选用基质辅助激光解吸电离化飞行时间(MALDI-TOF)质谱技术研究蓝斑背肛海兔侧膜神经节与腹部之间神经连索外表层的多肽组成和分布.采用比对法和Paws软件分析多肽序列和酶解位点,发现该神经连索表层含有丰富的酸性多肽(AP)的酶解产物,其酶解过程由AP的C到N端.表明海兔中枢神经系统外表层不仅含有丰富的多肽种类,而且还参与信号传导等调控作用

吴韩志

王磊

翁鹭娜

黄慧英

黄河清

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收稿日期: 2006- 10- 16  修回日期: 2007- 01- 12基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30470372);福建省自然科学基金资助项目 ( C031006 );厦门大学预研基金资助项目 ( xdk jcx20061026、xdk jcx20051006 ).作者简介:吴韩志 ( 1976- ) ,男,硕士.研究方向:蛋白质结构与功能.* 通讯作者:黄河清 ( 1956- ) ,男,教授,博士生导师.研究方向:蛋白质结构与功能. Em ai:l hqhu ang@ xm u. edu. cn.质谱技术研究蓝斑背肛海兔胸膜神经节连索外表层多肽组成与分布吴韩志, 王  磊, 翁鹭娜, 黄慧英, 黄河清*(厦门大学生命科学学院分析测试中心;厦门大学化学生物学福建省重点实验室, 福建 厦门 361005 )摘要: 选用基质辅助激光解吸电离化飞行时间 (MALDI-TOF )质谱技术研究蓝斑背肛海兔侧膜神经节与腹部之间神经连索外表层的多肽组成和分布.采用比对法和 Paw s软件分析多肽序列和酶解位点, 发现该神经连索表层含有丰富的酸性多肽( AP )的酶解产物,其酶解过程由 AP的 C到 N端. 表明海兔中枢神经系统外表层不仅含有丰富的多肽种类, 而且还参与信号传导等调控作用.关键词: 海兔; 神经连索; 神经多肽; 质谱中图分类号: Q503 文献标识码: A 文章编号: 1671-5470( 2007) 01-0064-04Peptide composition and distribution on the outside connection surface ofp leural ganglion from Ap lysia w ith techniques ofm ass spectrom etryWU Hang-zh,i WANG Le,i WENG Lu-na, HUANG Hu-i y ing, HUANG H e-qing( The Cente r o f Ana lys is and Testing, Schoo l o f L ife Sc ience; Key Lab. o f Chem ica lB io logy o f Fu jian P rov ince, X iam en Un iversity, X iam en, Fujian 361005, Ch ina)Abstrac t: The peptide com pos ition and distr ibution on the outside sur face o f neura l connec tion betw een pleural gang lion and abdo-m en w ere stud ied by m atrix- assisted lase r desorption ion ization / time o f flight ( MALDI-TOF ) m ass spectrom etry. W ith comparedm ethods, paw s so ftwa re, abundant enzym o lysis produces of ac id ic peptide ( AP) and enzym o lys is sites w ere found. The resu lt sug-gests that the produces occur from the N to C end o fAP. It is indica ted that the outside connection surface of cen tra l neura l systemfrom theAp ly sia has abundant peptide kinds and these peptides p lay an importan t role in them odu la tion o f signa l transporta tion.K ey words: Ap ly sia; neura l connective; neuropeptide; mass spectrom e try海兔 (Ap lysia)隶属于软体动物门腹足纲后腮亚纲侧循目海兔科, 主要分布在热带及亚热带的浅海海域.海兔中枢神经系统 ( cen tra l nervous system, CNS)结构简单, 易于分离和进行细胞定位等研究. 海兔的CNS由口腔神经节 ( buccal gang lion, BG)、大脑神经节 ( cerebral gang lion, CG)、胸膜与足部神经节 ( pleu-ra l/pedal gang lion, PLG /PDG)、腹部神经节 ( abdom ina l gang lion, AG)和复杂的神经连索组成, 其中大脑和口腔神经节外表均含有丰富的多肽组成[ 1 - 2]. 前人[ 3- 5]曾采用基质辅助激光解吸电离化飞行时间 (m atrix-assisted laser desorp tion ion izat ion / tim e of fligh,t MALD I-TOF)质谱技术研究海兔 CNS多肽组成与分布过程中,分别发现酸性多肽 ( ac id ic pept ide, AP)、酶解产物和内切酶. 位于胸膜和腹部神经节之间的神经连索( pleura-l abdom ina l connect ive, PAC)内也含有 AP. 高效液相色谱和 MALD I-TOF质谱非在线联用技术初步证实了海兔 BG和 CG中含有 Leu-Leu多肽酶, 并能酶解 AP中的 Leu-Leu酰胺键, 形成不同的酶解产物[ 5- 7].本试验采用 MALDI-TOF质谱技术对蓝斑背肛海兔 (N otarcus leachii cirrosus S timpson, NLCS)侧膜神经节与肌肉连索外表面多肽组成与分布情况进行了研究,其分析技术和研究结果将有助于了解 CNS和肌肉之间的信号传递、信号中止以及相关生理过程.目前,还没有将这种方法用于海兔神经连索研究的报道.福建农林大学学报 (自然科学版 ) 第 36卷 第 1期Journa l of Fujian Agriculture and Forestry Un iversity ( Na tura l Sc ience Ed ition) 2007年 1月1 材料与方法1. 1 材料NLCS捕获于厦门岛东部近海区域.试验所需的海兔净重均控制在 250 g内.分离神经连索之前, 海兔饲养在 14 e 人工海水中.基质 2, 5-d ihydroxybenzo ic acid ( DHB )购置于美国 ICN生物医学公司.1. 2 神经连索分离随机选取海兔 10- 15只,分别称量其体重,按照 1 g折算成 1 mL的方式, 向其体内注射体重一半的M gC l2 ( 390mmo l# L- 1). 待数分钟海兔麻醉后,迅速解剖,分离出 PLG与肌肉之间的连索, 剪取 5 cm左右的一段,剔除连索表面残留组织,随后置于人工海水中备用.1. 3 PLG与腹部肌肉神经连索表面多肽组分的萃取已分离的神经连索置于小离心管中,每管放置 3- 5根,保持连索 2端截断面露于管外 (防止连索内部多肽成分从断口释放于萃取液中 ).选用 0. 025 mo l# L- 1T ris-HCL缓冲液 ( pH 7. 0)清洗连索中部 2- 3次后,将中部浸泡于 100 LL提取液 (水与乙腈的体积比为 1B1)中萃取表面多肽组分.在室温下萃取 2 h后取出神经连索.将萃取液于 12500 r# m in- 1离心 5m in,收集上清液备用.1. 4 基质和样品配置将适量 DHB干粉与二次重蒸水混合, 涡旋振荡 30 m in或者超声波溶解 10m in, 使 DHB充分溶解,最终配制成饱和水溶液.上样前将神经连索表面多肽萃取液与基质溶液按体积比为 1B1预先混匀 60 s, 然后取 0. 8- 1. 0 LL上样于质谱专用样品靶.混和液自然干燥后,即可把样品靶置入质谱仪靶室内开始测量.1. 5 质谱测定条件采用德国 BRUKER公司生产的 REFLEX Ó 型 MALD I-T OF质谱仪.以脉冲氮激光 ( 337 nm )作为离子解吸电离源.为提高灵敏度, 降低噪音干扰,分析模型选用高分辨率反射模型, 加速电压控制在 20 kV.测定分子质量范围设定为 < 6000 u,平均每次测定样品的激光脉冲次数在 25 - 30次.检测结束后使用质谱仪配套软件以外标法标定多肽质谱峰峰位.2 结果与分析采用合理萃取神经连索管表层多肽的方法是阻止连索管内的多肽和蛋白质释放于介质中,获得准确测定结果的有效手段之一. 尽管萃取后的神经连索外表层多肽含量可能处于纳摩尔级, 但仍然可采用MALD I-TOF质谱技术分析多肽组成与结构,并获得神经连索管表层多肽组成与分布信息.利用 Paw s软件对所获得的多肽质谱数据进行逐一分析与比对,发现其中部分多肽组成和结构与近期发现的 AP、大脑多肽 1( CP1)、大脑多肽 2( CP2)、神经肽等组成极为相似,进而推测这些多肽参与信号传导.2. 1 AP和 CP1的酶解产物参比已获得的侧膜神经节与腹部之间神经连索外表层的多肽质谱图 (略 ), 通过比对法和 Paw s软件分析后,其结果总结于表 1、2. 从表 1、2可以看出, AP与 CP1的酶解片段的酶解方式有一定的相似性,推测神经连索表层不仅含有丰富的多肽内切酶, 而且该酶能同时对 AP和 CP1进行酶解, 从而产生相似酶切位点的多肽产物,这一现象与近期林庆梅等[ 5]报道的海兔大脑神经节中含有酶解 L-R (氨基酸残基 )多肽内切酶的试验结果极为相似.酶解 AP和 CP1的多肽内切酶分布于海兔 CNS各区域, 主要功能是提供酶解产物, 以满足 CNS执行信号传导作用的需求.从表 1、2还可以看出, 神经连索表层不仅含有丰富的 AP酶解产物, 而且其中多数产物序列均属于Leu-Leu键裂解的产物,因而可以认为 AP的 Leu-Leu键易被酶解.进一步分析表 1结果可以发现, AP酶解产物中占 50%多肽短肽均以 Leu残基作为末端,说明 Leu-R( R代表除 Leu以外的其他氨基酸残基 )键键能小,易受水解酶、物理、化学等因素影响而断裂[ 6- 7]. AP降解产物的形成可能受多种内切酶协同作用,其主要起因在于: ( 1)亮氨酸内切酶特异性作用于 Leu-Leu键; ( 2)一些其他种类的内切酶则作用于 Leu-R键.这样就产生了大量以 Leu残基作为末端的片段产物. 在 CP1片段中也存在着 Ser-Ser酰胺键,具有较高的键能. CP1的酶切片段中以 Leu和 Ser残基为酶解位点的数目较多,这说明多肽内切酶起着调控 CP1功65 第 1期 吴韩志等: 质谱技术研究蓝斑背肛海兔胸膜神经节连索外表层多肽组成与分布能的重要作用.根据 AP序列, 其一级结构的 N端具有 Ser-Ser酰胺键,推测它对酸性多肽 C端 Leu-Leu酰胺键产生易酶解的影响,而使 N端的 Leu-Leu酰胺键趋于稳定, 不易发生酶解. 显然, 酶切位点与 AP的Leu-Leu酰胺键位点有关,即与 AP分子结构有关.表 1 PLG与腹部肌肉神经连索外表层 AP酶节碎片Tab le 1 AP segm en ts on th e su rface of connect ive b etw eenPLG and abdom enm uscleAP序列: SSGVSLLTSNKDEEQRELLKA ISNLLD 测量值 /u 理论值 /u 一级结构1113. 57 ( 1 ) 1113. 52 ELLKAISNLL1228. 55 ( 1 ) 1228. 56 EEQRELLKAI( 2 ) 1228. 62 ELLKAISNLLD1413. 82 ( 1 ) 1413. 82 EQRELLKA ISNL1574. 21 ( 1 ) 1574. 90 LLTSNKDEEQREL( 2 ) 1574. 90 LTSNKDEEQRELL1688. 14 ( 1 ) 1688. 08 LLTSNKDEEQRELL1879. 09 ( 1 ) 1879. 21 SSGVSLLTSNKDEEQRE2304. 68 ( 1 ) 2304. 85 SSGVSLLTSNKDEEQRELLKA2645. 50 ( 1 ) 2645. 33 SGVSLLTSNKDEEQRELLKAISNL2845. 32 ( 1 ) 2845. 60 SSGVSLLTSNKDEEQRELLKAISNLL表 2 PLG与腹部肌肉神经连索外表层 CP1片段Tab le 2 CP1 segm en ts on th e su rface of connect ive b etw eenPLG and abdom enm uscleCP1序列: FSGLMSEGSSLEA测量值 /u 理论值 /u 一级结构680. 27 ( 1 ) 679. 84 SGLMSEG( 2 ) 679. 84 GLMSEGS709. 49 ( 1 ) 709. 86 LMSEGSS( 2 ) 709. 86 M SEGSSL778. 76 ( 1 ) 778. 87 SEGSSLEA827. 54 ( 1 ) 827. 03 FSGLMSEG854. 20 ( 1 ) 854. 02 SGLMSEGSS880. 57 ( 1 ) 880. 11 GLMSEGSSL914. 62 ( 1 ) 914. 12 FSGLMSEGS1079. 73 ( 1 ) 1080. 33 GLMSEGSSLEA1113. 83 ( 1 ) 1114. 39 FSGLMSEGSSL  作为一种信息传递物质,神经多肽必然要经历在特定细胞的合成与释放,与靶细胞受体的识别与相互作用,并引发一系列生理生化反应,最终降解失活的过程.在此之前, M orish ita et al[ 8]研究了加州海兔心脏兴奋多肽 ( card ioexc ita tory pep tide)的膜催化降解过程,发现其首要的步骤就是羧基端的脱酰胺作用, 该反应由一种脱酰胺酶来完成.在海兔体内这种由酶催化的 C末端脱酰胺作用可能存在着一定的普遍性,即AP的降解也由此开始. 结合上述 Ser-Ser对 N末端起稳定作用的推论,说明 AP酶解过程的一种可能形式是从 C端开始, 由亮氨酸内切酶等多种内切酶催化,作用位点集中于 3对 Leu-Leu键附近, 形成以 Leu残基为末端的片段产物.而对于上述内切酶的具体定位目前仍需要进一步的试验.2. 2 CP2酶解产物表 3 PLG与腹部肌肉神经连索外表层 CP2片段Table 3 CP2 segm en ts on the surface of conn ective betw een PLG and abdom enm uscleCP2序列: FDFGFAGLDTYDA IHRALEQPARGTSNSGSGYNMLMKMQRH测量值 /u 理论值 /u 一级结构1865. 02 ( 1) 1865. 20 RALEQPARGTSNSGSGYN1968. 02 ( 1) 1967. 35 DA IHRALEQPARGTSNSGS2116. 36 ( 1) 2115. 51 DTYDA IHRALEQPARGTSN( 2) 2115. 50 IHRALEQPARGTSNSGSGYN2491. 48 ( 1) 2491. 14 IHRALEQPARGTSNSGSGYNMLM2645. 50 ( 1) 2645. 17 AGLDTYDA IHRALEQPARGTSNSGSG2680. 37 ( 1) 2680. 20 LDTYDAIHRALEQPARGTSNSGSGY( 2) 2681. 14 DTYDA IHRALEQPARGTSNSGSGYN2710. 31 ( 1) 2709. 31 YDA IHRALEQPARGTSNSGSGYNML3370. 96 ( 1) 3371. 13 GFAGLDTYDA IHRALEQPARGTSNSGSGYNML3600. 58 ( 1) 3600. 49 DTYDA IHRALEQPARGTSNSGSGYNMLMKMQR3630. 45 ( 1) 3630. 53 GFAGLDTYDA IHRALEQPARGTSNSGSGYNMLMK3777. 08 ( 1) 3777. 72 FGFAGLDTYDAIHRALEQPARGTSNSGSGYNMLMK  CP2的一级结构与 AP和 CP1不同之处在于 Leu和 Ser位点较少, 因而酶解产物不同于 AP和 CP1的酶解产物.从表 3可以看出, CP2的酶切片段普遍较长, 酶切位点多样化,而且酶切片段多位于整条肽链的中段.另外,最小的酶切片段含有 18个氨基酸残基,估计此时酶切即告终止.因此,作者认为在海兔 CNS内,对于此类神经活性多肽,其实现调控功能之后,通过酶切终止时,是按照以下原理来进行的: ( 1)酶解从多肽的 N端和 C端同时进行; ( 2)每次酶切数在 1-3个氨基酸残基之间; ( 3)酶切过程在多肽活性丧失时, 即告终止; ( 4)此类多肽的活性部位很可能位于多肽的两端处.这一发现有助于对此类多肽活动机理有更深层次的了解,可以针对它们的特性作更深入的研究.66 福建农林大学学报 (自然科学版 ) 第 36卷  2. 3 神经肽酶解特性表 4 PLG与腹部肌肉神经连索外表层神经肽片段Tab le 4 Neu rop ept ide segm en ts on th e su rface ofconnect ive b etw een PLG and abdom enm uscle神经肽序列: FLFQPQRF测量值 /u 理论值 /u 一级结构   778. 76 ( 1) 778. 99 FLFQPQ632. 15 ( 1) 631. 80 LFQPQ  神经肽是一种在神经系统中广泛存在的活性肽,由于其氨基酸组成少,分子质量较小,因此只要有一个小段的氨基酸残基缺失即可影响到神经肽在体内的活性.在质谱分析的结果中发现,神经肽显然酶解的片段比较少.从表 4可以看到,只要是 N端或 C端缺失 1 - 2个氨基酸残基,神经肽的构象就改变了, 功能就被抑制了,可以猜测其活性已极大地降低或者完全消失了. 若把神经肽比作长肽的一个活性中心的话,这一结果也从另一个角度说明了, 多肽的活性中心氨基酸残基成分的微小改变, 即可影响到整个功能的实现.通过以上的分析可以看出,在 PLG与腹部肌肉神经连索的外表面存在着大量与多肽片段相同的组分.由于试验中这些数据存在着一定的重复性,所以可以推测这些多肽片段极有可能是上述神经多肽类物质的合成中间物或降解产物.以往的研究已经证实,上述 4种多肽在海兔 CNS的信息传导过程中起着重要的作用[ 9- 11],但对于存在于连索表面的多肽的研究报道较少.从这些多肽片段的信息可以了解它们在信号传导中的一些特性,及它们在神经连索表层的性质及表现,为深入了解神经活性多肽提供了帮助.参考文献[ 1] RUBAKH IN S S, GARDEN R W, FULLER R R, et a.l M easuring the peptides in ind iv idua l organe llesw ith mass spectrom etry[ J]. 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质谱技术研究蓝斑背肛海兔胸膜神经节连索外表层多肽组成与分布

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/54038/%e8%b4%a8%e8%b0%b1%e6%8a%80%e6%9c%af%e7%a0%94%e7%a9%b6%e8%93%9d%e6%96%91%e8%83%8c%e8%82%9b%e6%b5%b7%e5%85%94%e8%83%b8%e8%86%9c%e7%a5%9e%e7%bb%8f%e8%8a%82%e8%bf%9e%e7%b4%a2%e5%a4%96%e8%a1%a8%e5%b1%82%e5%a4%9a%e8%82%bd%e7%bb%84%e6%88%90%e4%b8%8e%e5%88%86%e5%b8%83.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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