以枯草桿菌分泌生產腸病毒71型VP1蛋白之部份表位片段及評估此表位片段對BALB/c小鼠之免疫效果

Enterovirus 71 (EV71) is the main causative agent of Hand, Foot and Mouth Disease (HFMD) and is associated with severe neurological diseases resulting in high mortalities. Currently, there is neither vaccine nor therapeutic treatment available. The significant increase in recent EV71 epidemic throughout the Asia-Pacific region was clinically observed recently. Bacillus subtilis is a Gram-positive, facultative anaerobic rod-shaped endospore-forming bacterium that occurs naturally in soil and water. It has been used in the production of fermented food, extracellular enzymes as well as special chemicals. Some strains of B. subtilis are exploited as probiotics or biological control agents. In the field of genetic engineering, B. subtilis has been developed as a host for the production of homologous and heterologous proteins. This study developed an effective vaccine by transforming the partial genes of VP1, VP1e and VP1f into Bacillus subtilis. VP1 is a coat protein of EV71 and considered as potent epitope; VP1e is the N-terminal sequence of VP1 (amino acid is 1-81) and VP1f is the hydrophilic sequences fusion (amino acid are 95-109, 162-170, 210-221 and 266-274). In this study, we first generated a Bacillus subtilis secretory production system to produce the VP1e and VP1f epitope protein, high level of recombinant protein was expressed and secreted. Then, vaccination with recombinated protein VP1e, VP1f, or combined VP1e, VP1f and rLZ8 who administered to Balb/c mice. The VP1-specific serum IgG1 and IgG2a were examined. The VP1-specific serum IgG antibody induced by VP1e triggered both IgG subtype responses, indicating that Bacillus subtilis expressing VP1e was successful and high efficiency as vaccine. This study not only demonstrates the feasibility of using Bacillus subtilis secetory system as vaccine producer, but also suggests the probability of enterovirus vaccine development using VP1e as potent epitope.腸病毒重症屬於台灣第三類法定傳染病，為亞太地區地方性的流行疾病；其中腸病毒71型最易引起手足口病與神經系統等相關嚴重併發症而導致高致死率，且目前並無任何有效的疫苗可供預防和治療。枯草桿菌（Bacillus subtilis）為GRAS（generally recognized as safe）級菌種，此菌之產業應用性極為廣泛，可運用於發酵食品之製造、酵素及特用化學品之生產、作為益生菌（probiotic）及作為植物病害防治試劑等用途；此外亦被開發成為生產同源或異源蛋白質的基因表現宿主。 本實驗以腸病毒71型之外鞘膜上主要抗原決定部位VP1 作為目標，利用枯草桿菌分泌生產其所含之表位蛋白並增進其產量；而疫苗蛋白之一為設計融合經文獻佐證具致免疫性的四段親水性序列片段（VP1 序列胺基酸95-109、162-170、210-221、266-274），以及本實驗室先前已構築出之N端表位蛋白序列VP1e（VP1 序列胺基酸1-81），並將兩者聯合靈芝免疫調節蛋白進行動物實驗檢測其疫苗效果，觀察小鼠的抗體產生情形。結果顯示，VP1e 抗原蛋白可成功誘發腸病毒71型的VP1 特異性抗體，且IgG1 與IgG2a 皆有相同結果；本研究開發出高產量之枯草桿菌分泌生產系統，可用以生產腸病毒71型之抗原表位蛋白VP1e，且該蛋白質極具有疫苗發展之潛力。中文摘要i 英文摘要ii 壹、 前言1 一、 枯草桿菌之簡介1 二、 免疫系統之簡介2 (一) 免疫系統概述2 三、 疫苗之簡介3 (一) 預防接種的定義3 (二) 疫苗分類3 四、 腸病毒簡介4 (一) 疾病概述4 (二) 分類與致病性5 (三) 流行病學6 (四) 傳染方式8 (五) 潛伏期8 五、 腸病毒71型分子構型與疫苗設計原理8 (一) 病毒分子學8 (二) 疫苗設計9 六、 靈芝免疫調節蛋白11 貳、 實驗緣起與目的13 參、 實驗策略14 肆、 材料與方法15 一、 菌種與質體15 (一) 菌種15 (二) 質體16 二、 藥品和試劑17 (一) 藥品相關資訊17 (二) 培養基18 三、 質體DNA 抽取方法18 (一) 大腸桿菌質體抽取19 (二) 枯草桿菌質體抽取19 四、 染色體DNA 抽取方法19 (一) 枯草桿菌染色體抽取19 五、 DNA 分子生物操作技術20 (一) DNA 分子電泳20 (二) DNA 分子剪切20 (三) DNA 分子回收20 (四) PCR 產物回收21 (五) DNA 分子黏合21 六、 聚合酶連鎖反應21 (一) VP1 全長序列之增幅22 (二) VP1e N端序列之增幅22 七、 電勝任細胞（electrocompetent cell）製備及電轉形條件22 (一) 大腸桿菌22 (二) 枯草桿菌23 八、 轉形株篩選與重組質體確認23 (一) 菌落聚合酶鏈鎖反應23 (二) 重組質體確認24 九、 表現載體構築流程24 (一) VP1全長序列表現質體pNW33NVP1之構築24 (二) VP1全長序列表現質體pSECS7VP1之構築24 (三) VP1全長序列表現質體pSECS7VP1h之構築25 (四) VP1全長序列表現質體pOAVP1之構築25 (五) VP1e N端序列表現質體pSLYSPVP1e之構築25 (六) VP1f 親水性序列表現質體pSLYSPVP1f之構築26 十、 重組蛋白之表現、偵測與純化濃縮26 (一) 胞內重組蛋白VP1 之處理26 (二) 胞外分泌重組蛋白之處理28 十一、 質譜分析（Mass Spectrometer）與蛋白質身份鑑定31 (一) 質譜分析樣品製備31 (二) 蛋白質身份鑑定樣品製備31 十二、 實驗動物致免疫模式32 (一) 小鼠分組與飼32 (二) 介入方式與血液樣本取得32 (三) 特異性抗體偵測33 (四) 統計分析34 伍、 結果與討論35 一、 大腸桿菌誘導型系統之VP1全長序列生產35 二、 枯草桿菌分泌表現系統載體之構築35 (一) VP1 全長序列質體35 (二) 部份表位片段質體37 三、 VP1 部份表位片段蛋白之分泌表現38 (一) N端序列蛋白VP1e 分泌表現系統38 (二) 親水性序列蛋白VP1e 分泌表現系統39- 四、 質譜分析與蛋白質身份鑑定結果39 (一) VP1e 蛋白質譜分析39 (二) VP1e 蛋白質身份鑑定40 五、 連續式純化系統建立40 六、 疫苗效能分析與探討41 (一) 介入期間小鼠體重變化41 (二) 測定特異性抗體誘發結果41 陸、 結論43 柒、 參考文獻93 捌、 附錄10

Identification of soluble proteins and corresponding genes from early developing anther that differentiate normal and heat-tolerant tomato lines

根據前人的研究，花粉母細胞形成發育期或番茄開花前7-15天，對高溫最為敏感並導致高落果率。因此為了鑑定出在高溫逆境下與番茄著果率提昇有關之蛋白質體，我們利用亞蔬中心所提供耐熱番茄 (Solanum lycopersicum, formerly Lycopersicon esculentum) 品系CL5915與不耐熱品系L4783，藉由控制二品系間生長溫度之差異（熱逆境30/25℃與一般生長環境25/20℃），在雄蕊發育早期利用蛋白質體學技術分析可溶性蛋白質，比較並扣除共有之遺傳背景之蛋白質後，將二品系間具有差異的可溶性蛋白質篩選出來，並進一步利用LC-ESI MS/MS進行蛋白質身份鑑定。經由此研究，成功地找出多個具有高度差異性的蛋白質，在功能分析及歸納整理之後，挑選了其中兩個蛋白質glyoxalase I和3beta-hydroxysteriod dehydrogenase，設計degenerative primer，並利用RACE技術將上述2種蛋白質在二種番茄品系中的完整基因序列定出。發現基因序列上的改變可精確地解釋，何以造成蛋白質pI與分子量大小在二品系之間的差異。According to previous study, developing anther 7-15 days before anthesis in tomatoes was the most sensitive period to high temperature which causes a low fruit set. In order to identify the proteins which are responsible for the better fruit set in heat-tolerant variety than in heat-sensitive one, we used two dimensional electrophoresis systems to separate isolated proteins from developing anther and looked for the proteins up-/down-regulated in heat-tolerant variety. In doing so, two selected cultivars, CL5915, the heat-tolerant, and L4783, the heat-sensitive, were grown at the same time in a phytotron at both 30/25℃ and 25/20℃. The proteins isolated from developing anthers of heat-tolerant variety grown in 30/25℃, were subtracted to remove the common genetic background. The resulting populations of proteins were considered as induced protein positive to heat stress. Using LC-ESI MS/MS, several proteins were identified, including glyoxalase I and 3beta-hydroxysteriod dehydrogenase. Degenerative primers were designed and RACE technique was applied to obtain the complete gene sequences of the two-mentioned proteins from heat-sensitive and heat-tolerant tomatoes. I found substitution of nucleotides of both proteins can explain accurately the changes in isoelectric point and molecular weight of these two proteins.第一章 緒 論 1 壹、 引言： 1 貳、 研究策略： 2 第二章 材料與方法 4 實驗材料 4 壹、 番茄品系： 4 貳、 番茄栽種： 4 參、 雄蕊收集： 4 實驗方法 5 壹、 番茄雄蕊蛋白質萃取與保存： 5 貳、 PF2D： 9 參、 TRADITIONAL 2D： 12 肆、 蛋白質降解： 16 伍、 濃縮純化質譜分析的蛋白質樣品： 18 陸、 質譜資料搜尋與分析： 19 柒、 基因釣取： 21 捌、 基因分析： 25 第三章 實驗結果 28 壹、 耐熱及不耐熱品系栽植情形與差異： 28 貳、 PF2D分析： 28 參、 2DE分析、蛋白質身份鑑定： 29 肆、 基因釣取與分析： 31 第四章 討論 34 壹、 PF2D結果討論： 34 貳、 候選蛋白質文獻搜尋與探討： 36 參、 可行之策略： 42 第五章 參考文獻 43 圖表 49 圖一、HPCF分析圖譜 50 圖二、HPRP分析圖譜及二維電泳模擬圖 52 圖三、MALDI-TOF MS分析結果 53 圖四、二維電泳膠圖 54 圖五、MASCOT軟體分析之分數分佈圖 55 圖六、MASCOT搜尋結果-PROTEIN VIEW 56 圖七、MASCOT搜尋結果-PEPTIDE VIEW 57 圖八、二維電泳膠圖 58 圖九、二維電泳膠圖 59 圖十、二維電泳膠圖 60 圖十一、GLYOXALASE I基因序列及胺基酸序列分析 61 圖十二、3beta-HSD之RACE結果 62 圖十三、3beta-HSD基因序列及胺基酸序列分析 64 表一、蛋白質點質譜鑑定結果整理及功能歸納表 65 表二、GLYOXALASE I及3beta-HSD專一引子序列表 66 附錄 試劑配方與補充資料 67 壹、 番茄雄蕊蛋白萃取與保存： 67 貳、 PF2D前置作業： 69 參、 TRADITIONAL 2D： 69 肆、 TRYPSIN DIGESTION： 72 伍、 濃縮純化質譜分析的蛋白質樣品： 74 陸、 基因釣取： 74 柒、 基因分析： 75 捌、 MASCOT軟體分析結果： 75 玖、 酵素作用路徑： 80 壹拾、 3beta-HSD之蛋白質結構： 8

室內空氣污染物特性、所致健康影響及其控制研究─室內生物性氣膠之採樣分析技術開發(1/2)

嗜肺性退伍軍人菌(Legionella pneumophila)為一重要之室內生物氣膠，主要 透過空氣傳播感染人體，而傳統微生物培養之評估法有其限制存在，因此本研究 欲透過對L. pneumophila 蛋白質體分析，嘗試瞭解L. pneumohphila 在不同生長階 段下存在之特殊蛋白及其生理意義。 研究發現培養24 小時處於指數生長期，可培養菌數對數值由3.94 ± 0.10增加至6.24 ±0.04 ，培養48 及72 小時處於停滯生長期，可培養菌數對數值分別為8.28 ±0.13 及8.43 ± 0.14 。不同生長階段之蛋白質總數表現不同，由指數 生長期進入停滯生長期隨著營養來源侷限影響，蛋白質總數有逐漸增加之趨勢， 24 小時、48 小時及72 小時分別為 282 點、336 點及357 點。質量足夠進入質譜 分析之蛋白質點共完成56 點蛋白質身份鑑定，其中包括flagellin protein 顯示菌 體受到環境壓力刺激移動力及毒力特性的表現。Legioenella pneumophila is an important indoor bioaerosol. It can be transmitted by airborne to the human. The present study was aimed to explore the protein profile and related physiological functions at different growth stages using proteomic technique. It was noted that, the log culturable concentration (Log CFU/mL) of L. pneumophila was from 3.94 ± 0.10 to 6.24 ± 0.04(24 th hr) at the exponential phase, 中文摘要 嗜肺性退伍軍人菌(Legionella pneumophila)為一重要之室內生物氣膠，主要 透過空氣傳播感染人體，而傳統微生物培養之評估法有其限制存在，因此本研究 欲透過對L. pneumophila 蛋白質體分析，嘗試瞭解L. pneumohphila 在不同生長階 段下存在之特殊蛋白及其生理意義。 研究發現培養24 小時處於指數生長期，可培養菌數對數值由3.94 ± and continuously raised to 8.28 ± 0.13(48 th hr) and 8.43 ± 0.14(72 nd hr) at the stationary phase. Besides, the expressive protein numbers were gradually increased: 282 protein spots at exponential phase, followed by early stationary phase (336 spots) and stationary phase (357 spots). It might be related to the nutrient deprivation with increased microbial quantity. So far, 56 proteins have been identified. The increased existence of flagellin protein indicated the nutrient-stressed environment may induce L. pneumophila to enhance its motility and virulence

Expression and purification of recombinant human trefoil factor 1 by Escherichia coli and Lactococcus lactis

Digestive system damages are common problems in people who lived in a stressful life. Mucosal defense in gastrointestinal tract includes local gastric mucosal defense mechanisms and neurohormonal regulation. The surface epithelial cells secrete mucus, bicarbonate and generate prostaglandins, heat shock proteins, trefoil factor peptides (TFFs), and cathelicidins to defense or regulate the mucosal damages. The TFFs mediate mucosal repair by stimulating cell migration, inhibiting apoptosis and inflammation, and promote the barrier function of mucus. In this study, attempts of expressing recombinant human trefoil factor 1 (TFF1) by well known Escherichia coli and GRAS Lactococcus lactis were proceeded. In the first part of this study, a novel recombinant human TFF1 gene was designed according to the preferred codons of L. lactis. Then the recombinant human TFF1-expressing plasmids were constructed. The recombinant human TFF1-expressed plasmids for L. lactis including constitutive pNZDSASm-sacBATFF1, and nisin-inducible pNZNS-sacBATFF1 and pNZNUB-TFF1. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)-indicible pET-sacBATFF1 and pET-TFF1 are the recombinant human TFF1-expressed plasmids of E. coli. Owing to the unstable expression of L. lactis system, the optimized recombinant human TFF1 was purified from fermented E. coli BL21(DE3) transformants and the purified recombinant human TFF1 was identified by native-PAGE, Western blot, and peptide fingerprinting. The bioactivity of recombinant human TFF1 was analyzed by wound healing assay of C2BBe1 cell (clone of Caco-2 cell). Results showed that the recombinant human TFF1 exhibited reclosing up wound of C2BBe1 cell monolayer and could be improved is increased by adding few FBS. The recombinant human TFF1, treated with modified gastrointestinal pH, pH 2.4 and pH 7.0 buffer showed that the recombinant human TFF1 is more active after pH 2.4 treatment. Results suggest that the acidic environment in stomach might be benefitial to active conformation of recombinant human TFF1.現代人生活壓力大，消化系統不適已經成為普遍的問題之一，導致腸胃發炎、潰瘍、甚至演變為腫瘤。腸胃道黏膜防禦包含局部的黏膜防禦機制與系統性神經調控，而消化道表皮細胞會分泌黏液、HCO3-並生產前列腺素、熱休克蛋白、三葉因子與一些抗菌胜肽修護受損的表皮組織。其中三葉因子可以藉由刺激細胞移行、抑制細胞自殺與發炎，以維持黏膜屏障功能。 本研究嘗試以熟知的大腸桿菌及食品級乳酸鏈球菌表現重組人類第一型三葉因子，首先設計並合成最佳化密碼子之新穎性基因，分別構築重組人類第一型三葉因子之表現質體。乳酸鏈球菌表現重組人類第一型三葉因子之質體包含持續型之pNZDSASm-sacBATFF1，以及以乳酸鏈球菌素誘導之pNZNS-sacBATFF1與pNZNUB-TFF1質體；大腸桿菌使用之表現質體則是以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導之pET-sacBATFF1與pET-TFF1質體。由於乳酸鏈球菌之系統表現再現性不高，選用大腸桿菌發酵誘導表現、取菌體之可溶部份純化重組人類第一型三葉因子，可得到0.719 mg/L rTFF1及1.766 mg/L rSTFF1之產量，並經由原態蛋白質電泳、西方墨點及蛋白質身份鑑定確認蛋白質具有單體及雙體結構。最後利用細胞傷口癒合試驗觀察重組人類第一型三葉因子之生物活性，結果顯示重組人類第一型三葉因子具有對於人類結腸癌表皮細胞傷口癒合之效果，且可藉由添加低量胎牛血清提高細胞傷口癒合速度。進一步以pH 2.4與pH 7.0模擬腸胃道之pH環境測試重組人類第一型三葉因子之pH穩定性，由結果可知儲存於pH 2.4之重組人類第一型三葉因子的細胞傷口癒合活性明顯較佳(P < 0.05)，推測胃中酸性環境可能有利於重組人類第一型三葉因子之構形及活性。中文摘要 i Abstract ii 壹、前言 1 一、大腸桿菌的特性及其應用 1 二、大腸桿菌表現系統之簡介 1 (一)啟動子(promoter) 2 (二)分泌途徑(secretion pathway) 4 三、乳酸菌的特性及其應用 6 四、乳酸鏈球菌表現系統之簡介 7 (一)啟動子(promoter) 8 (二)訊息胜肽(signal peptide) 9 五、消化系統傷害 10 六、三葉因子之簡介 11 壹、實驗緣起與目的 14 叁、實驗策略 15 肆、材料與方法 16 一、菌種、質體與細胞株 16 (一)菌種 16 (二)質體 16 (三)細胞株 18 二、實驗中使用之引子 18 三、實驗使用之儀器、藥品與試劑 18 四、質體DNA之抽取 19 (一)大腸桿菌質體DNA之抽取 19 (二)乳酸鏈球菌質體DNA之抽取 19 五、重組人類第一型三葉因子表現載體之構築 20 (一) pNZDSASm-sacBATFF1 20 (二) pNZNS-sacBATFF1 20 (三) pNZNUB-TFF1 21 (四) pET-sacBATFF1 21 (五) pET-TFF1 21 六、質體構築中運用到之分子生物操作技術 22 (一)聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR) 22 (二) DNA分子電泳 22 (三) DNA分子之限制酶剪切 22 (四) DNA分子之膠體回收 23 (五) PCR產物之回收 23 (六) DNA分子黏合反應 24 七、電勝任細胞之製備與電轉形條件 24 (一)大腸桿菌 24 (二)乳酸鏈球菌 25 八、轉形株之挑選 25 九、重組質體之確認 26 十、重組人類第一型三葉因子於宿主中之表現 26 (一)大腸桿菌誘導表現 26 (二)乳酸鏈球菌持續表現 26 (三)乳酸鏈球菌誘導表現 27 (四)乳酸鏈球菌上清液蛋白質樣品處理 27 (五)乳酸鏈球菌菌體蛋白質樣品處理 27 十一、蛋白質偵測 27 (一) Tricine-SDS-PAGE蛋白質電泳 27 (二)西方墨點法 28 (三)蛋白質純化 28 (四) Native-PAGE蛋白質電泳 29 十二、重組第一型三葉因子於大腸桿菌宿主中小型發酵生產及純化濃縮 29 (一)小型發酵生產重組人類第一型三葉因子 29 (二)蛋白質純化與濃縮 30 (三)蛋白質定量 30 十三、蛋白質身份鑑定 30 十四、人類第一型三葉因子之細胞活性測定 31 (一) C2BBe1細胞株解凍 31 (二) C2BBe1細胞株繼代 31 (三) C2BBe1細胞株保存 32 (四)細胞計數 32 (五)蛋白質樣品製備 32 (六)細胞傷口癒合試驗 32 伍、結果與討論 34 一、重組人類第一型三葉因子基因全長合成 34 二、大腸桿菌表現重組人類第一型三葉因子 34 (一) pET-sacBATFF1質體構築 34 (二) pET-TFF1質體構築 34 (三)誘導溫度對於重組人類第一型三葉因子表現的影響 35 (四)重組人類第一型三葉因子表現位置 35 三、乳酸鏈球菌表現人類重組三葉因子 36 (一) pNZDSASm-sacBATFF1質體構築 36 (二) pNZNS- sacBATFF1質體構築 37 (三) pNZNUB-TFF1質體構築 37 (四)持續表現重組人類第一型三葉因子 38 (五)誘導表現重組人類第一型三葉因子 39 四、以大腸桿菌小型發酵生產重組人類第一型三葉因子 39 (一)發酵過程生長參數 39 (二)發酵產量 40 (三)蛋白質身份鑑定 40 五、重組人類第一型三葉因子之細胞活性 42 (一)重組人類第一型三葉因子對細胞傷口之癒合效果 42 (二)不同pH值對重組人類第一型三葉因子細胞傷口癒合效果之影響 43 陸、結論 44 柒、參考文獻 115 捌、附錄 14

Effect of acute heat stress on the liver protein expression in L2 strain Taiwan country chickens

熱緊迫是熱帶和亞熱帶地區家禽業者經濟損失的主要原因之一，會導致雞隻生長性能表現變差，免疫力受抑制及死亡率增高。目前已知熱緊迫可誘發產生活性氧族群引起氧化損傷，如脂質過氧化和氧化損傷、蛋白質和DNA的損傷。本研究目的在探討急性熱緊迫對公雞的肝臟蛋白質的表現，作為了解雞隻熱緊迫反應機制之基礎。以蛋白質體學方法比較有無熱緊迫處理雞隻肝臟蛋白質之表現量差異。本試驗使用十二隻國立中興大學育成之45週齡L2品系台灣土雞，處理組雞隻接受38℃熱緊迫處理4小時，對照組雞隻保持在25℃。處理組雞隻在熱緊迫後分別於25℃恢復0小時、2小時、6小時，採集肝臟組織進行蛋白質分析。每個樣品分別取400μg總蛋白質進行三重複之雙向電泳分析，電泳後之膠體以colloidal Coomassie blue染色，並以Melanie 7軟體進行蛋白質定量分析，差異表現之蛋白質點以胜肽質量指紋分析進行身份鑑定。結果顯示在所有定量的241個蛋白質點中有35個蛋白質點之表現量在熱緊迫處理組與對照組間具顯著差異(P<0.05)，其中13個蛋白質點在熱緊迫恢復過程中表現量上升，12個蛋白質點在熱緊迫恢復過程中表現量下降，10個蛋白質點在熱緊迫恢復過程中表現量呈現變動的狀態，胜肽質量指紋分析成功鑑定全部蛋白質點之身份，分別屬於30個不同的蛋白質；經gene ontology分析後可知，此等蛋白質主要來自細胞質(46%)、粒線體(20%)及細胞膜(17%)；在生物過程方面，熱緊迫處理後之差異表現肝臟蛋白質主要參與代謝過程(30%)、含氮化合物代謝過程(23%)、刺激反應(14%)以及參與氧化還原過程(10%)；在分子功能方面，肝臟經熱緊迫處理後之差異表現蛋白質主要具有轉移酶(23%)、氧化還原酶活性(20%)、水解酶活性(13%)、運輸功能(13%)、蛋白質結合(10%)以及裂解酶活性(7%)等分子功能。綜合本研究結果可知，在急性熱緊迫後差異表現雞隻肝臟蛋白質多與脂質代謝、刺激反應、氧化還原及分子運輸有關；此等差異表現蛋白質可能影響受熱緊迫雞隻之肝臟功能，然其確切生理意義仍有待進一步研究。Heat stress is one of the most important impacts associated with economic losses in poultry industry in tropical and subtropical countries. It causes poor growth performance, immunosuppression, and high mortality. It is now known that heat stress can induce the formation of reactive oxygen species and cause oxidative injury, such as lipid peroxidation and oxidative damage to proteins and DNA. Chickens are characterized for their high core body temperature implying that there may be different mechanisms for the liver to maintain normal function under such a high temperature. This study aimed to evaluate the effect of acute heat stress on protein expression in livers of roosters. A group of nine 45-wk-old L2 strain Taiwan country chickens were kept at 38°C for 4 h and another three were kept at 25°C as a control group. After acute heat stress, liver samples were collected for protein analysis after 0, 2, and 6 h of recovery. A total of 400 μg soluble proteins were subjected to proteomic analysis. A total of 241 protein spots were quantified and there were 35 protein spots differentially expressed after acute heat stress with expression ratio higher than 1.5. The expression of 13 protein spots upregulated, 12 protein spots downregulated, and 10 protein spots fluctuated in the liver of acute heat-stressed roosters during recovery. The identities of 35 differentially expressed protein spots were identified and belong to 30 unique proteins. Gene ontology analysis revealed that most of the differentially expressed proteins located in cytoplasm (46%), mitochondrion (20%), and membrane (17%); in biological processes, the differentially expressed liver proteins mainly involved in metabolism (30%), nitrogen compound metabolism (23%), response to stimulus (14%), and involved in oxidation-reduction process (10%); in molecular functions, the differentially expressed proteins mainly has transferase activity (23%), oxidoreductase activity (20%), hydrolase activity (13%), transporter activity (13%), protein binding (10%), and lyase activity (7%). In summary, the differentially expressed liver proteins after acute heat stress were asociated with liver lipid metabolism, response to stimuli, oxidation-reduction process and molecular transport. These differentially expressed proteins may affect the liver function of acute heat stressed chickens. However, their exact physiological relevance requires further studies.中文摘要…………………………………………………………………………………I 英文摘要………………………………………………………………………………...II 目錄…………………………………………………………………………………….III 表次…………………………………………………………………………………….VI 圖次……………………………………………………………………………………..V 壹、 前言…………………………………………………………………………….......1 貳、 文獻探討 一、雞隻溫度調節……………………………………………………………………2 二、高溫對雞隻生長與繁殖之影響…………………………………………………3 (一) 採食量及飼料消耗量 (二) 生理反應 三、高溫對雞隻生理與代謝之影響…………………………………………………6 四、肝臟結構和功能與熱緊迫之反應之關係…………………………………….10 (一) 肝臟之功能 (二) 肝臟熱緊迫反應 五、肝臟蛋白質體與熱緊迫對肝臟蛋白質表現的影響…………………………...22 六、研究目的………………………………………………………………………..24 參、 材料與方法 一、藥品來源 ……………………………………………………………………….25 二、實驗動物、處理方式及樣品採集…………………………………………….25 三、雞隻肝臟蛋白質樣品備置與定量……………………………………………………………… 26 (一) 肝臟蛋白質樣品製備 (二) 蛋白質濃度測定 四、蛋白質二維電泳分析與影像分析 …………………………………………….26 (一) 等電聚焦電泳 (二) 十二烷基硫酸鈉-聚丙醯胺凝膠電泳分析 (三) 蛋白質電泳膠片染色與掃描 (四) 蛋白質電泳膠片影像分析 五、蛋白質身份鑑定 ……………………………………………………………….28 (一) 蛋白質點膠體內消化與胜肽萃取 (二) 質譜分析 (三) 資料庫搜尋與蛋白質身份鑑定 六、差異表現蛋白質點之生物功能分析…………………………………………...29 七、西方免疫吸漬分析……………………………………………………..30 八、統計分析……………………………………………………………………….30 肆、 結果……………………………………………………………………………… 31 伍、 討論 .……………………………………………………………………………..47 陸、 結論……………………………………………………………………………… 55 柒、 參考文獻 ………………………………………………………………………...5

Characterization and Application of Sex-Specific Proteins on Porcine Sperm (1/2)Production and Functional Characterization of Antibody (1/2)Progeny Test

預選子代性別之相關生物技術具有鉅大之產業經濟價值。迄今尚無有效、方便且安全分離XY 精子之方法可以用來早期擇選子代性別。利用X-及Y-精子細胞膜蛋白之差異則可發展出成本低、準確性高、侵害性低及易操作之免疫篩選法；但相關報告極微。本實驗室應用Ohno』s law，以哺乳動物之性特異性蛋白(sex-specific membrane proteins,SSMPs) 較其他non-SSMPs 在演化上具高度保留性為基礎理論，進行X、Y 精子表面特異性蛋白(SSMPs) 篩選，以期做為X、Y 精子分離之基準。先以豬精子細胞膜蛋白作為抗原，進行雌雄兔性別差異免疫法以產生相對應抗體。再利用酵素連結免疫吸附分析法(ELISA) 監測抗體揚升，之後分別以雌雄兔產生的抗體對豬精子細胞膜蛋白進行西方墨點法(Western blotting) 分析。接續應用雌雄兔產生的抗體製備性別特異性親和管柱，通入豬精子細胞膜蛋白，進行性特異性蛋白之純化，共進行三次的純化步驟。初步純化之SSMPs 經一維電泳分析於分子量13.6 及72.2 kD 處可見特異蛋白(n=3)。進一步運用高解析度之二維電泳(two-dimensional electrophoresis) 配合西方墨點法嘗試偵測出相關SSMPs，結果雄兔抗體能成功辨識出經純化三次之特異X 精子表面抗原（分子量約102 kDa）。應用親和性管柱一次純化後所得到的蛋白質經過二維泳及鍍銀染色後，發現在公兔抗體管柱部份偵測到40 個點，母兔抗體管柱則有84 個點，其中又有20 個蛋白點是具重覆性的。進一步比對結果發現在公兔抗體管柱得到的蛋白質有10 個點是母兔抗體管柱所未存化出的，同樣的在由母兔抗體所得到的蛋白質有15 個點是公兔抗體管柱沒有的。接續利用質譜儀MALDI-TOF MS 來進行蛋白質身份鑑定。公兔抗體管柱所得到的蛋白質中進行了7 個點的分析，有一個點是hemoglobulin；母兔抗體管柱方面分析了27 個點得到hemoglobulin、myoglobulin、heat shock protein、ATP synthetase。總計有29 個點不存在於資料庫，而這未些辨識出之點可能為未被發現之精子性特異蛋白(NSC 93-2313-B-005-068 project report)。本次計劃於第一年度將進一步進行SSMPs 胺基酸序列分析(N-terminus 及LC MS/MS) 並生產抗合成胺基酸之抗血清；第二年將進行抗血清對預選子代性別效果之評估。相關研究將為免疫法篩選X 及Y 精子之可行性提供了正面的成果；後續技術的研究及開發則深具臨床醫學應用價值

Toward the Molecular Mechanisms of Heavy Metal Transport in Mera Transgenic Chlorella: Blue-Native Page and Patch Clamp Approach

有些重金屬離子是生物體所必須的物質，因為這些重金屬離子參與體內許多生化反應，影響生長與發育。對微生物、藻類或植物而言，可經由水與土壤中吸收一些微量的必需重金屬離子。但許多工業廢棄物卻造成可怕的重金屬污染，經由植物或微生物的吸收與累積，經由食物鏈的傳播，間接造成人體的傷害。所以，解決水與土壤重金屬污染成為相當重要的課題。有鑑於此，我們以蘇力菌的merA 基因(其基因產物汞離子還原.能催化Hg2+還原成Hg0)，轉入單細胞小球藻Chlorella sp DT，並成功篩選出可清除無機汞的merA 轉殖小球藻。但是意外發現這些merA 轉殖小球藻對其他的重金屬有不同的耐受性。雖然已知藻類或植物對二價重金屬鎘(Cd2+)、銅(Cu2+)、汞(Hg2+)、鉛(Pb2+)等較易吸收且積聚，但是這些重金屬離子吸收的途徑與積聚之機制卻不明瞭。因為不同物種，有不同的重金屬吸收途徑和不同的耐受性。為了期許merA 轉殖小球藻能協助土壤復育工作，我們希望建立merA 轉殖小球藻之重金屬運輸機制、重金屬誘導氧化壓力的調控、重金屬壓力逆境訊號傳遞之模式系統。本研究計畫將著重利用Blue-Native PAGE 分析重金屬運輸機制之運輸蛋白，並建立Patch-Clamp 測定離子運輸之電流電位關係模式：(1) 應用「葉綠素螢光」技術測定二價Cd2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等重金屬對小球藻「光合作用」之抑製作用，來評估其重金屬耐受性濃度。(2) 應用蛋白質體分析技術之「Blue-Native PAGE」，分析細胞膜上運輸蛋白組成，研究Cd2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等重金屬處理之後，可能參與其中或交互反應的運輸蛋白。(a) 首先，備製小球藻原生質體。(b) 再者，利用非離子性介面活性劑將膜蛋白溶解出來。(c)以一維凝膠電泳Blue-Native (BN) PAGE 或Colorless-Native (CN) PAGE 分離細胞膜蛋白，可利用酵素活性染色。續以二維凝膠電泳BN-PAGE 或SDS-PAGE 分析，用coomassieblue 或sliver stain 染色。(d) 比較其他藻類已知之細胞膜或其他胞器(例如液泡等)之運輸蛋白。(f) 評估其他離子運輸蛋白的交互作用。(3) 應用生物資訊。利用質譜儀(mass spectrometry)可作更詳細的蛋白質身份鑑定。應用生物資訊工具，比對運輸蛋白與已知基因序列的對應關係。(4) 建立Patch-Clamp 技術，測定單一細胞K+電流電位關係模式，再測定Cd2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等電流電位關係，以瞭解其運輸離子動力模式

室內空氣污染物特性、所致健康影響及其控制研究─室內生物性氣膠之採樣分析技術開發(2/2)

嗜肺性退伍軍人菌(Legionella pneumophila)為一重要之室內生物氣膠，主要 透過空氣傳播感染人體，而傳統微生物培養之評估法有其限制存在，因此本研究 欲透過對L. pneumophila 蛋白質體分析，嘗試瞭解L. pneumohphila 在不同生長階 段下存在之特殊蛋白及其生理意義。 研究發現退伍軍人菌在營養環境下培養24 小時處於指數生長期，可培養菌 數對數值(log CFU/ml)由3.94 ± 0.10 增加至5.53 ± 0.24 ，培養至第48 及72 小 時處於停滯生長期，可培養菌數對數值分別為8.28 ± 0.13 及8.43 ± 0.14 ，其繁 殖增生週期為3 小時。當退伍軍人菌處於無營養提供之環境時，其在培養基上繁 殖增生的能力則會隨著時間的增加逐漸喪失，起始可培養之菌數濃度對數值8.16 ± 0.11 ，第20 天時已下降至2.51 ± 0.47 ，第35 天則完全喪失其在培養基上繁殖增生能力。蛋白質體分析發現不同生長階段之蛋白質數目表現不同，由指數生長期進 入停滯生長期隨著營養來源侷限影響，蛋白質總數有逐漸增加之趨勢，24 小時、 48 小時及72 小時分別為 282 點、336 點及357 點，另外，當退伍軍人菌處於無 營養提供之壓力環境下，隨著時間的增加蛋白質數目表現則呈現逐漸下降的趨 勢，由起始336 點，經過1 天即下降至290 點，至無培養能力階段第4 天及第 35 天則分別只剩258 點及253 點。 質量足夠進入質譜分析之蛋白質點共完成99 點蛋白質身份鑑定，其中發現 一退伍軍人菌之特殊重要蛋白Mip(macrophage infectivity potentiator)，為退伍軍 人菌得以進入宿主體內之毒力因子，且它不僅存在於營養階段，當退伍軍人菌處 於無營養的不良環境時，其表現量更是隨著時間而明顯增加，即使在無培養能力 之VBNC 階段，Mip 蛋白質量亦持續增加，不僅證明了VBNC 狀態的存在，亦 顯示了無法培養的退伍軍人菌具有明顯的侵犯宿主的能力。Legionella pneumophila is an important indoor bioaerosol. The transmission root of L. pneumophila is inhalation of contaminated aerosols. The traditional detection method—culture is encountered several limitations. The aim of this study is to explore the protein profile and related physiological functions at different growth stages using proteomic technique. The log culturable concentration (Log CFU/ml) of L. pneumophila was rasied from 3.94 ± 0.10 to 5.53 ± 0.24 at exponential phase, and continuously raised to 8.28 ± 0.13(48th hr) and 8.43 ± 0.14(72nd hr) at the stationary phase. The Log CFU/ml of L. pneumophila in non-nutrient condition was declined from 8.16 ± 0.11 to 2.51 ± 0.47 at 20th day, and loss its culturability at 35th day. In the proteomics analyze, the expressive protein numbers were gradually increased in nutrient condition: 282 protein spots at exponential phase, followed by early stationary phase (336 spots) and stationary phase (357 spots). However, the protein number was decreased in non-nutrient condition. It stared with 336 spots, declined to 290 spots at day 1st, and reduced to 258 spots and 253 spots at non-culturable day 4th and 35th. Among 99 identified proteins, an important protein—Mip (macrophage infectivity potentiator) which is related to infection was not only found in nutrient condition but also in non-nutrient condition. With the prolong starvation period, the expression of Mip protein was mounting. It represented the possibility of infection for non-culturable L. pneumophila

A study on the mammary gland and milk proteome of Hirudin transgenic sows

水蛭素(Hirudin)為一有效之凝血素(thrombin)抑制物，在止血作用(hemostasis)與血栓形成(thrombosis)扮演關鍵角色。水蛭素基因轉殖豬之產製將可生產重組水蛭素(recombinant Hirudin; rHirudin)供醫療應用。本研究之目的為分析豬隻乳腺與乳汁蛋白質體並評估水蛭素轉殖基因是否影響水蛭素基因轉殖母豬乳腺與乳汁蛋白質表現。乳腺與乳汁樣品採自分娩當天之水蛭素基因轉殖與非基因轉殖母豬，取均質後乳腺及脫脂後乳汁之可溶性蛋白質供雙向電泳分析，電泳膠片以colloidal Coomassie blue染色後掃描供影像分析或挖取蛋白質點供身份鑑定用。在乳腺樣品共挖取242個蛋白質點進行胜肽質量指紋分析，身份鑑定成功之172個蛋白質點分別屬於99個不同蛋白質，此等蛋白質可分類為下列功能群：能量路徑與代謝(25.3%)、蛋白質代謝(21.2%)、細胞生長與維持(15.2%)、運輸(12.1%)、免疫反應(9.1%)、細胞聯繫與訊息傳遞(9.1%)、核酸代謝與調節(3%)、細胞凋亡(2%)及未知功能蛋白質(3%)等。基因轉殖與非基因轉殖母豬乳腺蛋白質點以Melanie 3影像分析軟體進行定量，在所有定量分析的147個乳腺蛋白質點中有9個蛋白質點之表現量在基因轉殖與非基因轉殖母豬間具顯著差異(P<0.05)，其中在基因轉殖母豬乳腺表現量下降之蛋白質點為凝溶膠蛋白(gelsolin)及4個血紅素(hemoglobin) isoforms，表現增加之蛋白質點為異檸檬酸去氫酶1 (isocitrate dehydrogenase 1)、絲胺酸胜肽酶抑制物(serpin peptidase inhibitor)及2個未知身份蛋白質。在乳汁樣品共挖取293個蛋白質點進行身份鑑定，身份鑑定成功之140個蛋白質點分別屬於45個不同蛋白質，此等蛋白質可依功能分為免疫反應(31.1%)、運輸(28.9%)、蛋白質代謝(8.9%)、細胞聯繫與訊息傳遞(8.9%)、細胞生長與維持(8.9%)、能量路徑與代謝(4.4%)、核酸代謝與調節(2.2%)、細胞凋亡(2.2%)及未知功能蛋白質(4.4%)等。在所有定量的85個乳汁蛋白質點中有4個蛋白質點在基因轉殖與非基因轉殖母豬間具顯著差異(P<0.05)，其中在基因轉殖母豬乳汁表現下降的蛋白質點為血紅素結合蛋白(haptoglobin)及2個未知蛋白質，另1個在基因轉殖母豬乳汁表現量上升蛋白質點則為未知身份蛋白質。綜合以上，本研究已初步建立豬乳腺與乳汁雙向電泳蛋白質參考圖譜，定量分析發現在水蛭素基因轉殖與非基因轉殖母豬間乳腺與乳汁分別有9個與4個蛋白質點之表現差異顯著，此等差異表現蛋白質之確切生理意義及未知身份蛋白質點之身份仍有待進一步研究。Hirudin is a potent inhibitor of thrombin and plays a key role in hemostasis and thrombosis. Transgenic pigs carrying Hirudin gene have been generated for producing recombinant Hirudin in milk. The recombinant Hirudin will be applicable therapeutically. The purposes of this study were to analyze the porcine mammary gland and milk proteome and to evaluate whether Hirudin transgene affects the expression levels of mammary gland and milk proteins in Hirudin transgenic sows. Mammary gland and milk samples were collected from two Hirudin transgenic and two non-transgenic sows on the day of farrowing. Tissue samples were homogenized and soluble proteins were isolated for analysis. Milk proteins were collected after removing milk fat. Soluble proteins from mammary gland and milk samples were assayed by 2-DE and stained with colloidal Coomassie blue. Gels were scanned for further image analysis or subjected to excising protein spots for identification. In mammary gland, a total of 242 protein spots were subjected to peptide mass fingerprinting for identification. There were 172 protein spots corresponding to 99 different proteins were successfully identified. The identified proteins were categorized into functional groups of energy pathways/metabolism (25.3%), protein metabolism (21.2%), cell growth/maintenance (15.2%), transport (12.1%), immune response (9.1%), cell communication/signal transduction (9.1%), nucleic acid metabolism/regulation (3%), apoptosis (2%), and unknown function (3%). A total of 147 protein spots on all mammary gland 2-DE gels were quantified using Melanie 3 software. The levels of nine protein spots were significantly different between transgenic and non-transgenic sows (P<0.05). The down-regulated proteins in the mammary gland of transgenic sows were gelsolin and four isoforms of hemoglobin. Isocitrate dehydrogenase, serpin peptidase inhibitor and the other two unidentified protein spots were up-regulated in the mammary gland of transgenic sows. In milk, a total of 293 protein spots were subjected to identification. There were 140 protein spots identified and were corresponding to 45 different proteins. The identified proteins were categorized into functional groups of immune response (31.1%), transport (28.9%), protein metabolism (8.9%), cell communication/signal transduction (8.9%), cell growth/maintenance (8.9%), energy pathways/metabolism (4.4%), nucleic acid metabolism/regulation (2.2%), apoptosis (2.2%), and unknown function (4.4%). A total of 85 milk protein spots on all milk 2-DE gels were quantified. The levels of four protein spots were significantly different between milk from transgenic and non-transgenic sows (P<0.05). Haptoglobin and two unidentified proteins were down-regulated in milk from transgenic sows. The identity of the up-regulated protein in milk from transgenic sows remains unidentified. In summary, this study established 2-DE protein reference maps of porcine mammary gland and milk and found that there were nine mammary gland protein spots and four milk protein spots differed between Hirudin transgenic and non-transgenic sows, respectively. The exact physiological relevance of the differentially expressed proteins and the identities of those unidentified protein spots in transgenic pigs require further elucidation.壹、 前言 1 貳、 文獻探討 2 一、水蛭素之功能與應用 2 (一) 水蛭素之發現及萃取 2 (二) 水蛭素分子結構及功能 2 (三) 血栓相關疾病之探討 3 (四) 不同抗凝血劑治療血栓相關疾病效果之比較 7 二、醫藥用重組蛋白質之生產 8 (一) 以細胞培養系統生產重組蛋白質 8 (二) 以基因轉殖植物系統生產重組蛋白質 8 (三) 以基因轉殖動物系統生產重組蛋白質 9 (四) 應用重組蛋白質生產平台產製水蛭素 12 三、乳腺發育與泌乳生理 16 (一) 乳腺之結構與發育 16 (二) 乳汁合成及分泌 22 (三) 母豬泌乳生理 22 四、乳腺與乳汁之蛋白質體學研究 23 (一) 功能性基因體學與蛋白質體學簡介 23 (二) 不同時期乳腺基因與蛋白質體表現分析 27 (三) 乳汁蛋白質體之研究與應用 29 五、基因轉殖動物之蛋白質體分析 30 六、研究目的 32 參、 材料與方法 33 一、試驗動物來源、飼養管理及樣品採集 33 二、藥品來源 33 三、蛋白質樣品製備 34 (一) 乳腺蛋白質樣品製備 34 (二) 乳汁蛋白質樣品製備 35 (三) 蛋白質濃度測定 35 四、蛋白質雙向電泳分析與影像分析 35 (一) 等電聚焦電泳 35 (二) 十二烷基硫酸鈉-聚丙醯胺凝膠電泳分析 36 (三) 蛋白質電泳膠片染色與掃描 36 (四) 蛋白質電泳膠片影像分析 36 五、蛋白質身份鑑定 37 (一) 蛋白質點膠體內消化與胜肽萃取 37 (二) 質譜分析 37 1.基質輔助雷射解離飛行時間式質譜分析(MALDI-TOF MS) 37 2.基質輔助雷射解離二次飛行時間式質譜分析 (MALDI-TOF/ TOF MS) 38 (三) 資料庫搜尋與蛋白質身份鑑定 38 (四) 蛋白質功能性分類 39 六、豬乳腺與乳汁蛋白質體圖譜建立 39 七、水蛭素基因轉殖與非基因轉殖母豬乳腺及乳汁差異表現蛋白質之確認 39 八、統計分析 40 肆、 結果 41 一、 豬隻乳腺及乳汁蛋白質雙向電泳圖譜及蛋白質資料庫建立 41 (一) 豬乳腺蛋白質圖譜及資料庫 41 (二) 豬乳汁蛋白質圖譜及資料庫 41 二、 蛋白質之功能性分類 42 (一) 豬乳腺蛋白質之功能分類 42 (二) 豬乳汁蛋白質之功能分類 42 三、 水蛭素轉殖基因對母豬乳腺與乳汁蛋白質體之影響 43 (一) 水蛭素轉殖基因對豬乳腺蛋白質體之影響 43 (二) 水蛭素轉殖基因對豬乳汁蛋白質體之影響 43 四、 水蛭素基因轉殖與非基因轉殖豬乳腺及乳汁差異表現蛋白質之確認 43 (一) 水蛭素基因轉殖與非基因轉殖母豬乳腺差異表現蛋白質之確認 43 (二) 水蛭素基因轉殖與非基因轉殖母豬乳汁差異表現蛋白質之確認 44 伍、 討論 60 一、 豬乳腺及乳汁蛋白質雙向電泳圖譜及蛋白質資料庫之建立 60 二、 水蛭素轉殖基因對豬乳腺與乳汁蛋白質體之影響 61 (一) 水蛭素轉殖基因對豬乳腺蛋白質體之影響 61 (二) 水蛭素轉殖基因對豬乳汁蛋白質體之影響 63 陸、 結論 65 柒、 參考文獻 66 捌、 附錄 84 表 次 表1、以細胞培養與基因轉殖系統生產產物所需成本之比較 13 表2、常用於生產重組蛋白質物種之繁殖及泌乳性狀 15 表3、應用蛋白質體學技術與基因轉殖動物模式探討疾病發生機制之文獻 31 表4、水蛭素非基因轉殖與基因轉殖豬間乳腺差異表現蛋白質 51 表5、水蛭素非基因轉殖與基因轉殖豬乳腺差異表現蛋白質之身份鑑定 52 表6、水蛭素非基因轉殖與基因轉殖豬間乳汁差異表現蛋白質 56 表7、水蛭素非基因轉殖與基因轉殖豬乳汁差異表現蛋白質之身份鑑定 57 附表1、以胜肽質量指紋分析鑑定豬乳腺蛋白質身份之結果 85 附表2、以胜肽質量指紋分析鑑定豬乳汁蛋白質身份之結果 96 圖 次 圖1、重組水蛭素分子結構 5 圖2、抗凝血劑之抗凝血機制 6 圖3、基因轉殖動物之生產過程圖 10 圖4、不同生產重組蛋白質系統平台的相關特性 14 圖5、乳腺之形態學特徵 17 圖6、胚胎時期小鼠乳腺之發育 19 圖7、發身至退化期小鼠乳腺之發育 21 圖8、真核細胞組成示意圖 25 圖9、以質譜儀鑑定蛋白質為基礎之蛋白質體學研究流程 26 圖10、豬乳腺蛋白質之代表性雙向電泳圖譜 45 圖11、豬乳汁蛋白質之代表性雙向電泳圖譜 46 圖12、豬乳腺及乳汁蛋白質身份鑑定之結果 47 圖13、鑑定成功之豬乳腺蛋白質以生物程序進行功能註解及分類之結果 48 圖14、鑑定成功之豬乳汁蛋白質以生物程序進行功能註解及分類之結果 49 圖15、水蛭素非基因轉殖與基因轉殖母豬乳腺蛋白質圖譜比較 50 圖16、利用MALDI-TOF與MALDI-TOF/TOF鑑定編號G136乳腺蛋白質點身份 53 圖17、利用MALDI-TOF與MALDI-TOF/TOF鑑定編號G51乳腺蛋白質點身份 54 圖18、水蛭素非基因轉殖與基因轉殖母豬乳汁蛋白質圖譜比較 55 圖19、以西方免疫吸漬分析確認水蛭素非基因轉殖與基因轉殖母豬乳腺差異表現蛋白質 58 圖20、以西方免疫吸漬分析確認水蛭素非基因轉殖與基因轉殖母豬乳汁差異表現蛋白質 5

Determination of Storage Proteins in Sesame Seeds and Glycosylation of Pectin Methylesterase in Jelly Fig Achenes by Mass Spectrometry

質譜技術被廣泛應用於現今的蛋白質研究上，除了蛋白質身份鑑定外，也應用於蛋白質轉譯後修飾作用的分析，如:磷酸化、醣基化及雙硫鍵形成等。本論文研究主題分成兩部分，主要都是利用質譜技術。第一部份是鑑定芝麻種子中主要的儲存蛋白質(11S球蛋白與2S白蛋白)在聚丙烯醯胺膠體上的相對位置，目的在於標定出可能成為過敏原的儲存蛋白質在膠體上的位置，對於未來在診斷過敏原的判斷上有所助益。第二部分是要鑑定愛玉凝膠酵素上的醣基修飾位置以及醣基結構，目的在於進一步瞭解之後，對於未來在研究醣基化與酵素活性的關係有所幫助。 在第一部分中，利用3328筆芝麻種子表現序列標幟的序列資料庫中，發現四個11S球蛋白(兩個為新發現，兩個為實驗室已發現)及三個2S白蛋白(一個為新發現，兩個為實驗室已發現)的基因。然後在實驗室得到三個新發現的儲存蛋白質同功異構型之全長基因後，本研究工作則是利用12.5%與18%聚丙烯醯胺膠體分別清晰地將11S球蛋白與2S的白蛋白同功異構型在膠體上分開，再分別利用液相層析串聯質譜儀進行身分鑑定確定在膠體上的位置，所對應是何者同功異構型。 在第二部分中，根據實驗的研究結果，發現愛玉凝膠酵素具有醣基修飾。本研究工作則是利用基質輔助雷射脫附游離化質譜儀，鑑定出在第153個胺基酸-天門冬素為凝膠酵素的醣基修飾位置。利用串聯質譜儀，分析出凝膠酵素的醣基結構以含有木糖化、無核心岩藻糖化之甘露糖或複雜形式等結構存在，並用分子模型化模擬凝膠酵素的結構，發現醣基修飾位置在酵素活性位置的背面區域。Mass spectrometry has been nowadays extensively used in protein research, including protein identification, peptide sequencing and post-translational modification such as phosphorylation, glycosylation and disulfide bond formation. The present study consists of two parts, which were both mainly achieved by mass spectrometry. In the first part, the relative positions of major sesame seed storage proteins, 11S globulin and 2S albumin, were demarcated in SDS-PAGE. These proteins are potential allergens, and the designation thereof could be beneficial for the diagnosis of allergens in pertinent food products. In the second part, the glycosylation site and glycan structures of pectin methylesterase in jelly fig achenes are determined to provide a better understanding on the relation between glycosylation and enzymatic activity. In the first part, two gene families separately encoding four 11S globulin (two were newly found; two were formerly published) and three 2S albumin (one was newly found; two were formerly published) were identified from a database search of 3328 expressed sequence tag (EST) sequences. The full-length cDNA sequences of the new isoforms had been completed in our laboratory. In the present work, the four 11S globulin and three 2S albumin isoforms resolved in 12.5% and 18% polyacrylamide gels were confirmed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). In the second part, pectin methylesterase (PME) in jelly fig achenes has been detected as a glycoprotein previously. In the present work, the glycosylation site was identified to be at Asn153 of mature jelly fig PME by matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS). The major N-glycans released from native PME were identified as xylosylated, non-core fucosylated, pauci-mannose and complex-type structures by tandem mass spectrometry (MS/MS) analyses. Molecular modeling of jelly fig PME indicated that the N-glycan was putatively attached to the back region of the active site.TABLE OF CONTENT………………………………………………..…I ABBREVIATIONS……………………………………………………....1 ENGLISH ABSTRACT………………………………………………….3 CHINESE ABSTRACT………………………………………………….5 RESEARCH BACKGROUND…………………………………………..6 REFERENCES…………………………………………………….……14 CHAPTER 1 Identification of Isoforms of Two Major Sesame Seed Storage Proteins, 11S Globulin and 2S Albumin ABSTRACT………...……….……………...………..19 INTRODUCTION………………………..…………..20 MATERIALS AND METHODS………..…………....22 RESULTS…...…………………………..……………25 DISCUSSION……….………………..………………28 REFERENCES…...…………………..………………31 TABLES………….……………………..……………34 FIGURES…………….……..………………………..40 CHAPTER 2 Determination of N-glycosylation site and glycan structures of Pectin Methylesterase in Jelly Fig (Ficus awkeotsang) Achenes ABSTRACT………………………………...………..44 INTRODUCTION………………………..…………..45 MATERIALS AND METHODS………..…………....47 RESULTS…...…………………………..……………51 DISCUSSION……….………………..………………54 REFERENCES…...…………………..………………57 TABLES………….……………………..……………60 FIGURES…………….……..………………………..61 CONCLUSION…………………………………………………………71 REFERENCES………………………………………………………….7