从海洋生物中提取海藻酸纳和壳聚糖作为纳米粒的包被材料,并分别包装成人胰岛素纳米粒。选用基质辅助激光解吸离子化飞行时间(Matrix-assistedlaserdesorptionionization/timeofflight,MALDI-TOF)质谱技术研究胰岛素海藻酸钠纳米粒包装、释放过程及在不同酸碱介质条件下的稳定性

卓慧钦

易瑞灶

曾新华

林庆梅

谢麟

黄河宁

黄河清

Xiamen University Institutional Repository

 Marine Sciences/Vol.30,No.1/2006 73MALDI-TOF质谱技术研究胰岛素海藻酸钠纳米粒特性 曾新华 1，谢  麟 1, 卓慧钦 1，黄河宁 2, 林庆梅 1, 易瑞灶 3, 黄河清 1 （1.厦门大学 生命科学学院，福建省化学生物学重点实验室，环境科学研究中心，福建 厦门 361005; 2. 三明学院 化学与生物工程系，福建 三明 365000; 3.国家海洋局 第三海洋研究所，福建 厦门 361005）            摘要：从海洋生物中提取海藻酸纳和壳聚糖作为纳米粒的包被材料，并分别包装成人胰岛素纳米粒。选用基质辅助激光解吸离子化飞行时间（Matrix-assisted laser desorption ionization /time of flight, MALDI-TOF）质谱技术研究胰岛素海藻酸钠纳米粒包装、释放过程及在不同酸碱介质条件下的稳定性。  关键词：MALDI-TOF; 质谱; 胰岛素; 纳米粒包装; 稳定性 中图分类号: Q617     文献标识码：A     文章编号：1000–3096(2006)01–0073–05   胰岛素（Insulin, INS）分子间有很强的聚合力。一旦 INS形成聚合物后，就难以通过生物屏障进入胃肠壁（上表皮细胞层）且被高效利用[1]。如果 INS直接口服给药，其生物利用度很低，几乎无临床使用价值[2]。近年来，有关 INS的高包封率、强载药量、高利用率及长体内循环时间等特性研究一直是开展 INS应用研究工作的焦点问题。常用于 INS纳米粒的包被材料有人工合成的高分子生物可降解脂溶性材料[3]，但由于这类包被材料毒性大，因而限制 INS商品化。海洋生物多糖类化合物具有生物相容性好和毒性低等特点，很适合用于 INS 纳米粒的包被材料。MALDI-TOF质谱技术是一种软离子分析技术，它具有分析快速、高灵敏度、高准确率、操作简便, 耗样品量少等优点[4]。作者选用MALDI-TOF质谱技术为分析方法，研究在不同包装条件下，INS海藻酸钠纳米粒和 INS壳聚糖纳米粒中的 INS稳定性、包装和释放过程等特性，为探讨 INS多糖纳米粒的生物利用度提供具有快速、方便和高灵敏度等特点的分析技术。 1  材料与方法 1.1 试剂、材料和设备 海藻酸钠、壳聚糖（作者课题组提取和制备）、氯化钙和多聚磷酸钠等均为化学纯。注射针剂的人INS由猪 INS改造的（40U），简称为 INS。质谱测定INS 和它的分解产物时，所需的基质 2，5-二羟基苯甲酸（DHB）购置于美国 ICN 生物医学公司。三氟乙酸、乙氰（纯度为 99％）和冰醋酸等化学试剂均属于分析纯。 1.2 仪器设备 MALDI-TOF质谱仪（Bruker公司产品，型号：ReflexIIITM）配置脉冲氮激光（337 nm）作为离子解吸电离源。透析分离装置最大截留分子质量为 10 000 u。 1.3 方法 1.3.1  INS海藻酸钠纳米粒的制备 配制 0.1％的海藻酸钠溶液，加入一定量 INS溶液和 0.2％氯化钙溶液，在磁力搅拌的条件下，反应30 min，随后静置过夜，即得到 INS海藻酸钠纳米粒溶液[2]。 1.3.2  INS壳聚糖纳米粒制备  取一定量的壳聚糖溶于 1％醋酸溶液，加入一定                                                                 收稿日期：2003–07–21；修回日期：2004–06–30 基金项目：国家自然科学基金资助项目（0402760633）；福建省自然科学基金资助项目（C0310006） 作者简介：曾新华（1978–），男，江西永新人，硕士，研究方向：蛋白质结构与功能，E–mail:soxh@sohu.com; 黄河清，通讯作者，教授，博导，E–mail: hqhuang@xmu.edu.cn  海洋科学/2006年/第 30卷/第 1期  74量的 INS溶液和 0.1％多聚磷酸钠溶液， 在磁力搅拌的条件下，搅拌反应 30 min，即得到 INS壳聚糖纳米粒溶液[3]，随后立即进行透析去除游离 INS和其他分解产物。 1.3.3  INS壳聚糖纳米粒的酸稳定性 取适量 INS壳聚糖纳米粒混悬液装入透析袋中，并置于在 0.01mol/L的 HCl溶液中，恒温振荡(37℃，150 r/min)透析 3h或透析到透析袋中不含有游离 INS及它的分解产物。 1.3.4  INS纳米粒分离 将 INS海藻酸钠纳米粒和 INS壳聚糖纳米粒的溶液分别以 38 000 r/min转速离心 30 min (10℃), 随后收集沉淀物，弃上清液, 并进行透析反应。透析的目的是去除样品中的游离 INS和它的分解产物。 1.3.5  INS纳米粒释放 INS和它的分解产物 采用 0.1 mol/L的醋酸溶液（pH4.8，37 ℃）作为 INS纳米粒的反应介质，采用高灵敏度紫外可见分光光度计（280 nm)研究在酸性环境下，INS纳米粒释放 INS和它的分解产物过程与特性。 1.3.6 基质和样品配制 0.1％的三氟乙酸（TFA）水溶液和 30％的乙氰（CAN）按 7:1体积混合成溶液。根据试验要求加入饱和的 DHB于混合溶液中，超声波处理 5 min，并离心（5 000 r/min）5 min，收集上清液，即为饱和基质溶液。样品和饱和基质溶液按 1:1体积混合后，取 0.8μL混合物直接点滴在MALDI-TOF质谱仪专用样品靶上，待样品自然干燥后，将样品靶直接放入质谱仪的靶箱内，进行样品分析。 2 结果和讨论 2.1 INS海藻酸钠纳米粒外表层 INS质谱特性  海藻酸由β-1，4-D 糖苷醛酸和α-1，4-L-古洛糖醛酸组成的杂多糖，其醛基易与蛋白质产生非共价键结合，海藻酸纳已广泛被用作于药物的控制材料及蛋白质固定剂。人的 INS分子由两条多肽链组成，分别称为 A链和 B链，A链含有 21个氨基酸残基，而 B链中则有 30个，肽链之间通过两对二硫键构成 INS，分子质量为 5 870.20 u。作者采用MALDI-TOF 质谱技术研究表明，注射针剂的 INS呈单体，单电荷，其m/z位于 5 870.2处，并含有微量的 INS分解产物，即 A（2 848.0 m/z）和 B(3 359.5 m/z)链。图 1是经透析（截留分子质量小于 10 000 u）后，INS海藻酸钠纳米粒的质谱图谱，显示了 3 个质谱峰，其 m/z 分别位于 2 848.35, 3 359.69和 5 780.06处, 它们与注射针剂的 INS所呈现出的质谱峰图谱极为相似。这一现象说明，当海藻酸钠在进行纳米包装 INS 溶液过程中，部分 INS和它的分解产物络合于 INS纳米粒外表层；当在偏酸性的 DHB 和较强的激光作用下，络合于 INS纳米粒外表层多肽混合物瞬时脱离纳米粒，同时又被基质与激光解吸成为分子离子，并经 TOF 质量分析器检测后，产生 3 个质谱峰（图 1）。进一步实验还表明, INS经海藻酸钠包被后，其 INS纳米粒无法被来自 MALDI 离子源的激光和 DHB 解吸成分子离子, 并表现出特征质谱峰, 即 INS 海藻酸钠纳米粒无法显示自身的质谱峰。前人的实验结果已指出，INS海藻酸纳纳米粒的生物利用度很低。根据图 1结果，作者推测这一起因可能是在包被 INS过程中，大量的 INS直接络合于海藻酸纳纳米粒的外表层，少量包被在纳米粒内，一旦它与胃肠内的酸性物质和消化酶直接分解接触后，立即分解成无活性的短肽混合物，造成 INS海藻酸纳纳米粒的生物利用率很低的现象。设法提高海藻酸纳包封率和减少 INS络合海藻酸钠纳米粒外表层的数量是改善 INS 纳米粒生物利用度的有力措施之一。        质量/电荷（m/z） 图 1 经透析后的胰岛素海藻酸钠纳米粒的质谱图 Fig. 1  Mass spectrogram of sodium alginate nanoparticles of the insulin after dialyzing  2.2 酸性介质影响 INS 海藻酸钠纳米粒的稳 定性 图 2是溶于醋酸（pH4.8）的 INS海藻酸钠纳米粒的质谱图谱，显示了 5个特征质谱峰，其中 m/z 为 Marine Sciences/Vol.30,No.1/2006 752 840.63和 5 780.06质谱峰与图 1结果相对应，可视为 INS和它 A链的质谱峰,而其它 m/z为 1 034.42,  2 309.30和 4 701.59是受醋酸根（-COO-）作用后，INS 分解产物的质谱峰。近期，方雪萍等人采用MALDI-TOF质谱技术研究表明，在酸性 pH2-3介质条件下，未经包埋的 INS仍然呈现稳定性特性，不易分解[5]。因此，作者认为，在弱酸环境下 H+影响 INS稳定性的能力仍然是很有限，但由于醋酸根的作用，迫使 INS海藻酸钠纳米粒释放 INS同时，降低了 INS或它的 A 和 B 链的稳定性，并酸解成新的多肽产物（图 2）。进一步 INS 释放动力学研究表明，在醋酸介质下，INS 海藻酸钠纳米粒可直接释放 INS, 其释放速率（检测波长 280 nm）极为缓慢，最大释放量所需要的反应时间约 90 h 左右。这些现象说明，在有机化合物环境下，INS耐酸能力明显减弱，被分解速率加速； 如直接采用口服 INS给药，其 INS生物利用度低的起因与胃肠中有机酸化合物引起 INS 表现出不稳定性特性，并被分成无活性的短肽混合物有关。选用具有抗有机酸的纳米材料是优化 INS纳米粒口服制剂必需考虑的因素之一。   质量/电荷（m/z）             图 2 在乙酸介质(pH4.8)中胰岛素海藻酸钠纳米粒的质谱图 Fig.2  Mass spectrogram of sodium alginate nanoparticles of the insulin in the medium of acetic acid (pH4.8)  2.3 碱性介质影响 INS海藻酸钠纳米粒的稳 定性 图 3是溶于 0.1 mol/L NaOH的 INS海藻酸钠纳                       质量/电荷（m/z） 图 3  在碱性介质中（0.1 mol/L NaOH）胰岛素海藻酸钠纳米粒的质谱图 Fig.3  Mass spectrogram of sodium alginate nanoparticles of the insulin in the basic medium ( 0.1 mol/L NaOH)     绝 海洋科学/2006年/第 30卷/第 1期  76米粒的质谱图。图 3中显示了 INS被水解成各种各样产物的质谱峰，这一现象说明了纳米包被材料海藻酸钠的抗弱碱性能力较差，易被分解，释放 INS且碱水解成其他小分子多肽产物（图 3），因而在图 3 中未发现 INS的质谱峰，只显示出各种 INS分解产物的质谱峰。显然，选择和改造纳米包被材料成为具有抗弱酸碱特性也是优化 INS口服制剂的又一重要因素。 2.4 在酸性介质 INS壳聚糖纳米粒的稳定性 在自然界中，甲壳素含量仅次于纤维素多糖, 水溶性较差。甲壳素经乙酰化处理后的产物壳聚糖，水溶性明显改善，可用于高分子微包装药物释放体系。壳聚糖组成由大部分氨基葡萄糖和少量 N–乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4 糖苷键连接起来的直链多糖。常用壳聚糖降解的方法可分为酶法降解、无机酸降解及氧化降解法 3种。 图 4是在酸性介质（0.1 mol/L HCl）条件下，INS壳聚糖纳米粒的质谱图谱，仅仅显示出位于 5780.06 m/z处的 INS质谱峰。由于壳聚糖具有遇酸易分解成简单多糖的特点， 因而 INS 壳聚糖纳米粒在 0.1 mol/L HCl 酸性介质中，易被降解成简单多糖混合物， 释放了 INS。INS的分子结构中含有 2对硫硫键，其结构比 INS 的 A和 B链产物更稳定，具有耐弱酸特点[5]。而缺乏这种结构的 INS A和 B链易被酸解成小于 1 000 u的产物，因而在图 4中仅显示出 INS 质谱峰，并未显示出 A 和 B 链或其他酸解的小分子产物的质谱峰。 实验结果还表明，INS 壳聚糖纳米粒在醋酸溶液(pH4.8中)和在 0.1mol/L的 NaOH中均无法检测到INS和它的分解产物质谱峰。这一现象说明壳聚糖具有抗弱酸和弱碱的能力，不易被分解，并使 INS稳定于壳聚糖纳米粒中。冯鹏等[6]人采用了海藻酸钠和壳聚糖包被了 INS，并发现了在反应体系 pH3.1.~5.3之间，介质中 H+不影响 INS 的包封率，这些结果可借鉴说明 INS 壳聚糖纳米粒在醋酸介质(pH4.8)中呈稳定状态，而在较强酸性介质（0.1mol/L HCl）呈不稳定状态，易被较高 H+浓度所分解（图 4）。Knorr 和 Daly 曾提出一个海藻酸钠-壳聚糖微囊模型，认为壳聚糖的外壳不含胰岛素。此外，作者也采用了紫外分光光度法研究了在 0.1mol/L HCl介质中，INS壳聚糖纳米粒释放 INS全过程，释放时间约为 90 h，认为图4所显示的 INS质谱峰，不是络合于壳聚糖纳米粒外表层 INS的质谱峰，而是酸解纳米粒后，所释放出 INS后所显示的质谱峰。     质量/电荷（m/z） 图 4  INS壳聚糖纳米粒在酸性介质（0.1mol/L HCl） 中的质谱图  Fig.4  Mass spectrogram of chitosan nanoparticles of the insulin in the acidic medium ( 0.1mol/L HCl)       现有血清中胰岛素含量测定均采用放射免疫技术或受体分析技术[7]，所需要的检测时间长，而且成本高。研制 INS纳米粒口服制剂的生物利用度，其结果和论点的依据来自于血清血糖水平，无法了解 INS纳米粒在胃及小肠中的稳定性、分解过程和利用速率等一系列有价值的数据，限制了快速地优化和改善INS 纳米粒口服制剂包装工艺。MALDI-TOF 质谱技术具有快速、高灵敏度和高分辨率特点，并能直接测定胃肠中微量 INS和它的分解产物，起到及时快速地分析机体利用 INS速率，是研制 INS纳米粒和多肽生物利用度的新颖分析技术。 参考文献: [1]  Hovorka S W, BiesiD H, Williams T D, et al. High sensitivity of Zn2+ insulin to metal catalyzed oxidation: Detection of Z-oxo-Histidine by tandem mass Spectrometry[J].     Pharmaceutical Research, 2002,19(4):534-557. [2]  袁弘, 胡富强，应晓英,等，胰岛素纳米粒的制备[J].中国药学杂志，2002，37（5）：349-352. [3]  Yan P，Li Y J.Bioadhesive polysaccharide in protein delivery system chitosan nanoparticles improve the intestinal absorption of insulin in vivo[J]. International Journal of  Marine Sciences/Vol.30,No.1/2006 77Pharmaceutics ,2002,249 :139-147. [4]  Hummon A B, Huang H Q, Sweedler J V, et al. A novel prophormone processing siteaplysia california: Leu-Leu rule[J]. Journal of Neurochemistry, 2002,82:1 398-1 405. [5]  方雪萍，黄河清. MALDI-TOF 质谱技术研究胰岛素变性和裂解过程[J]. 分析仪器，2003，138(4):15-19. [6]  冯鹏，王亦农，马建标,等.肽类药物口服制剂材料及控制释放能力的研究[J]. 离子交换与吸附，1999，15（1）:64-70.  [7]   Mei H, Yu X C, Chan K K, NB1-C16-insulin:Site specific synthesis, purification, and biological activity[J]. Pharmaceutical Research, 1999,16(11):1 680-1 686.  Studies on characteristics of sodium alginate nanoparticles of the insulin by MALDI-TOF mass spectrometry ZENG Xin-Hua1, XIE Lin1 , ZHUO Hui-qin1, HUANG He-ning2 , LIN Qing-mei1 , YI Rui-zao3 , HUANG He-qing1 (1.School of Life Sciences, The Center for Environmental Science Research, Xiamen University ,Xiamen 361005,China; 2.Department of Chemical and Biological Engineering, Sanming College, Sanming 365000,China;  3.Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005,China) Received: Jul.,21,2003  Key word：MALDI-TOF; mass spectrometry; insulin; nanoparticle; stability  Abstract: Sodium alginate and chitosan extracted from the halobios were selected as packaging materials of nanoparticles of the human insulin nanoparticles, respectively. Matrix-assisted laser desorption ionization /time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry was used to study the processes of packaging and releasing of the insulin and its stability in the different basic and acidic mediums from the sodium alginate nanoparticles .    (本文编辑:张培新)   

MALDI-TOF质谱技术研究胰岛素海藻酸钠纳米粒特性

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