采用双向凝胶电泳技术优化分离蓝斑背肛海兔(Notarcus leachii cirrosusStimpson,NLCS)口腔神经节(Buccal Ganglion,BG)蛋白质组,并获得约300个蛋白质斑点.用组合基质辅助激光解吸电离化飞行时间(MALD I-TOF)质谱技术和胶内酶解技术测定BG蛋白质组中的96个蛋白质斑点的肽指纹(Peptide m ass fin-gerprint,PMF)图谱.经数据库检索与比对后,发现96种蛋白质中仅有4种蛋白质可获得较高的匹配率,它们分别是微管蛋白(Tubu lin)、肌动蛋白(Actin)和两个1,5-二磷酸核酮糖-羧化酶/加氧酶(R ibu lose-1,5-b i-sphosphate carboxylase/oxygenase,R ibu lose),均属于神经细胞骨架蛋白质;同时还发现一种交配信号肽前体(Peptide m ating pheromone precursor).利用LOC trees软件和分类法对56种蛋白质进行亚细胞定位与分类

吴韩志

蔡宗苇

陈东仕

黄河清

Xiamen University Institutional Repository

Vo.l 27 高 等 学 校 化 学 学 报 No. 72 0 0 6 年 7月 CHEM ICAL JOURNAL OF CH INESE UN IVERSIT IE S 1257 ~ 1261优化分离与鉴定蓝斑背肛海兔口腔神经节蛋白质组陈东仕1, 黄河清1, 2, 3, 吴韩志1, 3, 蔡宗苇3, 4( 1. 厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,2. 近海海洋科学国家重点实验室, 3. 固体表面物理化学国家重点实验室, 厦门 361005;4. 香港浸会大学化学系, 香港 )摘要 采用双向凝胶电泳技术优化分离蓝斑背肛海兔 (N otarcus leachii cirro sus S tim pson, NLCS)口腔神经节( Bucca l Gang lion, BG )蛋白质组, 并获得约 300个蛋白质斑点. 用组合基质辅助激光解吸电离化飞行时间( MALD I-TOF )质谱技术和胶内酶解技术测定 BG蛋白质组中的 96个蛋白质斑点的肽指纹 ( P eptide m ass fin-gerprin,t PM F )图谱. 经数据库检索与比对后, 发现 96种蛋白质中仅有 4种蛋白质可获得较高的匹配率, 它们分别是微管蛋白 ( Tubu lin)、肌动蛋白 ( Actin)和两个 1, 5-二磷酸核酮糖-羧化酶 /加氧酶 ( R ibu lose-1, 5-b-ispho sphate carboxy lase / oxygenase, R ibulose), 均属于神经细胞骨架蛋白质; 同时还发现一种交配信号肽前体( P eptide m ating phe romone precurso r) . 利用 LOC trees软件和分类法对 56种蛋白质进行亚细胞定位与分类.关键词 海兔; 口腔神经节; 蛋白质组; 双向凝胶电泳; 质谱中图分类号 Q51 文献标识码 A 文章编号 0251-0790( 2006) 07-1257-05收稿日期: 2005-06-13.基金项目: 国家自然科学基金 (批准号: 40276033, 30470372)和福建省自然科学基金 (批准号: C031006)资助.联系人简介: 黄河清 ( 1956年出生 ), 男, 教授, 博士生导师, 从事蛋白质结构与功能研究. E-ma i:l hqhuang@ xm u. edu. cn海兔中枢神经系统 ( Centra lNervous System, CNS)是神经科学研究的经典模型之一. 在自然界中,多数海兔 CNS主要由口腔神经节 ( Bucca lGang lion, BG)、大脑神经节 ( CerebralG ang lion, CG)、胸膜与足部神经节 ( P leura-lPedalG ang lion, PLG /PDG)及腹神经节 ( Abdom ina l Gang lion, AG )等组成[ 1], 但厦门 NLCS却缺少 AG[ 2]. BG主要的生理功能是通过神经系统的信号回流产生一系列反馈活动, 其中包括口腔肌肉运动, 舌头伸缩, 调控食道蠕动以及嗉囊收缩等生理功能[ 3].近期, Nargeo t等[ 4]采用电生理技术研究 BG神经节 B52神经元活性水平与舌头伸缩运动的关系.H umm on等[ 5]和 H uang等[ 6]陆续发现了 BG含有 Leu-Leu多肽内切酶. 海兔属于雌雄同体的软体动物,它所分泌的多肽吸引素的作用主要用于召唤海兔聚集与交配. 口腔是接受和发射吸引素的器官, 它具有识别流动海水中超微量吸引素的功能. 有关吸引素的组成、结构与功能的研究是目前开展神经多肽研究的热点课题之一[ 7, 8]. 许多神经科学工作者曾分别采用毛细管电泳、生物质谱、免疫标记等分析技术研究海兔神经多肽的理化特性, 但有关海兔神经蛋白组的组成与结构尚未阐明, 其主要原因在于缺乏有效分离海兔 CNS蛋白质组的方法[ 9, 10].本文选用厦门 NLCS的 BG为研究材料, 采用双向凝胶电泳技术优化分离 NLCS的 BG蛋白质组,并采用 MALDI-TOF质谱和数据库检索技术初步鉴定 BG中部分蛋白质的组成与功能, 其实验结果和分析技术可为今后深入开展海兔 CNS蛋白质组的组成、结构与功能奠定良好的基础, 尤其在学习和记忆机理方面.相关的研究在国内外尚未见详细报道.1 实验部分1. 1 仪器与试剂双向电泳仪 ( G enom ic so lut ions); DYCZ-24B型垂直电泳槽 (北京六一仪器厂 ) ; REFLEXⅢ型MALD I-TOF质谱仪 (德国 B ruker公司 ) ; 超速冷冻离心机 ( Beckm an, 美国 ) ; 真空浓缩离心机 ( Labcon-co) ; Invest igator HT Database图像分析软件 ( G enom ic So lu tions) .丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷 ( T ris)、二硫苏糖醇 (DTT)、超纯尿素 (U rea)、四甲基乙二胺 ( TEMED )、过硫酸铵 ( APS)、硫脲、甘氨酸、十二烷基磺酸钠 ( SDS)、NON IDETP- 40( NP-40)及 CHAPS均购置于上海生物工程公司; 载体两性电介质 ( pH = 3~ 9, pH = 5~ 8, pH = 4~ 6)购自北京军事医学科学院; 胰蛋白酶 (V 5111)购自 Prom ega公司; SDS标准购自 Ferm entas公司; -氰-4-羟肉桂酸 (H CCA )购自美国 ICN生物医学公司.1. 2 样品制备蓝斑背肛海兔 (NLCS)捕获于福建省厦门市内海浅滩区域. 每只 NLCS净重在 80~ 200 g之间, 采集后置于 14 海水培养箱内人工养殖数天. 取 30只 NLCS置于 14 海水中, 按每只 NLCS体重注入等体积的氯化镁溶液 ( 28 mm o l/L ) . 待 NLCS组织软化后, 迅速在解剖镜下, 分离 NLCS的 BG, 并用蒸馏水清洗 BG 3次, 以清除其表面盐分和杂质, 收集于 0 5 mL的离心管中, 置于 4 冰浴中. 加入300 L裂解液 [ 8 m o l/L尿素、40 mm o l/L Tris、2 m o l/L硫脲、质量分数为 4%的 CHAPS、10 mm o l/LDTT、1 mm o l/L EDTA ( pH约为 7 4) ], 采用超声破碎技术振荡破碎 10 m in, 收集破碎液置于 4 冰箱中约 24 h, 使 BG细胞最大量地释放内含物. 将所收集的 BG内含物置于冷冻离心机内, 以 35 000 r /m in速度离心 45 m in. 去除离心液上层的大量脂类化合物, 分离提取离心液中间层的透明澄清蛋白质样品, 即为 BG蛋白质组提取液, 进行双向凝胶电泳分离.BG蛋白质含量测定按常规的考马斯亮蓝法分析, 标准蛋白质选择纯度为 99%的牛血清白蛋白,检测波长为 595 nm.1. 3 双向凝胶电泳按照 1 10 g超纯尿素 + 394 L双蒸水 + 400 L质量分数为 10%的 NP- 40+ 266 L单体储液 (质量分数为 29 1%的丙烯酰胺 /0 9%甲叉丙烯酰胺 ) + 100 L载体两性电解质 + 4 L TEMED + 2 L质量分数为 10% 的 APS的配方配置 2 mL凝胶液. 将凝胶液灌入孔径为 0 7 mm的玻璃管中, 制成150 mm 0 7 mm的柱状胶条. 在上样之前, 先加 15 L的样品裂解液进行预电泳: ( 1 ) 200 V, 15m in; ( 2) 300 V, 30 m in; ( 3) 400 V, 60 m in. 然后, 将柱中的裂解液抽出, 换上样品液, 在电压为 400V的条件下进行等电聚焦电泳约 18 h.等电聚焦结束后, 迅速取出第一个胶条于平衡液 [ 50 mm o l/L Tris-H C l( pH = 8 8)、6 m ol /L尿素、体积分数为 30%的甘油、2%的 SDS、1%的 DTT ]中平衡 15 m in. 将平衡后的胶条转移到质量分数为12%, 规格为 200 mm 200 mm 0 7 mm的 SDS凝胶上, 并在胶条上覆盖一层加有溴酚蓝的 0 5%琼脂糖, 在 140 V的恒定电压下进行 SDS凝胶电泳. 待溴酚蓝前沿到达凝胶底端时, 停止电泳.1. 4 银染和 SDS胶的保存参照文献 [ 11]和安发玛西亚关于双向电泳的实验技术指南的银染方法进行染色. 利用图像扫描仪对 SDS凝胶进行透射扫描, 所得的图谱用 Investigator HT Database软件进行图像分析. 之后用保鲜膜将SDS胶封好保存于 4 冰箱中, 用于肽指纹分析.1. 5 蛋白质的原位酶解用干净的解剖刀将感兴趣的蛋白点从胶条上切下来, 保存在 0 5 mL的离心管中, 进行酶解. 酶解和肽段的提取参照文献 [ 12]的方法进行. 最后将肽段提取液置于真空浓缩离心机中干燥, 之后加入2 5 L体积分数为 0 5%的 TFA溶液溶解肽段, 用于 MALD I-TOF质谱分析.1. 6 肽质谱指纹分析将上述溶液与 H CCA饱和基质溶液 (H CCA溶于体积分数为 40%的乙腈, 0 1%的 TFA溶液至过饱和 )以 1 1的体积比混合, 取 1 L混合液点滴在不锈钢 MALD I-TOF质谱点样板上, 置于空气中自然风干, 随后进行质谱分析. 采用高分辨率反射模式, 离子源加速电压 1为 20 kV, 加速电压 2为 18 85kV, N 2激光波长 337 nm, 脉冲宽度 3 ns, 离子延迟提取时间 500 ns, 真空度 5 33 10- 5Pa, 质谱信号单次扫描累加 10次, 正离子谱测定, 用外标法标定多肽质谱峰峰位.1258 高 等 学 校 化 学 学 报 Vo .l 271. 7 质谱数据的数据库检索进入 MASCOT( http: / /www. m atrixscience. com )检索网站, 利用 SW ISS-PORT, M SDB和 NCB I等 3个数据库对获得的混合物肽段质量数据进行检索. 检索参数如下: 最大允许的肽质量误差为 0 5, 每个肽段允许有 1个不完全裂解位点, 固定修饰 ( F ixed m odifications)选择羟甲基 ( H ydroxym e thyl)修饰, 可变修饰 ( Ox idation m od ifications)选择氧化 ( Ox idat ion)修饰.2 结果和讨论2. 1 优化双向凝胶电泳分离 BG蛋白质组海兔 CNS一般都含有丰富的脂类物质, 它对蛋白质提取、溶解以及双向凝胶电泳分离蛋白质组的效果均会产生一定的干扰. 采用常规丙酮沉淀法去除 BG中大量的脂类时, 由于 BG中总蛋白含量少,在去脂过程中将造成部分蛋白质损失, 不适合进行 BG蛋白质组提取. 同时, 尝试了使用样品裂解液直接破碎 BG细胞方法, 并选用离心技术分离 BG蛋白质组. 结果表明, 这一分离与提取技术不仅能有效地去除 BG的脂类物质, 同时能减少 BG蛋白质丢失.此外, 对双向凝胶电泳的上样量和载体两性电解质的 pH范围进行优化, 发现 BG上样量中的蛋白质质量浓度为 2 0 m g /m L时, 采用银染法, 最佳蛋白质提取液上样量为 25~ 30 L. 同时, 采用载体两性电解质的 pH范围为 5 0~ 8 0, 相对于 pH = 3 0 ~ 9 0和 pH = 4 0~ 6 0更有利于 BG蛋白组的分离.Fig. 1 2D-PAGE m ap of BG proteom ew ith the pH 5 0 8 0采用优化后的双向电泳条件对BG蛋白质组进行分离, 结果见图 1.图 1结果显示, 在凝胶层析板的中间区域, 蛋白质斑点数目相对集中, 这表明中性蛋白质种类较多; 而左侧蛋白质斑点的数目多于右侧, 这示意弱酸性蛋白质种类多于弱碱性蛋白质. 进一步的分析结果可知, 图 1所显示的蛋白质分子量由上到下逐步增加, 多数 蛋白 质分 子量 位于35 000~ 110 000之间, 超过该范围的蛋白质种类较少. 此外, 图 1中所显示的各种蛋白质斑点之间的染色深浅和相对面积均存在着较大差异, 反映出 BG蛋白质组由相对含量差异较大的蛋白亚基组成. BG蛋白质组的组成与含量呈复杂化特点.2. 2 蛋白点的肽指纹鉴定选用 Invest igator HT Database软件对图 1进行图谱分析, 可检测到 300个左右的蛋白质斑点, 并对其中 96个斑点进行肽指纹分析. 由于蛋白胶内酶解的操作复杂, 难以回收全部的酶解肽段, 一些疏水性较强的肽段或过长的肽段均可能会丢失, 导致覆盖率仅在 20% ~ 50%之间. 尽管如此, 蛋白质具有很强的序列专一性, 酶解后产生的肽混合物质量数仍具有特征性, 可通过肽谱分析, 并结合 2D-PAGE的等电点和分子量信息鉴定蛋白质. 经过数据库检索, 除去了分值比较的结果, 最终鉴定了 NLCS的BG中 56种蛋白质和多肽.从检索的匹配情况来看, 在这些蛋白和多肽中, 有 4个匹配率较高 (得分超过 76)的蛋白质 (见表 1) , 45个匹配率较为理想 (得分在 50~ 76之间 )的蛋白质; 其余均是匹配率较低的蛋白质. 较高匹配率的蛋白质分别是 微管蛋白 (N o. 20, tubulin)、肌动蛋白 ( No. 22, Actin)以及两个 1, 5-二磷酸核1259No. 7 陈东仕等: 优化分离与鉴定蓝斑背肛海兔口腔神经节蛋白质组Tab le 1 BG proteins iden tified w ith database searchSpot No. P rote in nam e S core M w pH Coverage(% ) A ccession No.20 tubul in 82 50 742 4 73 24 g i| 3008888422 A ct in 76 41 827 5 30 29 g i| 22430525 R ibu lose-1, 5-b isphosphate carboxylase/oxygenaselarge subun it83 49 302 6 41 20 g i| 3332860426 R ibu lose-1, 5-b iphosphate carboxylase large subun it 80 50 753 6 33 28 g i| 177141841 Pept ide m at ing pherom one p recu rsor Bbp2-5 48 9 645 7 93 36 g i| 14269434酮糖-羧化酶 /加氧酶的大亚基 ( Nos. 25, 26, r ibu lose-1, 5-bisphosphate carboxy lase /oxygenase large subunit和 ribulose-1, 5-bisphosphate carboxy lase large subun it). 除此之外, 还发现一种与海兔信号传导有关的多肽 交配信号肽前体 ( No. 41, peptide m ating pherom one precursor Bbp2-5) (见表 1). 交配信号肽对于海兔的繁殖有着重要意义, 它主要用于吸引其它同类海兔聚集与交配. 目前已经发现的信号肽有吸引素 ( A ttractin)和产卵激素 ( Egg- lay ing horm one, ELH )[ 13, 14 ]. NLCS口腔神经节蛋白质组中的交配信号肽前体有可能就是海兔用于合成 A ttract in和 ELH的前体多肽.通过数据检索与统计, 发现 40个蛋白质中涉及各种酶类、结构蛋白、转运蛋白以及抗原, 还有一些未知蛋白; 而 16个多肽涉及信号多肽、蛋白亚基和一些肽段. 这些实验结果说明 NLCS的 BG中含有丰富的蛋白质和多肽. 为了获得更多蛋白质组成与功能信息, 依据 N air和 Rost[ 15 ]提供的软件和分类法, 进入 LOC tree server的网站 ( http: / /cub ic. bioc. co lum b ia. edu /serv ices/ loctree / )对这 56种蛋白质进行亚细胞定位检索, 并依此进行蛋白质分类. 结果表明, 这些蛋白可分为六类, 即线粒体蛋白 ( 11种 )、核蛋白 ( 6种 )、DNA结合蛋白 ( 4种 )、细胞质蛋白 ( 22种 )、细胞外蛋白 ( 9种 )以及其它细胞器蛋白, 其具体分布情况可见表 2. 预计这些细胞定位结果将对今后阐明 BG蛋白质组结构与功能起着重要的作用.Tab le 2 The subce llu lar localization of BG prote insSub cellu lar local ization Spot Sum Percen tage(% )Cytop lasm ic 2, 6, 12, 13, 19, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 36, 39, 41, 42, 53, 5622 39 3Extra-cellu lar 4, 9, 16, 17, 18, 37, 38, 40, 55 9 16 2M itoch ondria 3, 8, 10, 14, 15, 21, 24, 43, 45, 50, 54 11 19 6Nuclear 11, 20, 34, 44, 47, 52 6 10 7DNA-b inding 5, 35, 46, 48 4 7 1Organellar 1, 7, 49, 51 4 7 13 结 论本文选用蛋白质组学技术优化 NLCS的 BG蛋白质组的分离、纯化. 利用 LOC tree软件构建 BG蛋白质组信息图谱, 它可为今后发现 BG新蛋白质的结构与功能奠定良好的基础. 但由于所采纳的蛋白质组分离与 PM F鉴定技术存在一些不足之处, 即在进行肽指纹数据库检索时, 由于海兔神经蛋白质理化参数在国际各大数据库中较为缺乏, 加上物种间相同功能蛋白质的一级结构上存在着较大差异等缺陷, 导致检索结果中只有少数的蛋白来源于海兔, 多数蛋白质还需要通过其它分析方法给予逐一证实[ 16~ 19 ].参 考 文 献[ 1 ] HUANG H e-Q ing(黄河清 ). Analyt ical In strum en tat ion (分析仪器 ) [ J] , 2004, 2: 23 27[ 2 ] WU H an-Zh i(吴韩志 ) , HUANG H e-Q ing(黄河清 ) , YE Q ing-H ua(叶庆华 ) et a l. . Jou rn al ofX iam en Un iversity, Natu ral Science E-d ition(厦门大学学报, 自然科学版 ) [ J] , 2004, 43( 5 ): 710 713[ 3 ] H orn C. C. , Kupferm ann I. . N euroscien ce L etters[ J] , 2002, 323( 2 ) : 175 178[ 4 ] N argeot R. , Baxter D. A. , B yrn e J. H. . Neuroscience Let ters[ J] , 2002, 328( 2) : 85 88[ 5 ] H umm on A. B. , Sw eed ler J. V. , Corb in R. W. . T rAC Trends in AnalyticalC hem istry[ J] , 2003, 22( 8 ) : 515 521[ 6 ] HUANG H e-Q ing(黄河清 ), KIM W on-Suk, LIN Q ing-M ei(林庆梅 ) . M arin e S cien ces(海洋科学 ) [ J], 2004, 28 ( 5) : 53 571260 高 等 学 校 化 学 学 报 Vo .l 27[ 7 ] Cumm ins S. F. , N icholsA. E. , Rajarathnam K. et al. . Pept ides[ J] , 2004, 25 ( 2) : 185 189[ 8 ] Su ssw ein A. J. , Nagle G. T. . Pep tides[ J] , 2004, 25( 9) : 1523 1530[ 9 ] Rubakh in S. S. , Page J. S. , Monroe B. R. et a l. . 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D epar tm ent of Chem istry, H ong K ong Bap tist University, H ong K ong, China )Abstract A separation m ethod of proteom e from the buccal gang lion o f ap ly sia (N otarcus leachii cirrosusS timp son, NLCS) w ith tw o-d im ensional polyacry lam ide gel electrophoresis( 2D-PAGE) w as optim ized, gainingabout 300 pro tein spots. M ass spectrogram of peptidem ass fingerprin t( PMF) o f 96 pro tein spots from the BGw ere obta ined by a comb ined of-f line techn ique of the m atrix-assisted laser desorption ion izat ion m ass spec-trom etry(MALD I-TOF M S) and the em zym o lysis in ge.l Based on the identificat ion via the databases searchesand PMF m aps, w e found that four o f96 prote ins in the gel show ed the character isticsw ith high m atch scores,w hich were indicated to be fram ew ork proteins tubulin, act in, ribulose-1, 5- bisphosphate carboxylase and oxy-genase in neurons cel;l m eanwh ile, a peptidem a ting pherom one precurso rw as found. F ifty-six proteins in BGw ere further classified by a LOC tree so ftw are according to the search resu lt of subce llular localization.Keywords Ap ly sia; Buccal ganglion; Proteom e; 2D-PAGE; M ass spectrom etry( Ed. : H, J, Z )1261No. 7 陈东仕等: 优化分离与鉴定蓝斑背肛海兔口腔神经节蛋白质组

优化分离与鉴定蓝斑背肛海兔口腔神经节蛋白质组

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/54034/%e4%bc%98%e5%8c%96%e5%88%86%e7%a6%bb%e4%b8%8e%e9%89%b4%e5%ae%9a%e8%93%9d%e6%96%91%e8%83%8c%e8%82%9b%e6%b5%b7%e5%85%94%e5%8f%a3%e8%85%94%e7%a5%9e%e7%bb%8f%e8%8a%82%e8%9b%8b%e7%99%bd%e8%b4%a8%e7%bb%84.pdf?sequence=1&isAllowed=y

优化分离与鉴定蓝斑背肛海兔口腔神经节蛋白质组

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