根据Ｋｉｍ－Ｒｅｅｓ模型［１］，固氮酶铁钼辅基（即ＦｅＭｏｃｏ或Ｍ簇），是由一个ＭｏＦｅ３Ｓ３簇和一个Ｆｅ４Ｓ３簇通过三个Ｓ－桥联接而成．然而，自Ｓｈａｈ等（１９７７）首次从结晶的钼铁蛋白中分离出具有生物重组活性的ＦｅＭｏｃｏ以来，固氮研究者们一直致..

张凤章

许良树

邱雪慧

黄河清

龙敏南

Xiamen University Institutional Repository

第 15 卷第 2 期1999 年 4 月中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Bio chemist ry and M olecular Biolo gyVo l. 15, No . 2Apr . , 1999·研究简报·* 　国家自然科学基金资助项目( 39470165)* * 联系人　T el : ( 0592) 2185360E-m ail : Lsxu@j ingxian. xmu. edu. cn张凤章,男, 1940年 8月生,副教授收稿日期: 1998-01-04,修回日期: 1998-04-30固氮酶铁钼辅基在分离纯化中结构变化的新证据*张凤章　黄河清　龙敏南　邱雪慧　许良树* *(厦门大学生物学系,厦门　361005)New Evidence for Structure Change of Iron-molybdenumCofactor from Nitrogenase MoFe-Protein in SeparationZHANG Feng zhang , HU AN Heqing, LONG M innan, Q IU Xuehui, XU Liang shu( Dep artment of B iology ,X iamen Univ ersity , X iamen　361005)Abstract　The iron-molybdenum cofactor ( FeMoco) of nit rog enase M oFe-protein f rom A z otobac-ter V inelandii OP was ext racted by N-methylformam ide ( NMF) . Effects o f FeMoco ( in NMF) onelect ronic spectr um and fluor escence intensity ( in 1 mol / L NaOH) w ere invest igated by fluo-ropho tometr ic t it rat ions and compar ed w ith results o f effects o f ( NH4 ) 2MoS4 and its complexesw ith Na2S, Na2S2 and ( NH4) 2SX on r elat ive propert ies o f FDMA . It was found that tit rat ion curvefo r quenching of FDMA w ith FeM oco w as very similar to that fo r quenching of FDMA w ith com-plexes of ( NH4) 2MoS4 and Na2S2 ( 1∶3, mo l/ mo l) . T he results show ed that FeM oco ( N) probablycontained S-S bonds and Its st ructure w as found to be a changing one.Key words　 Nitro genase, Ir on-molybdenum cofactor, F luoropho tometric t it rat ion, St ructuralchange　　根据 Kim-Rees 模型 [ 1] , 固氮酶铁钼辅基(即FeM oco 或 M 簇) , 是由一个 MoFe3S3 簇和一个Fe4S3 簇通过三个 S-桥联接而成. 然而,自 Shah 等( 1977)首次从结晶的钼铁蛋白中分离出具有生物重组活性的 FeMoco 以来,固氮研究者们一直致力于研究提取和分离纯化 FeM oco 的方法, 试图制备其结晶, 从而研究其结构与功能, 但至今未能成功.许多研究者测定的溶于 N -甲基甲酰胺( NM F)中的FeM oco (以下简称FeMoco( N) )的化学组成大都不一致[ 2] ,其主要原因可能是由于 FeM oco 极不稳定,特别是极端的氧敏感性,人们难以分离出完整的 M-簇.换句话说, FeM oco ( N )在化学组成和结构上与Kim-Rees模型所表达的不尽一致. FeM oco ( N)可能存在无机的 S-S 配基 [ 3] ;不同 pH 值的 NMF 可提取出单 Mo 或双 Mo 的 FeM oco ( N ) [ 4] ;在 NMF 溶液中, FeMoco 可能以二聚体或多聚体形式存在[ 5] .基于 FeMoco ( N)的结构类似于一些合成的化学模拟物[ 6] ; 以及合成模拟物大多数以 ( NH 4 ) 2MoS4,FeCl2及一些无机或有机硫化物为原料等实验事实,以 ( NH4 ) 2MoS4 , Na2S, Na2S2 , 和 ( NH4 ) 2SX 为参比物,研究 FeM oco( N)及这些硫化物对醋酸汞荧光素的电子光谱和荧光强度的影响, 获得了一些有关FeMoco( N )结构变化的新信息.1　材料与方法1. 1　试剂醋酸汞荧光素( FDMA ) , Aldrich 公司产品, 以0. 1 mol / L NaOH溶液配制.( NH4) 2MoS4按文献[ 7]方法合成; Na2S2 由等摩尔结晶 S 和 Na2S 混合并在真空下加热制备,Na2S和( NH 4) 2SX 为二级和三级试剂, NaOH 为一级试剂,其它试剂均为分析纯.1. 2　FeMoco的分离和硫化物浓度测定方法FeMoco( N)分离纯化按文献[ 3]方法进行, 采用示波极谱法和原子吸收分光光度法测定 Mo 和Fe 元素含量,其 Mo∶Fe 为 1∶6, FeM oco ( N )的摩尔浓度以其含钼量计算. 采用亚甲蓝形成法测定硫化物浓度.1. 3　荧光滴定方法参照文献[ 8]的方法,滴定反应在一系列带翻口橡皮塞的试管中进行, 所有试剂均抽气充氩.反应介质为 1 mo l/ L NaOH,反应终体积为 6 ml, 硫化物的浓度由 0. 05～3 mol / mol FDMA 递增. 以日立 850型荧光分光光度计分别测量各管的荧光强度,激发光波长 499 nm ,发射光波长 520 nm ,以荧光淬灭度( % )对[硫化物] / [ FDMA ]摩尔比作图.比较荧光滴定曲线的特征,推断 FeMoco ( N)的化学组成.1. 4　电子光谱测定采用日立 UV240型紫外可见分光光度计记录FDMA (在 1 mo l/ NaOH 中)的电子光谱以及在不同硫化物和 FeM oco ( N)存在下的 FDMA 的电子光谱.2　结　　果2. 1　FeMoco(N)及不同无机硫化物对FDMA电子光谱的影响Fig. 1　Ef fect of some com pounds contain ing sul fur on absorp-t ion spectr um of FDMA in 1 m ol/ L NaOH1: 5×10- 6mol/ L FDM A;2: 4. 2×10- 5mol/ L FeM oco;3: 5×10- 6mol/ L FDM A+ 1. 8×10- 6mol/ L FeMoco;4: 5×10- 6mol/ L FDM A+ 1. 5×10- 6mol/ L ( NH4) 2 MoS4FDMA 在 1 mol/ L NaOH 溶液中的电子光谱( F ig . 1 曲线 1)有一特征吸收峰 ( 499 nm 处) , 而FeM oco ( N)的吸收光谱除在 554 nm 和 565 nm 处有两个小的吸收峰外,在 400～600 nm 光区几乎是一条平滑的曲线( Fig . 1 曲线 2) . 将 FeM oco ( N)( 1. 8×10- 6mo l/ L )加到FDMA溶液( 5×10- 6mo l/L )中,则混合物的吸收光谱在 482 nm 处有最大吸收峰( Fig . 1曲线 3) , 说明两者发生了某种结合作用, 致使 FDMA 碱溶液的特征吸收峰紫移了 17nm .( NH44 ) 2MoS4的水溶液( 1 mol/ L NaOH)的吸收光谱有一特征吸收峰在 468 nm 处, 当 5×10- 6mol/ L ( NH4 ) 2MoS4与等浓度 FDMA 混合时,其混合物的吸收光谱的特征吸收峰亦位移至 482 nm 处( Fig1 曲线 4) . Na2S, Na2S2 , ( NH4 ) 2SX 及它们与( NH4) 2MoS4的混合物均有类似的作用( Fig . 1中未示出) . Na2S2O 4的作用则相反, 使 FDMA 溶液的吸收光谱特征吸收峰红移至 502 nm 处( Na2S2O 4水溶液的特征吸收峰在 315 nm ) , 这说明 FeM oco ( N)引起的 FDMA 溶液吸收光谱特征峰的紫移主要是FeMoco( N )对 FDMA 作用的结果.2. 2　FeMoco(N)对 FDMA碱溶液荧光强度的影响以 FeM oco ( N)滴定 FDMA 碱溶液, 得滴定曲线 Fig . 2. 从 Fig . 2中可见, 曲线是非线性的,“等当点”的摩尔比约为 0. 2. 这个结果与 Syrtso va 等[ 8]以0. 05 mol / L 磷酸盐缓冲液( pH7. 0)为反应介质所得的结果不同, 虽然曲线形状相似,但后者的滴定曲线没有明显的“等当点”.Fig. 2　T it ration curve for quench ing of FDMA w ith FeMoco考虑到 FeM oco( N)中含有的 Na2S2O 4 ,可能干扰其荧光滴定, 因此以提取 FeM oco 的溶剂 NMF(含5 mmol / L Na2S2O 4和磷酸盐等)滴定FDMA 作为空白对照,以消除 Na2S2O4 对滴定的影响.Na2S2O 4对 FDMA 的滴定,在 1 mol / L NaOH介质中进行时, 其荧光淬灭度随[ Na2S2O 4 ] / [ FD-MA ]比的增大, 几乎保持在 5%的水平上. 而在pH7. 0的磷酸盐缓冲液中滴定,其滴定曲线几乎与FeMoco ( N )的滴定曲线相似, 严重干扰 FeM oco329第 2 期 张凤章等:固氮酶铁钼辅基在分离纯化中结构变化的新证据 　( N)的荧光滴定. 因此以 1 mo l/ L NaOH 溶液为滴定反应介质比较适合.另一方面,考虑到 FeMoco ( N)中可能含有 S-S键,而 S-S 键在中性或弱碱性介质中会分解而释放出单质 S,采用 1 mo l/ LNaOH 为反应介质防止可能的分解反应发生.2. 3　不同无机硫化物对 FDMA荧光强度的影响以( NH4) 2MoS4、Na2S、N a2S2、( N H4) 2SX 的水溶液分别滴定 FDMA, 获得不同的荧光滴定曲线( F ig. 3 及 Fig . 5 曲 线 1 ) . 从 图 中 可 见, 用( NH4 ) 2MoS4和 Na2S 滴定所得的曲线均呈现双线性曲线,其“等当点”的摩尔比为 0. 46和 2. 2; 前者与 Syr tsova 等的结果相似, 后者则明显不同. 而Na2S2 和( NH4) 2SX 的滴定曲线均为非线性曲线(见Fig . 3曲线 2和 3) , 其荧光淬灭的最大值在摩尔比为 1附近.Fig. 3　Tit rat ion cu rves for qu enching of FDMA w ith differentcom pounds contat ining sul fu r×—× Na2S;　●—● Na2S 2;　○—○ ( NH4) 2S XFig. 4　 T it ration curves for quen ching of FDMA w ithMoS 2-4 plus Na2ST he mole rat io of MoS 2-4 and Na2:●—● 1∶2;▲—▲ 1∶3; ○—○ 1∶42. 4　不同摩尔比的(NH4 ) 2MoS4与其它硫化物的混合物对 FDMA 荧光强度的影响将 ( NH4 ) 2MoS4 水溶 液与 Na2S, Na2S2 或( NH4) 2SX 的水溶液按溶质的不同摩尔比混合,以混合物滴定 FDMA,获得一系列滴定曲线(见 Fig . 4～Fig. 6) . 比较这些曲线的特征, 可以看出与 FeM oco(N )的荧光滴定曲线特征最为相似的曲线为 Fig. 5中的曲线 3.这可能意味着 FeM oco ( N )的化学组成为 MoFe6S10.Fig. 5　 Ti trat ion curves for quench ing of FDMA w ithMoS2-4 plus Na2S 2Th e mole rat io of M oS2-4 and Na2S 2:●—● 1∶0;○—○ 1∶2;×—× 1∶3; △—△1∶4Fig. 6　 Ti trat ion curves for quench ing of FDMA w ithMoS2-4 plus ( NH4) 2SXTh e mole rat io of M oS2-4 and ( NH4) 2S X :○—○ 1∶1; ●—● 1∶23　讨　　论有证据表明, FeMoco ( N)在有机汞化合物的作用下, Fe-S 键会发生断裂, 而断裂后的 S 原子会与330 中国生物化学与分子生物学报 15 卷FDMA 的汞共价结合[ 9] ;二硫化物也能发生不同情形的裂解.不同的硫化物具有不同形状特征的荧光滴定曲线 [ 8] . 这是用荧光滴定方法分析各种硫化物及其铁硫化合物( FeMoco )的依据. 这种共价结合也使 FDMA 溶液的电子光谱发生位移. 因此, 采用MoS2-4 与 S2- 或 S2-2 和 S2-X 等组成的混合体系, 进行模拟荧光滴定, 从而可以间接推断出 FeM oco ( N)的化学组成.FeM oco ( N)用 O 2氧化会释放出 MoOS2-3 , 在Na2S2O 4存在下, M oOS2-3 会被还原为 MoS2-4[ 10] ,说明 FeM oco( N)含有 MoS3的结构单元, 故当 FDMA作用于 FeM oco, Fe-S 键发生断裂时,会产生 MoS3,而在 Na2S2O 4 存在下, MoS3可能转化为 MoS2-4 ,而MoS2-4 与 FDMA 结合又能使荧光淬灭, 因此, 用MoS2-4 和 Na2S2或 Na2SX 组合物滴定 FDMA, 其滴定曲线的形状特征接近 FeM oco( N )的滴定曲线.这样 FeM oco( N)的化学组成应是 MoFe6S9.FeS 的NMF 溶液的吸收光谱在 565 nm 和 554nm 处亦有两个小吸收峰, 可以认为 FeMoco ( N )脱去一个 Fe2+,而在 Na2S2O 4存在下, Fe2+与 S2-结合成为 FeS.在 NMF 溶液中, FeM oco 可能以二聚体或多聚体的形式存在 [ 5] ; 用 pH12的 NMF 提取的FeM oco 是具有生物重组活性的含双钼的 FeMoco,其元素组成为 Mo2Fe12S12[ 4]. 种种迹象表明, FeMo-co 分离出来以后,其结构发生了变化,它可能含有S-S 配基或多 S 配基, 这种变化有利于多聚体的形成, 因而能保持新构型的稳定. 在生物重组时,FeM oco ( N)可能在缺辅基的 UW45固氮酶的协调下,又重新“组装”成 K-R 模型所示的那种结构,从而表现出固氮活性, 而这种作用可能需要 ATP 的协同作用.References1　Kim J, Rees D C . 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固氮酶铁钼辅基在分离纯化中结构变化的新证据

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