选用丙酮沉淀法和直接裂解法分别提取离蓝斑背肛海兔(Notarcus leachii cirrosusStimpson,NLCS)口腔神经节(Buccal Ganglion,BG)全蛋白质,发现采用直接裂解法所获得BG蛋白质种类多于丙酮沉淀法.在第一向等电聚焦电泳(IEF)中,分别选用pH为3.0~9.0,4.0~6.0和5.0~8.0的载体两性电解质,发现载体两性电解质pH范围为5.0~8.0时分离效果最好.使用Melanie 4 Trial软件统计BG蛋白质斑点数目约为290点,适于开展BG蛋白质组学研究

朱斌琳

翁露娜

陈东仕

颜利

黄河清

Xiamen University Institutional Repository

第 47卷  增刊 22008年 12月厦门大学学报 (自然科学版 )Journal o f X iam en Un iversity ( N atura l S cience)Vo.l 47 Sup. 2Dec. 2008    收稿日期: 2008-09-15  基金项目:国家自然科学基金 ( 40776060)资助  * 通讯作者: hqhuang@ xm u. edu. cn提取与分离方法影响海兔口腔神经节蛋白质组的 分 离 效 果朱斌琳, 陈东仕, 翁露娜, 颜  利, 黄河清*(厦门大学 生命科学学院, 生物化学与生物技术学系, 福建 厦门 361005)摘要: 选用丙酮沉淀法和直接裂解法分别提取离蓝斑背肛海兔 (N otarcus leachii cirrosus Stim pson, NLCS)口腔神经节( Bucca l Gang lion, BG )全蛋白质, 发现采用直接裂解法所获得 BG蛋白质种类多于丙酮沉淀法. 在第一向等电聚焦电泳( IEF )中, 分别选用 pH 为 3. 0~ 9. 0, 4. 0~ 6. 0和 5. 0~ 8. 0的载体两性电解质, 发现载体两性电解质 pH 范围为 5. 0 ~8. 0时分离效果最好.使用 M elanie 4 T r ia l软件统计 BG蛋白质斑点数目约为 290点,适于开展 BG蛋白质组学研究.关键词:蓝斑背肛海兔; 蛋白质组; pH; 优化提取与分离中图分类号: Q 51     文献标识码: A     文章编号: 0438-0479( 2008) S2-0096-04  海兔属于雌雄同体类的软体动物. 海兔中枢神经系统 ( Centra lNervous system, CNS)主要由口腔神经节( Buccal Gang lion, BG )、大脑神经节 ( Cerebra l Gang l-ion, CG)、胸膜与足部神经节 ( P leura-l Pedal Gang lion,PLG /PDG)、腹神经节 ( Abdom ina l Gang lion, AG )和神经连索等部位组成[ 1]. 蓝班背肛海兔 ( NLCS)的 CNS与其他多数海兔不同之处在于缺乏 AG[ 2 ]. 从进化角度考虑, NLCS是否比其他海兔更高等些至今尚未清楚. BG主要的生理功能是产生口腔肌肉运动, 舌头伸缩, 调控食道蠕动以及嗉囊收缩等一系列生理功能[ 3].近期,作者曾采用基质辅助激光解吸电离化飞行时间 (MALD I-TOF)质谱技术研究杂斑海兔 (Ap lysia ju-liana Quoy& Gaimard )和美国加洲海兔 ( Ap ly sia cali-forn ia )的 CNS神经连索外表层多肽过程中, 发现两者均含有丰富的多肽组成, 部分多肽表现出转移现象[ 4].林庆梅等采用 MALDI-TOF质谱技术研究海兔大脑神经节超微量多肽内切酶和酸性多肽产物, 解释酶解途径与和规律[ 5]. 陈东仕等采用裂解和超声破碎法分离提取 NLCS的 BG蛋白质组,供双向凝胶电泳分离与蛋白质鉴定, 统计出每块胶板中具有 300个蛋白质斑点数,并对部分蛋白质进行组成鉴定[ 1].如何有效提取与分离海兔 CNS全蛋白质是开展蛋白质组学的重要实验步骤,开展相关研究潜在着重要的科学意义.本文选用厦门 NLCS的 BG为研究材料,选用不同提取方法和的载体两性电解质 pH研究影响海兔口腔神经节蛋白质组分离效应, 其实验结果和分析技术可为今后深入开展海兔 CNS蛋白质组的组成、结构与功能奠定良好基础,尤其在学习和记忆机理方面.1 材料与方法1. 1 材  料NLCS捕获于福建省厦门市集美区内海浅滩区域. 每只海兔净质量约为 200 g.丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺、二硫苏糖醇 ( DTT)、四甲基乙二胺 ( TEMED )、过硫酸铵 ( APS)、硫脲、甘氨酸、十二烷基磺酸钠 ( SDS )、NON IDETP-40 ( NP-40 )、CHAPS均购自上海生工; 载体两性电介质 ( pH = 3. 0~ 9. 0, pH = 5. 0~ 8. 0, pH = 4. 0~ 6. 0)购自北京军事医学科学院; SDS分子量标准购自 Ferm entas公司.1. 2 方  法取海兔 20只,按每只海兔体质量注入等体积的氯化镁溶液 ( 28mmo l/L ) . 待海兔组织软化后,迅速在解剖镜下,分离海兔 BG,并用去离子水清洗 BG 3次, 以清除其表面盐分和杂质,收集于 0. 5 mL的离心管中,置于 4 e 冰浴中, 备用.直接裂解法提取海兔 BG全蛋白: 取海兔 BG, 加入裂解液 ( 7 mol /L尿素, 4% CHAPS, 2mo l/L硫脲, 60mmo l/L DTT, 10 mmo l /L Tris, 1 mmo l/L EDTA, 0. 5%Ampho line, 0. 000 2%溴酚蓝 ) 300 LL, 匀浆后超声震荡 5m in.再离心 35 m in ( 4 e , 100 000 g ) , 取上清液.增刊 2 朱斌琳等:提取与分离方法影响海兔口腔神经节蛋白质组的分离效果 # 97 #丙酮沉淀法提取海兔 BG全蛋白: 参考詹怿婕报道的方法[ 5].BG蛋白质组双向电泳分离和银染等实验条件均参考文献 [ 1, 5]. 选用不同的载体两性电解质优化分离 BG蛋白质组,并采用 Melanie 4 Trial软件统计凝胶上的蛋白质斑点数目.2 结果与讨论2. 1 不同提取方法的比较优化提取细胞或组织中全蛋白质组是开展蛋白质组学的关键步骤之一[ 6]. 丙酮法是蛋白质组学研究过程中常见的蛋白质沉淀法之一, 目前相当数量的蛋白质组学研究论文均采用丙酮沉淀法[ 7-8]. 图 1A是 BG样品经丙酮沉淀和裂解液处理后, 所获得的双向凝胶电泳图谱.图 1B是 BG样品直接采用裂解液处理后,所获得的双向凝胶电泳图谱.采用 Invest igatorHT D a-tabase软件对这两张图谱进行比对分析后, 发现图 1A所显示的蛋白质斑点数目比图 1B的一半还略低些(图 1A为 103个斑点,图 1B为 245个斑点 ), 而且多数蛋白斑点染色较浅,表明这些斑点所对应的蛋白质含量较低.从图 1A中还可看出, 蛋白质斑点主要分布在 pH 5. 0~ 8. 0之间, 多数蛋白质斑点 (亚基类型 )分子量在 25~ 116 ku之间,其多数蛋白质等电点属于弱酸、中性和弱碱性范围.参考图 1A结果,图 1B显示稍微不同于图 1A的实验结果, 其中蛋白质斑点数目不仅增多, 而且分子量范围涵盖于 18~ 140 ku之间. 图1A和图 1B蛋白质斑点分布的共同点在于两者多数斑点主要分布在 pH 5. 0~ 8. 0之间,也均属于弱酸、中性和弱碱性蛋白质.由此来看,采用直接裂解法优于丙酮沉淀法加裂解法, 丙酮沉淀法不适合 BG全蛋白组提取.为证实 BG全蛋白质亚基等电点分布情况及规律是否与载体两性电解质的 pH 范围有关, 作者拟采用不同 pH的载体两性电解质研究 BG全蛋白质分布.2. 2 优化上样蛋白量优化上样蛋白质量是提高蛋白质组分辨率和可进行蛋白质鉴定操作性的关键性因素之一.过高和过低上样蛋白量均影响到对蛋白质鉴定的效果,前者因蛋白质浓度过高,引起蛋白质斑点过大,而影响到蛋白质分辨率和取样,易造成人为污染;后者因蛋白质浓度偏低,蛋白质斑点显色不清晰,直接影响到取样和监测灵敏度.此外, fmo l级的低丰度蛋白质分离与提取是目前开展蛋白组学研究的难题之一, 目前国内外只有少数实验室能够达到这一水平. 要满足 BG蛋白质组分析的要求,必须使用高分辨率的电泳方法和高灵敏度的染色方法.提高上样量,是改善低丰度蛋白分离与检测的有效措施之一,但是上样量过高,其它高丰度蛋白质含量也随着增大,使蛋白质显色斑点直径增加,覆盖低丰度蛋白质斑点,不利于有效分离与鉴定低丰度蛋白质.如果选择银染法, 其上样量均在 50~ 100 Lg左右,具有低上样量特点. 经反复尝试发现 BG上样量中的蛋白质浓度为 2. 0 mg /mL时, 采用银染法, 最佳蛋白质提取液上样量为 60 Lg时, 可获得最佳的蛋白质分辨率.2. 3 不同 pH载体两性电解质的选择作者分别选用 pH 为 3. 0 ~ 9. 0、pH 4. 0~ 6. 0和pH 5. 0~ 8. 0的载体两性电解质分别制成不同 pH梯度的 IEF胶条, 并以相同凝胶浓度的 SDS-PAGE作为第二向的 2D-PAGE方法,按照文献 [ 1]所描述的实验步骤进行分离, 并获得不同分离效果和分辨率的 BG的 2D-PAGE图谱,其结果如图 2、3、4所示.  图 1  NLCS的 BG全蛋白质双相凝胶电泳图谱  A. 丙酮沉淀法 +直接裂解法; B. 直接裂解法  F ig. 1 2D-PAGE map of who le BG prote ins in NLCS# 98 # 厦门大学学报 (自然科学版 ) 2008年  图 2是选用载体两性电解质为 pH 3. 0~ 9. 0的双向凝胶电泳图.从图中可以看出,位于弱酸和弱碱区域内的蛋白质斑点很少,主要集中在 pH 5. 0~ 8. 0范围内,即说明了 BG蛋白质亚基等电点均属于中性或稍偏弱酸性.蛋白质斑点分子量涵盖范围位于 15~ 130ku之内, 显示出较高的分辨率和含有少量高丰度蛋白质斑点.如果不考虑蛋白质斑点数目偏少等的因素,图2结果适合于开展蛋白质鉴定工作.图 2 BG全蛋白质双向凝胶电泳图谱 ( pH 3. 0~ 9. 0)F ig. 2 2D-PAGE m ap of who le prote ins in BG ( pH 3. 0 ~9. 0)图 3是选用载体两性电解质为 pH 4. 0 ~ 6. 0的2D-PAGE图.比较图 2结果,第一向 IEF胶条 pH范围明显缩小,限制在 4. 0~ 6. 0范围内, 其目的想进一步提高中性及弱酸性蛋白质的分辨率, 为进一步鉴定 BG全蛋白质组提供可行性分离条件. 但从图 3中可以看出,尽管第一向 IEF胶条的 pH范围缩小, 但仍然无法改善在弱酸区域中的蛋白质着色斑点. 推测可能 BG缺少弱酸性蛋白质亚基.此外, 蛋白质斑点区域仍然主要位于中性区,部分小分子蛋白质斑点已丢失,并显示出比图 2更多的高丰度蛋白质斑点. 相对而言,图 3的蛋白质斑点分辨率明显低于图 2结果, 不太适合进一步开展蛋白质组学研究或进行蛋白质结构鉴定[ 6-7].进一步优化表明,选择载体两性电解质为 pH为 5. 0~ 8.0的第一向 IEF分离,可获得最为理想的 2D-PAGE图谱.比较图 2和 3,作者发现, 采用直接裂解法,相同蛋白上样量和相似的分离条件情况下, 选用胶条为 pH5. 0~ 8. 0作为第一向 IEF分离可获得最为理想的蛋白质分辨率, BG全蛋白质较为均匀分布于 pH 5. 5~7. 5范围内,其中蛋白质斑点分子量涵盖范围在 15~150 ku之间. 采用 Melanie 4 Trial软件统计图 4中的蛋白质斑点数目约为 290个, 与陈东仕等[ 1]报道的结果极为接近, 其蛋白质分布情况也很相似. 显然图 4的2D-PAGE的胶板中的蛋白质斑点具有较高的分辨率,其蛋白质斑点数目很可能接近 BG实际全蛋白质的数目,适合于开展 BG蛋白质组学以及结构与功能的研究.建立理想分离细胞及组织全蛋白质的条件,将为出色完成蛋白质组学研究奠定可行性基础.近几十年来, 国内外许多神经科学家认为, 海兔CG多肽与蛋白组的组成、分布、结构与功能与海兔学习与记忆有着密切的联系.海兔 CNS一直是神经分子生物学研究过程中常用的比对模型, 其主要原因在于它的 CNS相对简单、易分离和细胞易定位, 尤其细胞数目和细胞内蛋白质种类少于其他海洋动物等特点[ 9-10 ].这些实验现象和结果, 为进一步证实本论文研究结果真实性和科学性提供了参考信息.参考文献:[ 1] 陈东仕,黄河清, 吴韩志, 等.优化分离与鉴定蓝斑背肛海增刊 2 朱斌琳等:提取与分离方法影响海兔口腔神经节蛋白质组的分离效果 # 99 #兔口腔神经节蛋白质组 [ J]. 高等学校化学学报, 2006,27: 1257- 1261.[ 2] 林庆梅, 黄慧英, 黄河清, 等.质谱技术研究海兔大脑神经节超微量多肽内切酶和酸性多肽产物 [ J]. 分析化学,2006, 34: S96- S99.[ 3] H umm on A B, HuangH Q, KelleyW P, e t a .l A novel phro-hrmone process site in Ap lysia californica: L eu-Leu rule [ J].J Neuro chem, 2002, 82: 1398- 1405.[ 4] 黄河清, L im W on-Suk, 林庆梅. MALD I-TOF质谱技术研究海兔神经连索外表层的多肽组成 [ J]. 海洋科学,2004, 28: 53- 57.[ 5] 詹怿婕, 陆永进, 黄河清. 海兔大脑神经节蛋白质组优化分离与鉴定 [ J]. 厦门大学学报: 自然科学版, 2006, 45:S198- S201.[ 6 ] S im pson R J, e t a .l P ro te ins and proteom ics: a labo ra torym anua l[ M ]. Co ld Spring H arbor, N ew Y rok: Cold spr ingH a rbo r Labo ra to ry P ress, 2003: 1- 39.[ 7] Zhu J Y, H uang H Q, Bao X D, et a .l Acute tox ic ity pro fileof cadm ium revea led by proteom ics in brain tissue o fParalich-thy s olivaceus[ J] . AquaticTox ico logy, 2006, 78: 127- 135.[ 8] TangH Y, A l-i Khan N, E chan L A, e t a.l A novel four-d-im ensional stra tegy comb in ing pro tein and peptide separa tionm e thods enab les de tection of low-abundance pro teins in hu-m an p lasm a and se rum pro teom es [ J]. P ro teom ics, 2005, 6:780- 785.[ 9] L loyd P E, Conno lly C M. Sequence o f pdal peptide: a nove lneuropeptide from the centra l nervous system ofAp ly sia [ J].J Neuro sc,i 1989, 9: 312- 317.[ 10] W ang Y, P r ice D A, Sah ley C L. Iden tification and charac-teriza tion o f a m yom odulin- like peptide in the leech [ J].Peptides, 1998, 19: 487- 483.Effect of Both Extraction and Separation on Separation Effect ofProteome from the BuccalGanglion ofAplysiaZHU B in-lin, CHEN D ong-sh,i W ENG Lu-na, YAN L,i HUANG H e-qing*( D epartm en t of B iochem istry and B iotechnology, School of L ife Sciences, X iam en Un iver sity, X iam en 361005, Chin a)Abstract: The to tal pro tein s of buccal gang lion from Ap ly sia w ere extracted by ace tone precipitation or direct ly sis. The resu lts show ed th atmore prote ins could be obtained on the 2D-PAGE m ap by the latter approach. The carr ier ampho lytes of pH range 3. 0~ 9. 0, 4. 0~ 6. 0,and 5. 0~ 8. 0w ere used in IEF respective ly, it show ed that the best separation effect could be obtained in pH range of 5. 0~ 8. 0. And thereare approx mi ate ly 290 spo ts in the ge,l these perfect datum ind icated that th is approach descr ibed here w as suit for do ing research about pro-teom ics.Key words: Ap lysia; proteom e; pH; optmi ized ex traction and separation

提取与分离方法影响海兔口腔神经节蛋白质组的分离效果

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/54056/%e6%8f%90%e5%8f%96%e4%b8%8e%e5%88%86%e7%a6%bb%e6%96%b9%e6%b3%95%e5%bd%b1%e5%93%8d%e6%b5%b7%e5%85%94%e5%8f%a3%e8%85%94%e7%a5%9e%e7%bb%8f%e8%8a%82%e8%9b%8b%e7%99%bd%e8%b4%a8%e7%bb%84%e7%9a%84%e5%88%86%e7%a6%bb%e6%95%88%e6%9e%9c.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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