以蓝斑背肛海兔(Notarchus Leachii cirrosus Stimpson,NLCS)为实验材料,研究NLCS经人工海水净化前后,NLCS各器官组织中有机态(结合态)/无机态(游离态)重金属含量相对比值及变化趋势,提出组织细胞中的有机态/无机态重金属比值参数,适合于监测流动海水中各类重金属污染程度及危害性的看法.实验结果发现,NLCS受铜盐污染后,海兔器官组织内的有机态/无机态重金属的比值应低于0.85;受Cd、Pb和Ag盐分别污染后,NLCS各器官组织中的有机态/无机态的Cd、Pb和Ag相对含量比值,分别为1.43~1.55、1.47~2.05和1.78~1.89;金属Mn的安全比值很高,但它的阈值却低于10.21.NLCS各器官组织中有机态/无机态重金属相对比值可作为连续监测流动海水中重金属污染程度及危害性的新颖标志参数,它比选用直接分析动植物及微生物机体中总金属含量作为评价环境污染程度的经典分析法,更为科学且合理,并具有潜在的应用前景

冯丽剑

卓慧钦

黄河清

黄琳

Xiamen University Institutional Repository

第 48 卷  第 3 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol. 48 No. 3 2009 年 5 月 Journal of Xiamen U niversity ( Natural Science) May 2009 器官组织中有机态/无机态重金属比值作为评价海水污染程度的标志物研究冯丽剑,黄  琳,卓慧钦,黄河清*(厦门大学生命科学学院,福建 厦门 361005)  收稿日期: 2008-10-07基金项目:国家自然科学基金( 40776060)资助* 通讯作者: h qh uan g@x mu. edu . cn摘要: 以蓝斑背肛海兔( Notar chus Leachii cir rosus Stimpson, NLCS)为实验材料, 研究 NLCS 经人工海水净化前后,NLCS 各器官组织中有机态(结合态) /无机态(游离态)重金属含量相对比值及变化趋势, 提出组织细胞中的有机态/无机态重金属比值参数,适合于监测流动海水中各类重金属污染程度及危害性的看法.实验结果发现, NLCS 受铜盐污染后,海兔器官组织内的有机态/无机态重金属的比值应低于 0. 85; 受 Cd、Pb 和 Ag 盐分别污染后, NLCS 各器官组织中的有机态/无机态的 Cd、Pb和 Ag相对含量比值, 分别为 1. 43~ 1. 55、1. 47~ 2. 05 和 1. 78~ 1. 89; 金属 Mn 的安全比值很高,但它的阈值却低于 10. 21. NLCS 各器官组织中有机态/无机态重金属相对比值可作为连续监测流动海水中重金属污染程度及危害性的新颖标志参数,它比选用直接分析动植物及微生物机体中总金属含量作为评价环境污染程度的经典分析法,更为科学且合理, 并具有潜在的应用前景.关键词: 重金属;无机态; 有机态;环境污染; 比值;监测中图分类号: X 13      文献标识码: A      文章编号: 0438-0479( 2009) 03-0441-05  如何连续监测流动水体中的重金属盐和有机毒物危害性及其污染源形成与迁移规律一直是环境科学研究非常关注的问题之一[ 1]. 目前,针对流动水体中重金属盐污染程度的监测技术可分为理化监测和生物监测.常用的理化监测方法有原子吸收光谱( AAS)、电感耦合等离子体质谱( ICP-M S)、质子激发 X 射线荧光光谱( P IXE)以及分光光度法等. 它们具有快速、高灵敏度的特点, 但是需要定期取样,而且只能反映瞬时的局部的污染状况, 无法反映多种污染物的各种复杂作用(如协同、拮抗作用等)所造成的生态毒性效应.生物监测是指利用水生生物个体、种群和群落的数量、性质、健康状况、生理特性等的变化或通过化学分析法直接定性、定量监测受污染生物个体的器官和组织中重金属盐污染程度[ 2- 3], 但难于区分组织细胞内有机态或无机态重金属分布情况和规律, 从而限制了科学地评价流动水体各类重金属盐及其对生物体所产生的危害性,尤其是针对单一器官的毒害程度.在细胞内, 重金属盐可分为无机态和有机态, 并表现出不同毒性. 重金属与生物活性蛋白或多肽结合后的有机态毒性最大, 但至今尚未建立相关且完善的评价体系.本文采用超速离心结合 ICP-M S分析技术,研究蓝斑背肛海兔在人工海水净化前后, 各主要器官中有机态和无机态重金属盐的比值和变化规律,并筛选出可作为评价流动海水中重金属污染程度及危害性的潜在比值指标. 该方法比直接测定动物器官组织内总重金属含量且作为监测污染程度的经典分析技术更为科学、合理;并能真实地反映该区域在单位时间段内,重金属污染程度及其危害性. 至今,相关的研究尚未见详细的研究报道.1  材料与方法1. 1  仪器设备与试剂仪器设备: 电感耦合等离子体质谱仪( ICP-M S,型号 DRC-e, 美国 PE 公司产品) ; 微波消解系统(型号MARS5) ;超速冷冻离心机( Beckman,美国) .试剂和材料: 硝酸(分析纯) ; 人工海水配方: 1 L水中含 NaCl 28 g, M gCl2 # 6H 2O 5 g , KCl 0. 8 g,CaCl2 # H 2O 1. 2 g , 试剂均为分析纯. 蓝斑背肛海兔( NLCS)捕获于福建省厦门市内海浅滩区域. 每只海兔净重在 100~ 150 g 之间,海兔属于雌雄同体软体动物,在实验过程中不存在性别差异性.1. 2  方  法1. 2. 1  样品制备取 10 只未经净化的 NLCS, 迅速解剖且分离NLCS 的肝、肌肉、神经节和心脏组织作为污染组样品.另取 10只经无污染海水净化 3 d后的 NLCS作为净化组,并获取各组织作为净化组样品.将污染组和净化组的各组织剪成碎块后, 直接研磨成浆液(约为 5min) ,随后,将浆液直接转移到 1. 5 mL 离心管中, 以12 000 r/ m in 的转速,离心 5 m in, 取上清液.用 Brad-ford方法测定各组织浆液的总蛋白浓度, 根据总蛋白质含量不同,调整各组织上清液总体积为同一恒定体积( 5. 0 mL) . 以 800 000 @ g 速度离心各组织上清液30 min,收集上清液和沉淀物(蛋白质和核酸等) .所收集的样品均转移到 6 mL 容量瓶内,添加 HNO 3溶液,最终定容为 6. 0 mL.对已定量的上清液和沉淀样品进行微波消解. 消解条件为: 在 0~ 15 min 内,消解温度升至 180 e , 消解功率 1 200 W,消解时间 10 m in. 样品消解后,再定容至 25 mL, 备用.1. 2. 2  ICP-MS分析将待测的 Cu、Cd、Pb、A g、Mn 元素标准溶液稀释成 20, 40, 80 Lg/ L 梯度浓度, 绘制标准曲线. ICP-M S测量重金属浓度后再换算为每克蛋白的重金属含量,所有数据采用 Excel软件分析.2  结果与讨论2. 1  海兔肝和肌肉中重金属的含量与分布各种重金属在海洋生物各器官中的累积量与分布趋势均存在差异性, 尤其是肝脏.虽然多数动物的肝脏只占动物组织质量的 6% ~ 10% ,却承担机体内 80%以上的 Ag、Cd等重金属的代谢途径, 其它重金属元素占 40% ~ 80% [ 4] . ICP-M S技术分析表明,重金属在海兔肝中积累量相对较高, 变化趋势与前人的研究报道较为相似[ 5- 7], 累积顺序为 Cu > M n> Ag> Pb > Cd(图 1A) . 图 1A 结果指出, 海兔肝内的 Cu 总量异常高,但海兔在人工海水中净化后,其肝脏内的 Cu含量明显降低.其他重金属 Mn、A g、Pb 和 Cd 也均有类似降低现象,但变化规律稍微不同于净化前,累积顺序为Cu> A g> M n> Pb> Cd(图 1B) ,即 A g 含量相对高于Mn的含量.这一现象说明了实验海兔在捕获前曾生活在重金属 Cu、Mn 和 A g 污染程度较为严重的海域内,同时说明海兔肝内重金属含量高低是随着环境含量变化而增减, 仅通过测定海兔器官中总重金属含量并不适合作为连续监测流动水体中污染程度及危害性的评价指标.如果环境只引起无机态重金属在器官内的大量释放或积累, 而对有机态重金属的影响很小,会使评价结果与生态环境对生物体的实际危害产生较大差异,并得出不太科学的结论.为了了解海兔其他器官组织重金属含量及分布规 图 1  各元素在肝脏的总含量A.净化前; B. 净化后F ig . 1  Total content o f different elements in liv er 图 2  各元素在肌肉的总含量A.净化前; B. 净化后F ig . 2  Total content o f different elements in muscle律是否有类似于肝脏的情况,本文选用海兔肌肉为研究对象,分析净化前后该肌肉中重金属的含量及其分布(图 2) .前人实验结果指出, 几种鲤鱼的肌肉组织中积累的重金属顺序是 Cu> M n> Pb> Cd[ 8 - 9] ,从图2A中可看出, 海兔肌肉中重金属累积顺序为 Cu> Ag>Mn> Pb> Cd, 净化后肌肉中重金属累积趋势保持不变,这与肝脏的变化趋势略不相同. 由此可见,采用直接测定动物器官内重金属总含量作为评价环境污染程度的方法还存在许多缺陷.值得一提的是,净化后肌肉组织中 Cd的含量反而略有所上升(图 2) ,其结果与岩鱼 Sebastes schleg el i 对 Cd的积累规律一致, 当环境中 Cd浓度较低时,肌肉组织中积累的 Cd含量在净化期反而上升[ 10],这可能与其特殊的代谢途径有关.2. 2  海兔神经和心脏中重金属的含量与分布图 3结果表明, 重金属在神经组织的累积顺序是Cu> Mn> Ag> Pb> Cd(图 3A) , 净化后累积顺序是Cu> A g> Pb> Mn> Cd(图 3B) . 净化后,海兔神经组织中的Cd释放变化很小,这说明在神经组织内的Cd,多数以有机态 Cd形式存在. 净化后, 海兔神经组织中的 Pb含量不仅未降, 反而略微上升.据报道, 鱼净化#442# 厦门大学学报(自然科学版)                   2009 年 图 3  各元素在神经系统的总含量A.净化前; B. 净化后F ig . 3  To tal content of different elements in nerv e sys-tem后,它的神经组织中的 Cd和 Ag 含量反而上升,但 Pb含量却不变[ 11], 推测神经组织与 Cd和 Ag 的络合能力较高,并形成不可逆释放, 在净化过程中, 随着处理时间的推移,该神经组织进一步络合净化系统中的超微量 Cd和 Ag ,从而略微提高神经组织中的 Cd和 Ag总含量.这些实验结果进一步阐明, Cd、Pb和 Ag 的毒性较高不仅与它们难于代谢有关, 而且与不可逆络合于神经组织和其他器官有关.分析神经组织和其他器官中的有机Cd、Pb和 Ag 含量高低作为评价污染源污染程度及危害性比采用被人们普遍认可的总金属高低的评价体系更加科学且合理.据报道,软体动物心脏中 Cu来源于血液, 它是通过含有 Cu的血蓝质来运输氧气的. 在章鱼心脏内发现重金属的累积顺序是 Cu> M n> Pb [ 12- 13] .在中华鳄鱼心脏内重金属累积顺序也是 Cu> M n> Pb> Cd[ 7] .本文中海兔心脏中重金属的累积顺序是 Cu> M n>Ag> Pb> Cd(图 4A) , 净化后重金属的累积趋势保持不变(图 4B) .纵观肝脏、肌肉、神经和心脏 4大组织的分析结果发现它们对重金属的累积规律并不相同. 这说明通常采用直接测定动物器官内重金属总含量作为评价环境污染程度和重金属危害性可能缺乏科学性.2. 3  有机态和无机态重金属含量比值的变化规律由于重金属在体内的存在形式不同因而所表现出的毒性不一样, 如果有机态重金属含量相对较高, 所产生的毒性也随之提高.在无污染区域中,海生动物器官中的有机态/无机态重金属比值通常较为稳定,只有生活在重金属污染区域中, 该比值随着污染源不同而变化.图 5结果表明, 在肝脏组织中 B 所显示的比值明显比 A 低, 可见净化后有毒性的有机态重金属比无机 图 4  各元素在心脏的总含量A.净化前; B. 净化后F ig . 4  Total content o f different elements in hear t态释放得快,这与之前在肝脏中发现的重金属总累积量变化规律一致,即总含量降低将导致有机态/无机态的比值降低.肌肉组织中 B的总含量比 A的总含量除Cd外都降低了, 这与有机态/无机态的比值变化恰好一致.神经和心脏中也有相同的变化规律(图 5) . 显然,如果发现海洋动物器官组织中的有机态/无机态重金属比值,在净化前后一样或者反而略微上升,这说明该海洋区域,有关重金属污染程度较低,而且对海洋动物所产生的危害性较低. 反之, 如果该比值下降,这说明该区域重金属污染较为严重且对海洋动物产生一定的危害性.能够找到净化前后比值不变或略微下降的一个值作为一个评价指标非常有意义. 表 1 中 Cu 的比值在肝脏中为 0. 85, 是最低的, 而且在净化后比值降低,这是一个解毒过程, 说明生理比值应该是低于0. 85, Cd的生理比值是 1. 43~ 1. 55, Pb 的生理比值是1. 47~ 2. 05, Ag 的生理比值是 1. 78~ 1. 89,本文中Mn的比值都很高,对机体的危害很大,它的生理比值应该是一个低于 10. 21的值,有关这方面的数据还有待进一步补充.表 1 净化前重金属在不同组织中有机态/无机态的比值 Tab. 1 The ratio o f or ganic t o ino rg anic in different tissuespr e-depuration组织 Cu Cd Pb  Ag  Mn 肝  0. 85 | 0. 19 2. 05 | 8. 48 | 10. 21 |肌肉 6. 76 | 1. 43 11. 95 | 5. 14 | 24. 59 |神经 5. 16 | 2. 16 | 1. 47 1. 78 65. 79 |心  3. 61 | 1. 55 | 0. 94 1. 89 | 27. 65 | 注: / | 0表示净化后比值降低, 此比值是有害的.随着对有机态重金属在器官内与活性物质结合后对机体造成严重危害的深入认识, 人们认为仅从重金#443#第 3 期        冯丽剑等:器官组织中有机态/无机态重金属比值作为评价海水污染程度的标志物研究 图 5 4 大组织中有机态/无机态重金属的比值A. 净化前; B.净化后Fig . 5  The rat io of o rg anic to ino rg anic heavy metals in four tissue属总量来评价环境会忽略一些重要现象, 例如当总量变化不明显或者降低,但是有机态/无机态重金属的比值却升高了.如果采用以有机态与无机态重金属比值作为评价指标, 可起到早发现和早采取必要措施以避免产生更大的危害的作用.显然,本文所建立的分析技术和重金属污染程度的评价指标(标志物) , 不仅新颖且有潜在的应用价值.参考文献:[ 1]  Kow alkow ski T , Gadza a-Kopciuch M , Kosobucki P. 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Bull Environ Contam T ox icol, 1980, 24 ( 1) : 783 -788.Ratio of Organic to Inorganic Heavy Metals as a Potential Biomarker inOrganic Tissues for Evaluating Pollution Level in SeawaterFENG L-i jian, H UANG Lin, ZHUO Hu-i qin, HUANG H e-qing*( School of L ife Sciences, X iamen U niversit y, X iamen 361005, China)Abstract: The exper imental materials of Notar chus L eachii cir r osus St impson ( NLCS) w ere treated w ith depurated seaw ater.Then the r elativ e ratio and variation tr end o f org anic ( combined fo rm) to inorg anic ( disasso ciated form) heavy metal content in var-ious o rg anic tissues of NLCS w ere revealed and compared, r espectively. Results indicate that these ratio par amet ers ar e f it for monito-r ing and evaluating var ious heavy metals for br inging bo th pollution level and cr isis in flow ing seawat er. T he exper imental results in-dicated that the r atio o f o rg anic to ino rganic heavy metals in t he var ious o rg anic tissues of NLCS was lower than 0. 85 in t he contam-ination seaw ater of copper chlo ride. M oreover, another r elativ e ratios such as 1. 43~ 1. 55 ( Cd) , 1. 47~ 2. 05 ( Pb) , and 1. 78~ 1. 89( Ag ) of o rganic to inor ganic heavy metals wer e found in the var ious org anic t issues o f NLCS w hile contaminated with Cd, Pb, and Agsalts, r espectiv ely. Though the safe ratio of metal Mn showed relat ive high, its liminal v alue was low er than 10. 21. The relativ e r atiovalues of or ganic to inor ganic heavy melts in var ious org anic t issues o f NLCS w ere novel biomarker s. They can be used to monito r thecont am inat ion lev el of heavy metals and cr isis in the flowing seaw ater continuously . It is obvious that this approach is more accur ateand science than t hat o f typical analytical methods such as to tal metal content in cell, animal, plant , micr oo rg anism as previously de-scribed. So t his appro ach has the pot ential in application.Key words: heavy metal; ino rg anic fo rm; or ganic form; environmental pollution; ratio; monitor#445#第 3 期        冯丽剑等:器官组织中有机态/无机态重金属比值作为评价海水污染程度的标志物研究

器官组织中有机态/无机态重金属比值作为评价海水污染程度的标志物研究

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