präsentieren“. Dass letzteres derFall ist, hat Alexandra Matzke, einPostdoc in unserem Labor, in einerReihe von eleganten Experimentengezeigt. Sie hat die Bindung des Li-ganden in Zellen untersucht, dieentweder sowohl CD44 v6 als auchden Met-Rezeptor (als positiveKontrolle) oder nur den Met-Re-zeptor oder nur CD44 v6 auf ihrerOberfläche tragen. Der Met-Re-zeptor alleine reichte nicht zur Bin-dung seines Liganden aus, wohlaber CD44 v6 alleine. Damit ist ei-ne Funktion von CD44 v6 geklärt.Welches sind aber die Aminosäu-ren im CD44-v6-Protein (Proteinesind aus Aminosäuren aufgebaut,die linear miteinander verknüpftsind), die für die Bindung der Li-ganden und damit der Aktivierungdes Met-Rezeptors verantwortlichsind? Auch dieser Frage hat sichAlexandra Matzke angenommen.Sie hat kritische Aminosäuren inCD44 v6 durch Mutation verän-dert und solche Mutantenproteineauf ihre Fähigkeit, als Korezeptorzu funktionieren, getestet. Auf die-se Art und Weise gelang es ihr, ei-ne Sequenz von drei aufeinander124(124)Abb. 1: Für die Aktivierung des Transmembranrezeptors Met, dargestellt als Phosphorylierung (P) imZellinneren, ist die Bindung seines Liganden, des Wachstumsfaktors HGF (hepatocyte growth fac-tor), im Komplex mit CD44 v6 notwendig (linker Teil der Abbildung). Ein CD44-v6-spezifisches Pep-tid interferiert mit der korrekten Faltung von CD44 v6 (rechter Teil der Abbildung) und verhindert da-mit die Bindung des Liganden und die Aktivierung des Rezeptors.CD44CD44Met MetextrazellulärintrazellulärZellmembranPv6 PeptidHGFHGFv6 v6Pfolgende Aminosäuren in CD44 v6dingfest zu machen. Nur wenn die-se drei Aminosäuren in der extra-zellulären Domäne verändert wa-ren, war CD44 v6 als Korezeptor in-aktiv.Dieser Befund hat neben seinerwissenschaftlichen Bedeutung (wiebeeinflussen diese drei Amino-säuren die Struktur des Proteins?)eine eminente praktische Bedeu-tung. Denn dieses Ergebnis im-pliziert, dass möglicherweise klei-ne Peptide, deren Aminosäure-sequenz die drei kritischen Ami-nosäuren beinhalten, die Aktivitätdes Korezeptors blockieren könn-ten und damit die Aktivität desMet-Rezeptors inhibieren könn-ten. Um diese Möglichkeit zu te-sten, haben wir solche Peptidesynthetisieren lassen. Und tatsäch-lich fanden wir, dass  Peptide, dienur aus fünf Aminosäuren aufge-baut sind, aber die drei kritischenenthalten, erstens die Bindung desMet-Liganden HGF an CD44 v6und damit zweitens die Aktivie-rung des Met-Rezeptors hemmen(siehe Abb. 1). Wenn die Korezeptorfunktion vonCD44 v6 für den Met-Rezeptortatsächlich der kritische Schritt fürdie Metastasierung der Tumorzel-le ist, sollten diese spezifischenPeptide auch die Metastasierungin vivo, in der Ratte, unterdrücken.Wir haben die Tumorzellen unter dieHaut von Ratten appliziert. Nach-dem sich Primärtumore gebildethatten, haben wir Peptide dreimalwöchentlich injiziert (bisher nur indie Nähe des Tumorgewebes; inweiteren Experimenten ist vorge-sehen, die Peptide intravenös zuverabreichen) und die Tiere vor Er-reichen des moribunden Stadiumsvon „Kontrolltieren“ (ohne Injekti-125(125)Tab. 1: Metastasierungstest. Tumorzellen aus Rattenpankreas mithohem Metastasierungspotenzial wurden in syngene Ratten unterdie Haut appliziert. Nach Anwachsen des Tumors wurden in den Tu-mor entweder Kontrollpeptide (Tiere1 und 2) oder CD44-v6-spezi-fische Peptide (Tiere 3 und 4) drei Mal wöchentlich gespritzt. BeiErreichen des moribunden Stadiums der Tiere 1 und 2 wurden alleTiere getötet und die relative Zunahme des Gewichtes des dem Tu-mor benachbarten Lymphknoten (LN) und die Zahl der Lungenme-tastasen ermittelt.Tumor- Relative Zahl dervolumen  LN- Lungen-[mm3] Zunahme metastasen weiblich 1 1071 1,76 43 weiblich 2 3588 1,97 15 männlich 1 6400 2,50 29 männlich 2 34020 2,04 > 50 weiblich 3 3800 1 1 weiblich 4 3348 1 0 männlich 3 32938 1 0 männlich 4 1368 1 0 on der spezifischen Peptide) aufMetastasen in der Lunge undLymphknoten untersucht. Alle Tie-re, die Tumorzellen und ein Kon-trollpeptid, das die drei kritischenAminosäuren nicht enthielt, inji-ziert bekamen, entwickelten mas-sive Metastasen in Lymphknotenund Lunge. Im Gegensatz dazuzeigten alle Tiere, denen das spe-zifische Peptid injiziert worden war,weder Lymphknoten- noch Lun-genmetastasen (Tab. 1). Interes-santerweise war das Wachstumdes Primärtumors von dem Peptidnicht beeinflusst. Dieses Peptidstellt damit ein selektives Mitteldar, Metastasenbildung zu unter-drücken und ist somit eine neueMöglichkeit, ein Therapeutikum zuentwickeln. Generell sind solchePeptide leicht und preiswert zusynthetisieren und über Modifika-tionen kann man deren Stabilitätund damit deren Verweildauer imOrganismus beeinflussen. Durchsolche Veränderungen lassen sichmöglicherweise auch Nebenwir-kungen minimieren oder gar aus-schalten. In diesem Zusammen-hang ist es interessant, dass imTierexperiment in Ratten keinerleiNebenwirkungen bei der Behand-lung mit dem Peptid zu beobach-ten waren.Für die meisten Experimente, diewir zur Identifizierung des Wirk-mechanismus von CD44 v6 alsKorezeptor für den Met-Rezeptordurchgeführt haben, verwendetenwir Zelllinien. Solche Zelllinien sindin den meisten Fällen transfor-mierte Zellen, die aus Tumorenstammen oder in vitro zu Tumor-zellen verändert wurden. SolcheZellen sind viel leichter zu hand-haben als primäre Zellen und ha-ben eine unbegrenzte Lebens-dauer. Es erhebt sich aber sofort dieFrage, ob die Ergebnisse, die wirmit solchen Zellen erzielen, auch re-levant für normale Zellen oder garfür Zellen im lebenden Organis-mus sind. Diese Frage stellt sichnicht, wenn man nach Mechanis-men in Tumorzellen oder gar, wieoben dargestellt, in metastasie-renden Tumorzellen sucht. Umge-kehrt sind in vielen Fällen solcheMechanismen nicht nur tumor-spezifisch sondern sind oft wich-tig in spezifischen Entwicklungs-stadien z. B. während der Em-bryogenese in vivo, im Tier. Diestrifft speziell auf den Met-Rezeptorzu, der während der Embryonal-entwicklung und im adulten Tier(und Mensch) in vielen Gewebenvorkommt und vielfältige Funktio-nen erfüllt. Braucht der Met-Re-zeptor auch in vivo CD44 v6 alsKorezeptor? Wie weiter oben be-schrieben, braucht der Met-Re-zeptor auf Tumorzellen als eineFunktion von CD44 v6 die „Prä-sentation“ seines Liganden (es gibt noch weitere Funktionen von CD44 v6 in der Met-Aktivierung,nämlich intrazellulär für die Sig-nalweiterleitung, auf die aber hiernicht weiter eingegangen wird. Derinteressierte Leser sei auf die Pub-likationen [4] und [5] verwiesen). Esist unwahrscheinlich, dass der Met-Rezeptor in vivo ganz neue Wegeseiner Aktivierung beschreitet. Aberwie kann man das nachweisen? Ei-ne Möglichkeit besteht darin, dasGen in vivo zu inaktivieren. Über ei-ne sehr aufwändige Technik wird anStelle des normalen Gens ein Genmit inaktivierenden Sequenzen indas Genom des Tieres (meistens ei-ner Maus) eingesetzt, die die Über-schreibung des Gens in ein Proteinunterdrückt. Mäuse haben, wieauch wir Menschen, in allen so-matischen Zellen zwei Kopien ei-nes Gens, man muss also beideGene inaktivieren und erhält danneine null-Maus für das entspre-chende Gen. In einer solchen null-Maus untersucht man dann, obEntwicklungs- oder Funktions-störungen auftreten. Wie erwartet traten in einer Met-null-Maus (und ebenso in einerMet-Liganden-null-Maus) massi-ve Störungen in verschiedenen Ge-weben während der Embryogene-se auf, die schließlich zum Tod derTiere zwischen Tag 12 und 16 derEmbryonalentwicklung führen. DieEmbryogenese in der Maus dauert19 Tage, die Met-null-Mutation istalso embryonal letal. Wenn für dieAktivierung des Met-Rezeptors invivo ebenfalls CD44 v6 notwendigist, sollte man erwarten, dass eineCD44-null-Maus ähnliche Ent-wicklungsstörungen wie die Met-null-Maus hat. Zu unserer großenÜberraschung ist dies nicht derFall. Solche CD44-null-Mäuse sindnicht in der Embryonalentwicklungbeeinträchtigt und haben währendihres Lebens nur einige nicht le-benswichtige Defekte, hauptsäch-lich im Immunsystem. Bedeutetdieser Befund nun, dass in vivo keine Kooperation von Met mit CD44 v6 notwendig ist? Es gibt ei-ne Reihe von Evidenzen, die dieseInterpretation unwahrscheinlichmachen, auf die hier der Einfach-heit halber aber nicht eingegan-gen werden kann. Nur ein Hauptar-gument sei erläutert: Man kannMäuse herstellen, in denen die In-aktivierung eines Gens nur in be-stimmten Geweben, z. B. in derHaut stattfindet. Solche Mäusegibt es auch für CD44. Im Unter-schied zu der „totalen“ null-Maushat eine solche Maus ausgepräg-te Veränderungen in der Haut. Wiekann man erklären, dass  eine to-tale null-Maus, in der ja auch keinCD44 in der Haut vorkommt, einenormale Haut entwickelt im Un-terschied zu der hautspezifischennull-Maus? Eine mögliche Er-klärung, die auch durch weitereEvidenzen erhärtet wird, ist fol-gende: Wenn CD44 vom Beginnder Embryonalentwicklung an fehlt,können seine Funktionen von an-deren Proteinen übernommen wer-den. Wenn allerdings die Embryo-nalentwicklung weiter fortge-schritten ist und erst zu diesemspäteren Zeitpunkt das Gen vonCD44 inaktiviert wird, kann keineSubstitution der Funktion mehrstattfinden. Dies ist der Fall bei derInaktivierung in der Haut. Diese In-aktivierung erfolgt erst in der Mit-te der Embryonalentwicklung, amTag 10 nach Befruchtung und da-her prägt sich der Verlust von CD44in diesen Mäusen in der Haut aus.Wir gehen mehrere Wege um die-se Hypothese, die weitreichendeKonsequenzen für das Verständnisder Plastizität unseres Genomshat, zu beweisen. Ein Weg ist dieIdentifizierung eine Substituentenfür die Korezeptorfunktion vonCD44 v6 für Met in der CD44-to-talen null-Maus. Obwohl es kein di-rekt verwandtes Gen zu CD44 immenschlichen oder murinen Ge-nom gibt, kennen wir eine Reihevon Proteinen, die zum Teil über-lappende Funktionen zu CD44 aus-üben könnten. Während ihrer Dok-torarbeit hat Frau Vivienne Olaku ei-nen Kandidaten für diese Substi-tution gefunden, der nun in denCD44-null-Mäusen als Substitu-ent geprüft wird. Ein anderer Weg,126(126)den Herr Thor Kastilan währendseiner Doktorarbeit beschritten hat,ist die Herstellung einer so ge-nannten „gefloxten“ Maus. Einesolche Maus trägt an Stelle desnormalen Gens ein Gen, bei demessentielle Abschnitte von zwei „IoxP“-Sequenzen (daher „gefloxt“)flankiert sind. loxP sind kurze DNS-Sequenzen, die von einem Enzymerkannt werden können, das danndas Ausschneiden der dazwischenliegenden DNA-Abschnitte bewirkt.Dadurch wird das Gen inaktiviert.Durch Aktivierung dieses Enzymszu verschiedenen Zeiten währendder Embryonalentwicklung oderspezifisch in verschiedenen Ge-weben, kann damit vom Experi-mentator beliebig die Geninakti-vierung gesteuert werden. HerrnKastilan sind die ersten entschei-denden Schritte zur Herstellungeiner solchen CD44-gefloxtenMaus gelungen, und wir hoffen, innaher Zukunft unsere Hypotheseder Substitution von CD44-Funk-tionen während der frühen Em-bryonalentwicklung und die Kore-zeptorfunktion von CD44 v6 fürden Met-Rezeptor in vivo beweisenzu können.127(127)[1] B.M. Tijink, J. Buter, R. de Bree,G. Giaccone, M.S. Lang, A. Staab,C.R. Leemans, G.A. van Dongen,(2006) A phase I dose escalationstudy with anti-CD44 v6 bivatuzumabmertansine in patients with incurablesquamous cell carcinoma of the headand neck or esophagus, Clin Cancer Res 12, 6064–6072[2] H. Ponta, V. Orian-Rousseau,L. Chen, H. Morrison, P. Herrlich,  (2002) Stop or Go – CD44 alsRegulator essentieller zellulärerEntscheidungen, Nachrichten ForschungszentrumKarlsruhe 34, 36–40[3] U. Günthert, M. Hofmann, W. Rudy,S. Reber, M. Zöller, I. Haußmann,S. Matzku, A. Wenzel, H. Ponta,P. Herrlich,  (1991) A new variant of glycoproteinCD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells, Cell 65, 13–24[4] V. Orian-Rousseau, L. Chen,J.P. Sleeman, P. Herrlich, H. Ponta, (2002) CD44 is required for twoconsecutive steps in HGF/c-Metsignaling, Genes Dev 16, 3074–3086[5] V. Orian-Rousseau, H. Morrison,A. Matzke, T. Kastilan, G. Pace,P. Herrlich, H. Ponta,  (2007) Hepatocyte Growth Factor-induced Ras ActivationRequires ERM Proteins Linked to Both CD44 v6 and F-Actin, Mol Biol Cell 18, 76-83Literatur

Von der Grundlagenforschung zur Entwicklung metastasenspezifischer Peptide

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