蓝斑背肛海兔中枢神经系统相比于其他海兔,缺少脏神经节.口腔神经节是蓝斑背肛海兔的主要神经节之一,它控制着口腔和其他附属器官的生理活动,其中多肽起着重要的作用.本文选用反相高效液相色谱和质谱非在线联用技术分析口腔神经节多肽组成与分布情况,发现口腔神经节含有丰富的神经活性多肽组分,以颊肽、肌肉调节素、心脏活性小肽、肌动蛋白片段和吸引素为主.经Paws软件和数据库检索分析后,发现部分多肽组成来自于前体蛋白的酶解产物,认为这些酶解产物与其他多肽一同参与执行口腔神经节各种不同的生理功能

冯丽剑

吴韩志

陈东仕

颜利

黄慧英

黄河清

Xiamen University Institutional Repository

第 45卷 　增刊 　　　　　　　　　　　厦门大学学报 (自然科学版 ) 　　　　　　　　　　　　V ol. 45　Sup.2006年 5月 　　　　　　　　　　Journa l of X iam en U n ive rs ity (N a tu ra l Sc ience) 　　　　　　　　　　M ay 2006　　收稿日期 : 2005212225　　基金项目 :福建省自然科学基金 ( C0310006)和厦门大学预研基金(2004xdcx207, XDKJCX20051009)资助　　作者简介 :吴韩志 (1976 - ) ,男 ,助理工程师.　　3 通讯作者 : hqhuang@ xmu. edu. cnHPLC和 MALD I2TOF质谱技术研究海兔口腔神经节多肽组分与分布吴韩志 ,陈东仕 ,冯丽剑 ,颜　利 ,黄慧英 , 黄河清 3(厦门大学生命科学学院 分析测试中心 , 福建 厦门 361005)摘要 :蓝斑背肛海兔中枢神经系统相比于其他海兔 ,缺少脏神经节. 口腔神经节是蓝斑背肛海兔的主要神经节之一 ,它控制着口腔和其他附属器官的生理活动 ,其中多肽起着重要的作用. 本文选用反相高效液相色谱和质谱非在线联用技术分析口腔神经节多肽组成与分布情况 ,发现口腔神经节含有丰富的神经活性多肽组分 ,以颊肽、肌肉调节素、心脏活性小肽、肌动蛋白片段和吸引素为主. 经 Paws软件和数据库检索分析后 ,发现部分多肽组成来自于前体蛋白的酶解产物 ,认为这些酶解产物与其他多肽一同参与执行口腔神经节各种不同的生理功能.关键词 :海兔 ; 口腔神经节 ; 神经肽 ; 高效液相色谱 ; 质谱中图分类号 : Q 51　　　　　　文献标识码 : A　　　　　　文章编号 : 043820479 (2006) S20202205　　天然活性肽可介导细胞与细胞、蛋白质与蛋白质、细胞与蛋白质及其他非肽类物质、蛋白调控因子与基因表达之间的相互作用. 尽管这些多肽在动物体内含量很少 ,但它们所发挥的功能作用不可忽视. 如何采用蛋白质工程技术研究神经多肽结构与功能越来越受到神经科学研究领域的关注. 美国加州海兔神经系统中的袋细胞是“神经分泌 ”细胞 ,它具有合成专一性低分子量蛋白质的能力. 从袋细胞提取的产卵激素 ( ELH )直接注入海兔时 ,会引起产卵行为发生. 多肽合成研究指出 ,海兔神经末梢所释放的多数多肽种类均是前体的分解产物 . 海兔心脏激动肽 A sn2D2Trp2Phe2NH2(NdW Fam ide)在中枢神经和神经管路及心血管等器官中均有分布. 它不但增强了海兔心室肌细胞 L2型Ca2 +流 ,还加强了前触角的自动收缩. 如果用 L2Trp替代 D2Trp ,其合成肽活性比天然肽活性小 1000倍 [ 1 ] .蓝斑背肛海兔 ( Notarcus leachii cirrosus Stimp son,NLCS) 中枢神经系统相比于其他海兔 ,缺少脏神经节 ,神经系统更为简单. 口腔神经节 (Buccal ganglion,BG)是 NLCS的主要神经节之一 ,它支配咽、唾液腺、食道、嗉囊、胃以及口腔肌肉的活动 ,控制舌头的伸缩.海兔 BG中富含具有不同功能的神经多肽. 前人在研究大脑神经节中的大脑多肽 1 (CP1)时 ,动用了 1 000个体积比 BG大 4～5倍的脑神经节 [ 2 ] . 由此可见 ,研究 BG蛋白质及多肽的组成与分布有一定的难度. 本论文选用 HPLC分离技术与 MALD I2TOF质谱仪检测技术 ,采用非在线联用方法 ,开展 BG多肽组成与分布研究 ,为今后开展 BG神经多肽结构与功能研究奠定良好的研究基础.1　材料与方法1. 1　样 　品蓝斑背肛海兔在 4、5月份时分别采集自厦门市潮间带 ,采集后立刻置于 - 70℃冻存备用.1. 2　仪 　器高效液相色谱仪由 W aters公司生产. 采用 W a2ters1515系列泵 , W aters 2487 系列 uv检测器 , W aterB reeze软件 , C18反相柱 (3. 9 mm ×300 mm ). 质谱仪 :德国 BRUKER公司生产的 REFLEX Ⅲ型 MALD I2TOF质谱仪. 超声波清洗器 : KQ - 50B型 ,昆山市超声仪器有限公司.1. 3　主要试剂乙腈 (Acetonitrile) :色谱纯 ,上海实验试剂有限公司 ;甲醇 (Methanol) :色谱纯 ,上海化学试剂研究所 ;甲酸 ( Form ic acid) :分析纯 ,上海光铧科技有限公司化学试剂分公司 ;三氟乙酸 ( Trifluoroacetic acid) :色谱纯 ,MERCK2Schuchardt公司 ; 2, 52二羟基苯甲酸 ( 2, 52di2hydroxybenzoic acid, DHB ) :色谱纯 ,美国 ICN 生物医学公司.1. 3　BG样品制备将蓝斑背肛海兔解剖 ,取其 BG20对 ,用研钵研增刊 吴韩志等 : HPLC和 MALD I2TOF质谱技术研究海兔口腔神经节多肽组分与分布 · 203　 ·磨 ,然后加溶解液进行溶解 ,溶解液组成为 V (丙酮 ) :V (水 ) ∶V (盐酸 ) = 60∶4∶1. 样品溶液在 4℃下静置 1h. 而后于 12 000 r/m in下离心 5m in ,收集上清. 过 22μm的滤膜. 收集滤液备用.1. 4　HPLC分离条件流动相分别采用 1: 20%乙腈和 0. 1%三氟乙酸( TFA ) ; 2: 40%乙腈和 0. 1%三氟乙酸 ; 3: 60%乙腈和0. 1%三氟乙酸. 双波长 ( 220, 280 nm )检测. 流速 2mL /m in,进样 200μL时间 20 m in.1. 5　质谱检测每管吸取 0. 8μL与等体积基质 DHB混合、点样 ,作质谱分析. 质谱条件 :脉冲氮激光 ( 337 nm )作为离子解吸电离源. 分析模型分别选用反射模式 (m / z: 0～6 000)和线性模型 (m / z: > 6 000) ,加速电压控制在20 kV. 平均每次测定样品的激光脉冲次数在 120次左右. 采用外标法标定多肽质谱峰峰位.2　结果与讨论2. 1　结 　果实验结果表明 ,采用 20%乙腈和 0. 1%三氟乙酸为分离条件时 ,由于 BG多肽与分离介质结合力较强 ,使洗脱液的极性强度无法取代结合在分离介质上的多肽组分 ,因而使多数多肽组分无法得到有效分离. 改用 40%乙腈和 0. 1%三氟乙酸作为分离条件时 ,质谱分析结果发现 BG多肽组成能得到较理想的分离效果. 为了进一步优化分离效果 ,作者把乙腈浓度提升到 60% (0. 1%三氟乙酸 ) ,但所获得多肽种类及含量反而减少 ,这说明了 40%乙腈和 0. 1%三氟乙酸组成的分离条件较为适合于 BG多肽组成的分离与纯化.根据质谱分析多肽结果 ,结合 NCB I海兔蛋白数据库和 Paws软件分析 ,在设定相对误差小于 < 1 ×10 - 4条件进行检索 ,其 BG多肽检索结果总结在表 1～3. 图 1～3分别是分析得到的几个重要组分 BucR、SCP2B、MME质谱图.m / z (102 )　图 1　质谱分析得到的 BucR组分　Fig. 1　BucR analyzed by MALD I2TOF2MS表 1　BG多肽组分Tab. 1　The pep tide composition of BG实验值M + H + (m / z)理论值M (m / z)多肽组分名称574. 46 574. 0 M et - enkephalin598. 40 599. 0 FM RFam ide646. 62 645. 8 PRQ FV am ide725. 48 725. 0 FR FB764. 31 766. 41 FR FA819. 41 818. 47 M yom odulinI830. 17 829. 48 M yom odulinE833. 87 832. 5 M yom odulinG1035. 99 1035. 5 V asop ressin - like pep tidev1095. 52 1097. 7 B ucR1142. 74 1141. 0 SC P - B2899. 48 2899. 9 pG lu - R3 - 14 I3996. 35 3999. 0 R15α1表 2　BG多肽片段组分Tab. 2　The pep tide fragments of BG实验值M + H + (m / z)理论值M (Mw )多肽组分名称528. 66 527. 6 B uccalin p recursor [ 430 - 435 ]553. 71 552. 7 A ctin [ 373 - 376 ]568. 67 568. 7 SCP - B p recursor[ 58 - 90 ]573. 80 572. 7 beta tubulin [ 150 - 154 ]587. 71 587. 7 SCP - B p recursor[ 131 - 135 ] or[ 132 - 136 ]589. 55 589. 6 SCP - B p recursor[ 72 - 76 ]594. 72 593. 7 B uccalin p recursor[ 11 - 15 ] or[ 12 - 16 ]630. 67 630. 7 SCP - B p recursor[ 70 - 75 ] or[ 94 - 98 ]652. 74 652. 7 SCP - B p recursor[ 1 - 6 ]实验值M + H + (m / z)理论值M (Mw )多肽组分名称667. 86 666. 9 A ctin [ 189 - 193 ]682. 71 682. 7 SCP - B p recursor[ 76 - 80 ]691. 65 690. 7 B uccalin p recursor[ 46 - 51 ]698. 85 697. 8B uccalin p recursor[ 224 - 230 ]. [ 251 - 257 ].[ 264 - 270 ]. [ 291 - 297 ]. [ 304 - 310 ]735. 96 734. 9 B uccalin p recursor[ 466 - 471 ]741. 72 740. 8 M ollusk - derived grow th fac tor[ 520 - 525 ]854. 10 853. 0 A ctin [ 256 - 262 ] or[ 257 - 263 ]1002. 19 1001. 2 B uccalin p recursor[ 5 - 12 ]· 204　 · 厦门大学学报 (自然科学版 ) 2006年实验值M + H + (m / z)理论值M (Mw )多肽组分名称1242. 50 1241. 5 B uccalin p recursor[ 315 - 326 ] or[ 371 - 382 ]1370. 28 1369. 4 A ttrac tin [ 42 - 54 ]1602. 77 1602. 8 SCP - B p recursor[ 97 - 110 ]1917. 32 1917. 4 SCP - B p recursor[ 3 - 20 ]2032. 47 2032. 4 SCP - B p recursor[ 78 - 97 ]2183. 39 2183. 5 SCP - B p recursor[ 82 - 102 ]2310. 65 2309. 6 B uccalin p recursor[ 310 - 330 ]2497. 02 2495. 9 B uccalin p recursor[ 87 - 109 ] or[ 89 - 111 ]2698. 60 2697. 7 B uccalin p recursor[ 479 - 501 ] or[ 480 - 502 ]2827. 44 2828. 5 ELH [ 15 - 36 ]3003. 75 3002. 5 B uccalin p recursor[ 400 - 425 ]3047. 86 3046. 8 A ctin [ 307 - 334 ]3119. 91 3118. 6 B uccalin p recursor[ 84 - 112 ]3280. 64 3279. 6 A ttrac tin [ 22 - 51 ]实验值M + H + (m / z)理论值M (Mw )多肽组分名称3413. 94 3413. 9 SCP - B p recursor[ 82 - 113 ]3416. 36 3415. 2 A ctin [ 300 - 331 ]3529. 59 3528. 8 A ctin [ 215 - 245 ]3660. 07 3659. 1 A ctin [ 271 - 304 ]3789. 47 3788. 2 A ttrac tin [ 2 - 35 ]3879. 48 3879. 7 SCP - B p recursor[ 4 - 39 ]4131. 80 4130. 7 A ctin [ 341 - 376 ]4271. 52 4270. 6 A ctin [ 219 - 256 ]4394. 54 4393. 3 A ctin [ 310 - 349 ] or[ 311 - 350 ]4511. 50 4510. 4 A ctin [ 312 - 352 ]4697. 26 4697. 2 SCP - B p recursor[ 79 - 122 ]5786. 58 5785. 7 N europep tide Y [ 10 - 60 ]5883. 86 5883. 4 A ctin [ 195 - 245 ]5891. 80 5890. 8 A ctin [ 97 - 149 ]表 3　未能检索到的 BG多肽组分Tab. 3　The BG pep tides of BG in the absence of database未知的多肽组分实验值 M + H + (m / z)510. 15 510. 15 540. 42 549. 25 559. 85 627. 98 651. 94653. 12 662. 98 666. 18 685. 13 700. 37 742. 19 778. 50804. 29 808. 46 853. 16 872. 72 895. 4 1244. 03 1486. 381657. 31 1787. 69 2030. 79 2181. 04 2597. 34 3180. 14 5966. 48m / z (102 ) m / z (102 )图 2　质谱分析得到的 SCP2B组分Fig. 2　SCP2B analyzed byMALD I2TOF2MS图 3　质谱分析得到的 MMEFig. 3　MME annalyzed byMALD I2TOF2MS2. 2　讨 　论表 1～3分别是 BG的完整多肽组分 ,多肽片段以及未知多肽组分归类. 从中可以看出 , NLCS的 BG含有丰富多肽组份. 它们反映了 NLCS的 BG中所存在的多肽组份与分布情况. 其中部分多肽与其他类型的海兔神经节多肽很相似 ,但是在多肽的种类、分布情况、数量等方面仍然存在着很大的差异性 ,由表中数据可知 ,有完整序列的多肽组分一共是 13个 ,多肽片段45个. 另外 ,未知的多肽组分 29个 ,占到多肽种类总数近三分之一. 这些已知多肽与片段 ,绝大多数与神经节的结构与功能关系紧密 ,而未知的多肽组分 ,其性质与功能尚不清楚 ,有待于进一步研究.海兔 BG及口腔肌肉组织中均含有颊肽 ( bucca2lin) ,调节着口腔肌肉的活动. 目前 ,有研究报道的颊增刊 吴韩志等 : HPLC和 MALD I2TOF质谱技术研究海兔口腔神经节多肽组分与分布 · 205　 ·肽高达 19种 ,是由它的前体蛋白酶解产生 ,其前体蛋白一 级 结 构 由 505 个 氨 基 酸 组 成 , 分 子 量 为53 516. 5 Da. 实验结果发现 ,在 NLCS的 BG中 ,不同结构的颊肽种类很少 ,仅仅有 Buc R (序列为 : MDQFS2FGPGL,文中序列信息均取自 NCB I蛋白质数据库 )一种 (图 1). 对于这一结果 ,我们认为 ,有可能是由于NLCS较为低等 ,它的一些多肽的剪切及相关功能并未阐明 ,缺乏相关的信息 ,从而导致检索颊肽组分偏少的现象. 当 BG调节口腔肌肉活动时 ,颊肽主要作用于前突触部位 ,它对于肌肉的松弛没有影响 ,可以减少触动神经元的促收缩作用 ,但对乙酰胆碱不起作用. 颊肽作为 BG中的最主要多肽 , NLCS的 BG中存在形式是以前体蛋白为主. 而在行使其功能时 ,才大量剪切成熟. 因为在实验中 ,发现有大量颊肽前体蛋白片段的存在. 其剪切部位复杂. 这些片段有可能是我们未知的活性多肽 ,并在 BG中实施某些特殊功能.另外两种重要的多肽 (图 2, 3 )是心脏活性小肽( Small cardioactive pep tide , SCP)和肌肉调节素 (myo2modulin,MM ) ,它们均作用于后突触. 当前突触端释放出神经传递物质之后 ,这些化学物质便利用扩散的方式抵达后突触区 ,并且和其上的受体相互结合 ,此时将引发一个动作电位 ,使得这个讯号得以传到下一个神经细胞上. SCP与 MM配合颊肽就可以起到完整的神经传导作用. 它们在质谱图中有完整分子量的描述.从质谱图中峰值的高低情况可以较为简明直观地分析出该种组分相对含量的高低情况. 结果显示 SCP在BG中的含量相当丰富. 这一看法与数据库中所描述的BG中含有大量 SCP的结果是一致的.海兔 SCP主要有 SCP2A和 SCP2B两种 ,但含量上有所不同 , NLCS的 BG中主要以 SCP2B (序列为 :MNYLAFPRM )为主. SCP是一种重要且起调控作用的多肽 ,它与 52羟基色氨酸 ,被称为是两大神经调节传递因子. 实验结果还表明 , BG中也含有 FMRMam ide小肽. 它是另外一种重要的神经多肽 ,有报导说它能与 SCP共同协作 ,完成对肌肉的调节过程. Lyle和Philip在研究神经多肽释放对行为可塑性的影响时 ,发现海兔口腔肌肉 I3a受两种神经元 (B3和 B38)支配 ,而它们又分别释放出 FMRMam ide和 SCP来共同完成肌肉收缩活动 [ 3 ] . Ned 和 Steven 也发现 FM2RMam ide和 SCP2B在海兔感觉神经元超极化 Cl2离子流时 ,起到相反的作用 [ 4 ] . 尽管如此 ,有关 SCP2A实验证据还未在 NLCS的 BG中得到证实.MM在神经系统中起着调节肌肉活动的作用. 现已发现的有 9种之多 (从 MM 2A到 MM 2I) ,而在 NLCS的 BG中发现有了 3种 : MM 2E (序列为 : GLQMLRL ) ,MM 2G (序列为 : TLSMLR) ,MM 2I(序列为 : SLSMLRL ).MM多肽主要作用是调节肌肉的伸缩活动. 口舌和周边肌肉的伸缩活动在海兔的日常行为中是常见反射行为. 在海兔胸膜神经节的感觉神经元中 ,肌肉调节素通过与 52羟色氨酸相反的作用来控制其尾部的收缩反射 [ 5 ] ,并对口舌及周边的附属器官进行调控 ,从而达到控制进食行为的效果. 由于 NLCS的 BG中只含有3种 MM ,这也说明了它在进化上比 CA来得低等. 这 3种 MM如何行使它们的功能 ,还有待进一步的研究.此外 ,还有一些类脑啡肽与后叶加压素的多肽组分存在 ,这些组分能够在实验中得到检测 ,说明它们在NLCS的 BG中也有相当数量的存在. 它们虽然在海兔神经系统的相关文献中未见报导 ,但作用不能忽视. 因此进一步的深入研究它们的作用与功能也很有意义.由表 2的多肽片段组分实验结果可知 ,在 NLCS的 BG中存在着丰富的多肽片段. 这些片段主要有肌动蛋白 ( actin)、吸引素 ( attractin)、颊肽前体蛋白 ( buc2calin p recursor)、微管蛋白 ( tubulin)、SCP2B前体蛋白( SCP2B p recursor)以及 Neruopep tide Y (NPY).RP2HPLC在分离 BG多肽组成与分布显示了特殊优势. 与 MALD I2TOF2MS进行非在线联用分析 ,这不仅能充分了解 BG多肽组成与分布情况 ,而且对阐明多肽结构和了解多肽功能中均起着重要的作用和提供了有价值科学理论研究依据. 在多肽的研究中 ,直接将组织样品与基质混合 ,置于质谱靶上测定 ,也是快速了解组织一定部位的多肽特性的一种方式. Kruse[ 6 ]等将腹神经节直接放在 MALD I2TOF2MS靶上混以基质得到如表 4的多肽组分结果.表 4　腹神经节 MALD I2TOF2MS分析结果Tab. 4　The analysis result of AG byMALD I2TOF2MS多 　肽 　　 细 　胞 　α2BCP127 Bag cellsa2BCP129 Bag cellspGlu Pep tide II R3214Pep tide II R3214ELH (1882203) Bag cellsε2BCP Bag cellsAP (9227) Bag cellsAP Bag cellsELH (1102144) Bag CellsELH Bag cellsδ2BCP Bag cellsPep tide V R3214ELH (1032148) Bag cells　　腹神经节中的多肽是以袋细胞多肽为主的. 而袋细胞是一种肽能细胞 ,即能产生大量活性多肽的细胞.· 206　 · 厦门大学学报 (自然科学版 ) 2006年这一特点也决定了 AG中的袋细胞成为研究的热点之一. 然而 ,用质谱直接分析的结果 ,从表 4中可以看出 ,有完整的多肽组分只检测到 7个 ,多肽片段有 6个. 对于腹神经节这样一个多肽含量丰富的组织 ,也只有少量的多肽信息得以展现. 比较表 1～3与表 4中腹神经节与口腔神经节的多肽组分可以看出 ,它们均有各自的特点所在. 腹神经节有大量的产卵激素和 BCP存在 ,而口腔神经节有大量颊肽及前体片段的存在 ,这与它们所属的部位与功能性质相对应. 从实验方法的角度可以看出 :用高效液相色谱与质谱联用的分析方法得到的组分多 ,信息量大 ,更能反映神经节内部的情况.这一结果与 Floyd [ 7 ]等人对神经连索多肽组分用两种方法所做的分析结果 ,所反映的事实相符. 通过比较进一步证明了这种高效液相色谱结合 MALD I2TOF2MS非在线检测上的优越性.参考文献 :[ 1 ] 　Fum ihiro M , Yuka N, Sachie K. A novel D2am ino2acid2containing pep tide isolated from Ap lysia heart [ J ]. B io2chem ical and B iophysical Research Communications, 1997,240: 354– 358.[ 2 ]　W ang Y, Price D A, Sahley C L. Identification and charac2terization of a myomodulin2like pep tide in the leech [ J ].Pep tides, 1998, 19 (3) : 487 - 493.[ 3 ]　Lyle F, Philip E L. Evidence that post2Tetanic potentiationis mediated by neuropep tide release in Ap lysia[ J ]. J. Neu2rophysiol, 2001, 86: 2845 - 2855.[ 4 ]　Ned B, Steven A S. Antagonistic modulation of a hyperpo2larization2activated Cl2 current in Ap lysia sensory neuronsby SCPB and FMRFam ide[ J ]. J. Neurophysiol, 2003, 90:586 - 598.[ 5 ]　Critz S D, Baxter D A, Byrne J H. Modulatory effects of se2rotonin, FMRFam ide, and myomodulin on the duration ofaction potentials, excitability, and membrane currents in tailsensory neurons of Ap lysia [ J ]. J. Neurophys, 1991, 66:1912 - 1926.[ 6 ]　Kruse R, Sweedler J V. Spatial p rofiling invertebrate gangliausing MALD I2MS [ J ]. J. Am. Soc. 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In th is paper, com bined off2line m ethod of RP2H PLC w ith M S techno logy,Pep tides of BG of NLCS w ere s tud ied. There w ere m any Pep tides found in BG such as bucca lin, m yom odulin, sm all card ioactive pep tide( SCP) , actin and a ttrac tin. The info rm ation of Pep tides w as searched in da tabase and analyzed by Paw s softw are. The resu lts show ed thatsom e pep tides com e from their p recurso r p roteins. The Pep tides and the ir p recursor p ro te ins w ere both taking part in achieving diffe rentphysiolog ical func tion.K e y w o rd s: A p lysia; bucca l gang lion; neuropep tide; H PLC; M S

HPLC和MALDI-TOF质谱技术研究海兔口腔神经节多肽组分与分布

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/54033/HPLC%e5%92%8cMALDI-TOF%e8%b4%a8%e8%b0%b1%e6%8a%80%e6%9c%af%e7%a0%94%e7%a9%b6%e6%b5%b7%e5%85%94%e5%8f%a3%e8%85%94%e7%a5%9e%e7%bb%8f%e8%8a%82%e5%a4%9a%e8%82%bd%e7%bb%84%e5%88%86%e4%b8%8e%e5%88%86%e5%b8%83.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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