Ανίχνευση σύνθετων βλαβών DNA σε καρκινικά και υγιή κύτταρα έπειτα από έκθεση σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας γ

Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο--Μεταπτυχιακή Εργασία. Διεπιστημονικό-Διατμηματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών (Δ.Π.Μ.Σ.) “Φυσική και Τεχνολογικές Εφαρμογές

Αξιολόγηση πειραματικής διάταξης ραδιενεργού πηγής σωματίων α 234-U για ραδιοβιολογικά πειράματα

Η παρούσα εργασία αποτελεί μια προσπάθεια επιβεβαίωσης της πειραματικής επιβεβαίωσης λειτουργίας της πειραματικής διάταξης πηγής ακτινοβολίας α 234-U που κατασκευάστηκε από την Ευαγγελία Χουλιλίτσα με σκοπό την in situ ακτινοβόληση βιολογικού υλικού. Έγινε για τα πειράματα χρήση της συσκευής αυτής, που βρίσκεται στο κτίριο Φυσικής του ΕΜΠ στο εργαστήριο του Δρ. Γεωργακίλα, για ακτινοβόληση κυττάρων CHO με δόση 1Gy. Σύμφωνα με τους υπολογισμούς που πραγματοποιήθηκαν από την Ευαγγελία Χουλιλίτσα στα πλαίσια της διπλωματικής της εργασίας, για τη συσκευή αυτή, δόση 1Gy ισοδυναμεί με παραμονή του βιολογικού υλικού κάτω από την πηγή για χρόνο 13’ 26’’. Τα σωμάτια α είναι πυρήνες He, άρα θετικά φορτισμένα σωματίδια, που εκπέμπονται από ραδιενεργά υλικά. Έχουν εξαιρετικό ενδιαφέρον στη μελέτη τους, καθώς λόγω και του μεγέθους τους είναι ικανά να σκοτώσουν ένα κύτταρο διασχίζοντας τον πυρήνα τους, αλλά ταυτόχρονα είναι δύσκολο να μελετηθούν σε βιολογικά πειράματα λόγω της μικρής διεισδυτικότητάς τους. Εξαιτίας της μεγάλης τιμής της γραμμικής εναπόθεσης ενέργειας (LET) που έχουν συγκριτικά με τις πιο μελετημένες ακτίνες Χ ή γάμα, οι ραδιοβιολογικές συνέπειες των άλφα προσέλκυσαν μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον. Τα σωμάτια άλφα έχουν ενέργειες από 4 έως 9 MeV και χαρακτηρίζονται από τιμή LET της τάξης του 100 keV ανά μm που είναι υπεύθυνη για την σοβαρή βλάβη που προκαλεί η άλφα ακτινοβολία τόσο σε υγιή και κακοήθη κύτταρα, αλλά και για την εμβέλειά τους σε βιολογικό υλικό που είναι μικρότερη από 0.1 mm. Αυτό που ξεχωρίζει την άλφα ακτινοβολία από τις ακτινοβολίες με χαμηλή τιμή LET είναι ότι η επίδραση των άλφα είναι σχεδόν ανεξάρτητη της δόσης και η βιολογική τους αποτελεσματικότητα καθορίζεται λιγότερο από το στάδιο του κυτταρικού κύκλου στο οποίο βρίσκεται το κύτταρο. Επιπλέον, οι βλάβες που προκαλεί η άλφα ακτινοβολία στο DNA είναι λιγότερο ευαίσθητες στους αντίστοιχους μηχανισμούς επιδιόρθωσης.This project is an evaluation effort of an a-particle 234-U sorce experimental setup constructed by Evangelia Choulilitsa. The device was used to radiate CHO cells with the dose of 1 Gy. For this device, 1 Gy radiation is equivalent with 13'26''. The experiments' results were used to calculate the actual dose that the cells received for exposure time 13'26'', as it is expected to be less than 1 Gy

Ανάπτυξη κυτταρογενετικών μεθοδολογιών για την εκτίμηση της ατομικής ακτινοευαισθησίας και αξιολόγηση σύγχρονων εξατομικευμένων τεχνικών ακτινοθεραπείας

Παρόλο που οι σύγχρονες τεχνικές ακτινοθεραπείας επιτρέπουν την αύξηση της δόσης στον όγκο-στόχο για μεγιστοποίηση του ποσοστού ίασης της νόσου και ελαχιστοποίηση της δόσης στους υγιείς ιστούς, υπάρχει σημαντική ανάγκη να κατανοήσουμε καλύτερα τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στο πολύπλοκο δίκτυο της κυτταρικής απόκρισης στις ακτινοεπαγόμενες βλάβες του DNA γνωστό ως “DNA Damage response” (DDR), καθώς και να υπερνικήσουμε την ακτινοαντοχή του όγκου. Οι ATM, ATR και Chk1 είναι οι βασικές κινάσες που εμπλέκονται άμμεσα στην ενεργοποίηση του DDR και την αντοχή του όγκου στην ακτινοβολία. Είναι σημαντικό επομένως, να καθιερωθεί μία κυτταρογενετική δοκιμασία (assay) έναντι της συμβατικής κλωνογόνου δοκιμασίας (clonogenic assay) που να προσφέρει αξιόπιστα και γρήγορα αποτελέσματα για την εκτίμηση τόσο της ακτινοευαισθησίας όσο της ακτινοευαισθητοποίησης των κυττάρων με τη χρήση αναστολέων DDR. Η παρούσα διατριβή στοχεύει: (1) Στην ανάπτυξη μιας κυτταρογενετικής μεθόδου (G2-assay) για την εκτίμηση της χρωμοσωματικής ακτινοευαισθησίας χρησιμοποιώντας αναστολείς του DDR και του σημείου ελέγχου G2/M του κυτταρικού κύκλου. (2) Στην αξιολόγηση του G2-assay, ως εναλλακτική έναντι της συμβατικής κλωνογόνου δοκιμασίας (clonogenic assay) ως προς το χρόνο που απαιτείται για την ανάλυση των αποτελεσμάτων. (3) Στην ανάδειξη των πλεονεκτημάτων της μεθοδολογίας που αναπτύσεται στα πλαίσια της παρούσας διατριβής ως εργαλείο για τη διερεύνηση της αποτελεσματικότητας διαφορετικών αναστολέων του DNA Damage response – DDR για την ακτινοευαισθητοποίηση των κυττάρων. Σε αυτό το μέρος της πειραματικής διαδικασίας, ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (ινοβλάστες 82-6 hTERT και επιθηλιακά κύτταρα RPE) ακτινοβολήθηκαν κατά τη διάρκεια της μετάβασής τους από τη φάση G2 του κυτταρικού τους κύκλου στη Μίτωση (Μ), και αξιολογήθηκε η συμβολή της αναστολής των οδών ATR, ATM και Chk1 αναλύοντας τις επαγόμενες χρωματιδικές αλλοιώσεις. Τα πειράματα διεξήχθησαν με κύτταρα που επωάστηκαν με καφεΐνη (αναστολέας ATM/ATR), με VE-821 (αναστολέας της ATR) και με UCN-01 (αναστολέας Chk1) ώστε να επιτευχθεί η κατάργηση της ενεργοποίησης του G2/Μ σημείου ελέγχου. Τα πειραματικά αποτελέσματα οδήγησαν στην ανάπτυξη και βελτιστοποίηση ενός τροποποιημένου G2-assay που υιοθετεί τον ATR αναστολέα VE-821, επιτρέποντας τη σύντομη χρονικά εκτίμηση της ακτινοευαισθησίας των κυττάρων. Η συνδυασμένη αυτή μεθοδολογία θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί ως ένα αξιόπιστο εργαλείο για τον έλεγχο της ακτινοευαισθητοποίησης που θα μπορούσαν να επιφέρουν μελλοντικοί αναστολείς DDR. Επίσης, τα αποτελέσματά του μέρους αυτού της διατριβής ενισχύουν την ιδέα ότι τα ATM, ATR και Chk1 αποτελούν ελκυστικούς στόχους φαρμάκων στην ογκολογία. Επιπλέον, υπάρχει σημαντική ανάγκη για περαιτέρω διερεύνηση της αποτελεσματικότητας των νέων τεχνικών ακτινοθεραπείας εκτιμώντας την απορροφούμενη δόση με κυτταρογενετικές μεθόδους βιοδοσιμετρίας, καθώς και για τη διερεύνηση της πιθανής επίδρασης του ρυθμού δόσης των νέων τεχνικών στο βιολογικό αποτέλεσμα. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής εξήχθησαν αποτελέσματα σχετικά με την απορροφούμενη δόση σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος και σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη PC3, μετά από ακτινοβόληση με τρεις διαφορετικές τεχνικές ακτινοθεραπείας (3D-CRT, IMRT και VMAT) με συνταγογραφούμενη δόση 2Gy. Για κάθε δείγμα αίματος ασθενούς και για τα κύτταρα PC3, πραγματοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές ακτινοβολήσεις χρησιμοποιώντας τις τεχνικές 3D-CRT, IMRT και VMAT με δόση 2 Gy. Η απορροφούμενη δόση υπολογίστηκε με τη μέθοδο βιοδοσιμετρίας η οποία βασίζεται στην ανίχνευση δικεντρικών χρωµοσωµάτων σε κύτταρα. Τα αποτελέσματα της διατριβής έδειξαν μία υποεκτίμηση της απορροφούμενης δόσης της τάξης του ~4% για τις τεχνικές IMRT και VMAT συγκριτικά με τη συμβατική 3D-CRT ενώ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά για τις τεχνικές VMAT και IMRT. Η παρατηρούμενη υποεκτίμηση της απορροφούμενης δόσης στα κύτταρα με τις τεχνικές VMAT και IMRT, πιθανόν να οφείλεται στο μικρότερο ρυθμό δόσης που επιτυγχάνεται με τις τεχνικές αυτές.While technological advances in radiation oncology have led to a more precise delivery of radiation dose and to a decreased risk of side effects, there is still a need to better understand at the DNA and cytogenetic level the mechanisms underlying DNA damage response (DDR) and to overcome tumor resistance. ATM, ATR and Chk1 kinases are key mediators in DDR activation and crucial factors in treatment resistance. It is of importance, therefore, as an alternative to the conventional clonogenic assay, to establish a cytogenetic assay enabling reliable and time-efficient results in evaluating the potency of DDR inhibitors for radiosensitization. Towards this goal, the present study aims: 1. To develop and optimize a G2-chromosomal radiosensitivity assay using DDR and G2-checkpoint inhibitors as a novel modification compared to the classical G2-assay. 2. To investigate the strengths of this assay, as an alternative to the conventional clonogenic assay, for rapid radiosensitivity assessments of cultured cell lines, and potentially of primary tumor cells obtained from biopsies. 3. To examine the strengths and feasibility of the assay in enabling time-efficient results regarding the evaluation of the potency of DDR inhibitors in radiosensitizing cells. Specifically, exponentially growing RPE and 82-6 hTERT human cells were irradiated during G2/M-phase transition in the presence or absence of Caffeine, VE-821 and UCN-1 inhibitors of ATM/ATR, ATR and Chk1 respectively, and the induced chromatid breaks were used to evaluate cell radiosensitivity and their potency for radiosensitization. The results generated here led to the development and optimization of a modified G2-assay using the VE-821 ATR inhibitor enabling time-efficient radiosensitivity assessments of cultured cells, and potentially of primary tumor cells obtained from biopsies. The results also, highlight the potential of our modified G2-assay using VE-821 to evaluate cell radiosensitivity, the efficacy of DDR inhibitors in radiosensitization, and reinforce the concept that ATM, ATR and Chk1 represent attractive anticancer drug targets in radiation oncology. Τhere is also a need to evaluate the efficacy of the new radiotherapy techniques estimating the biological dose and to investigate the radiobiological impact of the dose rate in advanced radiotherapy techniques. The aim of this experimental part is to compare, at a cytogenetic level, advanced radiotherapy techniques VMAT and IMRT with the conventional 3D-CRT, using biological dosimetry. A dicentric biodosimetry assay, based on the frequency of dicentrics chromosomes scored in peripheral blood lymphocytes from prostate cancer patients and PC3 human prostate cancer cell line was used. For each patient blood sample and for the cell line, three different irradiations were performed using the 3D-CRT, IMRT and VMAT technique. The absorbed dose was estimated with the biodosimetry method based on the induced dicentric chromosomes. The results showed a statistically significant underestimation of the biological absorbed dose of ~4% for the IMRT and VMAT compared to 3D-CRT irradiations for peripheral blood lymphocytes, whereas IMRT and VMAT results were comparable without a statistically significant difference, although slightly lower values were observed for VMAT compared to IMRT irradiation. Similar results were obtained using the PC3 cell line. The observed biological dose underestimation could be associated with the relative decreased dose rate met in modulated techniques compared to the conventional 3D-CRT irradiations

Μελέτη της επίδρασης γ-ακτινοβολίας χαμηλών δόσεων με μεθόδους κυτταρογενετικής και μοριακής γενετικής

Ο άνθρωπος στην καθημερινότητα του εκτίθεται σε πλήθος πηγών ακτινοβολίας, ιοντίζουσας και μη. Λόγω των καθοριστικών επιδράσεων των ιοντιζουσών ακτινοβολίων στην υγεία των έμβιων όντων, η επιστημονική κοινότητα εδώ και πολλές δεκαετίες ερευνά τα ακριβή αποτελέσματα των εκθέσεων σε πηγές ιοντίζουσας ακτινοβολίας με σκοπό τη συσχέτιση της έκθεσης με χρωμοσωματικές αλλοιώσεις, χρωμοσωματική αστάθεια και ανευπλοειδία, οι οποίες είναι διεθνώς αποδεκτό πως συμβάλλουν στο μηχανισμό καρκινογένεσης μετά από έκθεση σε ακτινοβολία, την θέσπιση αρχών προστασίας από αυτές αλλά και την εκμετάλλευση του μηχανισμού αλληλεπίδρασης τους με τα βιολογικά υλικά για θεραπευτικούς σκοπούς. Τα τελευταία χρόνια οι μελέτες που αφορούν την επίδραση των ιοντιζουσών ακρινοβολιών έχουν επεκταθεί και στην κλίμακα των χαμηλών δόσεων, καθώς η χρήση των ιοντιζουσών ακτινοβολιών κατά τις ιατρικές πράξεις για διαγνωστικούς σκοπούς είναι αρκετά αυξημένη. Μεγάλη μερίδα ανθρώπων πλέον υποβάλλεται ετησίως σε πλήθος διαγνωστικών εξετάσεων με αποτέλεσμα να εκτίθενται σε χαμηλές δόσεις ιοντίζουσας ακτινοβολίας, των οποίων επίδραση δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως έως σήμερα. Σε αυτή την κατεύθυνση δομήθηκε η παρούσα διπλωματική εργασία, καθώς το αντικείμενο της είναι η μελέτη της επίδρασης χαμηλών δόσεων ακτινοβολίας με μεθόδους κυτταρογενετικής και μοριακής γενετικής όπως η μέθοδος Μικροπυρήνων (MN), η μέθοδος ανάλυσης εστιών γ-Η2ΑΧ (γ-Η2ΑΧ foci) και η μέθοδος φθορίζοντος in situ υβριδισμού (FISH). Πιο συγκεκριμένα, η παρούσα εργασία χωρίστηκε σε τρία τμήματα, κάθε ένα από τα οποία αφορά διαφορετική μέθοδο ανάλυσης. Συνολικά λήφθηκαν δείγματα περιφερικού αίματος από 5 υγειής δότες, τα οποία αναλύθηκαν μετά από in vitro έκθεση τους σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας. Η πρώτη σειρά πειραμάτων περιλαμβάνει την εφαρμογή της μεθόδου των μικροπυρήνων για όλους τους δότες με in vitro έκθεση των δειγμάτων σε δόσεις ακτινοβολίας 0,05 και 1 Gy. Tα αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι η μέθοδος των μικροπυρήνων δεν ανιχνεύει στατιστικώς σημαντική αύξηση χρωμοσωματικών αλλοιώσεων για χαμηλή δόση ακτινοβολίας (50 mGy). Επίσης, έδειξαν ότι υπάρχει μεγάλη διακύμανση της συχνότητας εμφάνισης των μικροπυρήνων τόσο στο υπόβαθρο όσο και στα ακτινοβολημένα δείγματα με την χαμηλή δόση ακτινοβολίας. Η δεύτερη σειρά πειραμάτων αφορά την πλέον ευαίσθητη μέθοδο για την ανίχνευση χαμηλών δόσεων ιοντίζουσας ακτινοβολίας, την μέθοδο της φωσφορυλιωμένης ιστονικής πρωτεΐνης Η2Α (γ-Η2ΑΧ). Με την συγκεκριμένη μέθοδο αναλύθηκαν όλα τα δείγματα μετά από in vitro έκθεση τους στην χαμηλή δόσης ακτινοβολίας των 0,05 Gy και τα αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι προκλήθηκε στατιστικώς σημαντική αύξηση των ακτινοεπαγόμενων γ-H2AX εστιών σε σχέση με τα μη-ακτινοβολημένα δείγματα (control) αμέσως μετά την έκθεση. Η διαφορά παρέμεινε στατιστικώς σημαντική και 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση με τον αριθμό των καταμετρούνων foci μειωμένο λόγω της επιδιόρθωσης. Σημαντικό αποτέλεσμα είναι επίσης η διακύμανση στην επιδιόρθωση των DSBs μεταξύ των δοτών όπως προκύπτει από την ανάλυση των δειγμάτων 24 ώρες μετά την έκθεση. Η τελευταία σειρά πειραμάτων επικεντρώθηκε στην μελέτη της επαγώμενης χρωμοσωματικής αστάθειας μετά από έκθεση σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας με τη μέθοδο ανίχνευσης ασύμμετρων κυτταρικών διαιρέσεων. Για τον σκοπό αυτό εφαρμόστηκε συνδυασμός της μεθόδου των μικροπυρήνων και της μεθόδου φθορίζοντος in situ υβριδισμού (i-CBMN) για τους 3 πρώτους υγιής δότες μετά από in vitro έκθεση των δειγμάτων σε δόσεις ακτινοβολίας 0,05 και 2 Gy, για δύο διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την έκθεση (72 και 96 ώρες μετά την ακτινοβόληση). Τα πρώιμα αποτελέσματα της τρίτης σειράς πειραμάτων δεν υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντική δοσο-εξαρτώμενη αύξηση των ασύμμετρων κυτταρικών διαιρέσεων μετά από έκθεση στην χαμηλή δόση ακτινοβολίας των 0,05 Gy για κανένα από τα τρία χρονικά σημεία. Συμπερασματικά, για την βαθύτερη κατανόηση των επιδράσεων των χαμηλών δόσεων ακτινοβολίας και κατ επέκταση του κινδύνου που αυτές εγκυμονούν κατά τις ιατρικές εκθέσεις τόσο για τους ασθενείς όσο και για τους εργαζόμενους είναι αναγκαίο να ερευνηθεί περαιτέρω η συσχέτιση της επαγωγής και της επιδιόρθωσης των εστιών γ-Η2ΑΧ με τις βιολογικές επιπτώσεις σε επίπεδο κυττάρου. Επιπλέον, η παρακολούθηση της εξέλιξης των ασύμμετρων κυτταρικών διαιρέσεων μετά από αρκετούς κυτταρικούς κύκλους αλλά και συσχέτισή τους με χρωμοσωματική αστάθεια και ανευπλοειδία μπορεί να συμβάλει καταλυτικά στην κατανόηση των πολύπλοκων μηχανισμών ακτινοπροκλιτής καρκινογένεσης.Our daily lives are full of exposures in many sources of ionizing and non-ionizing radiation. The interaction of ionizing radiation with biological materials has tremendous results in individuals’ health. That is the main reason that led the scientific community to investigate the exact results that come from the exposure in ionizing radiation. The main goals over the decades was to find the correlation between the exposure and the increase of chromosomal abnormalities, genomic instability and aneuploidy, as they contribute to the mechanism of carcinogenesis after exposure to radiation, to establish the main principles of radiation protection and to take in advantage the results of the interaction of ionizing radiation with biological materials for therapeutic purposes. In recent years, the use of ionizing radiation for diagnostic purposes has been increased and that results to the expansion of the ionizing radiation effects research in the low dose scale. Annually, a large portion of people getting exposed to low doses of ionizing radiation as they undergo diagnos-tic testing that involves ionizing radiation but the biological effects of the low dose exposures has not been fully elucidated. The present study was structured in this direction, as the topic is the investigation of the low dose ionizig radiation effect in biological materials with cytogenetics and molecular genetics methods such as the Micronucleus (MN) method, the phosphorylated histone γ-Η2ΑΧ method (γ-H2AX foci) and the fluorescence in situ hybridization (FISH) method. More specifically, the study was divided in three sections and in each section one of the three methods is included. Peripheral blood sam-ples were obtained from 5 healthy donors, and irradiated with low doses of radiation. The first series of experiments involves the application of the micronucleus method for all 5 in vitro exposured samples with 0,05 and 1 Gy. The results of the analysis showed that the micronu-cleus method does not detect a statistically significant increase in chromosomal lesions for a low radiation dose (50 mGy). Also, the results of the analysis showed that there is a large variation in the number micronucleus in both control and low irradiated samples. The second series of experiments includes the most sensitive method for the detection of the low dose ionizing radiation results, the method of phosphorylated histone γ-Η2ΑΧ . This method was used for the analysis of samples that obtained from all 5 healthy donors after their in vitro expo-sure to low radiation dose of 0.05 Gy. The results of the analysis showed that there was a statisti-cally significant increase in gamma-induced γ-H2AX foci compared to non-irradiated samples (control) right after the exposure and 24 hours post exposure with a total decrease of the counted γ-H2AX foci due to repair after 24 hours. An important result regarding the repair of DSBs is the large variation of repair among donors as the analysis of the samples 24 hours after radiation showed. The last series of experiments focused on the study of induced chromosomal instability after expo-sure to low doses of radiation by the method of detecting asymmetric cell divisions. For this pur-pose, a combination of the Micronucleus method and the fluorescence in situ hybridization meth-od (i-CBMN) was applied for the first 3 healthy donors after irradiation of the samples with 0.05 and 2 Gy doses, for two different time points after exposure (72 and 96 hours after irradiation). According to preliminary results that obtained from the third series of experiments, there is not a statistically significant dose-dependent increase in asymmetric cell divisions after exposure to low radiation dose for any of the three time points. In conclusion, in order to have a better overview of the effects of low radiation doses and the con-sequent risk for both patients and radiation workers, further research in the direction of associa-tion the induction and repair of γ-H2AX foci with biological effects at the cellular level is needed. Furthermore, the analysis of asymmetric cell divisions after several cell cycles and their correla-tion with chromosomal instability and aneuploidy can contribute effectively in the understanding of the mechanisms of radiation carcinogenesis

Διερεύνηση του ρόλου των μελών της οικογένειας των πρωτεϊνών 14-3-3 στην ωογένεση του Δίπτερου εντόμου Drosophila melanogaster.

Το δίπτερο έντομο Drosophila melanogaster, που χρησιμοποιήθηκε στα πλαίσια της ερευνητικής αυτής εργασίας για τη διαλεύκανση του ρόλου των πρωτεϊνών 14-3-3ε και 14-3-3ζ, αποτελεί κύριο οργανισμό - μοντέλο σε μελέτες βασικής έρευνας. Μετά από εφαρμογή του GAL4/UAS γενετικού συστήματος και της RNAi παρεμβατικής τεχνολογίας εξετάσθηκαν οι in vivo επιπτώσεις της υπερέκφρασης και γονιδιακής αποσιώπησης των γονιδίων που κωδικοποιούν για τις δύο αυτές ισομορφές, στις διεργασίες της ωογένεσης, της εκκολαψιμότητας, της μορφογένεσης του σύνθετου οφθαλμού και των φτερών. Η παρατήρηση των αποτελεσμάτων έγινε μέσω οπτικής μικροσκοπίας και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης. Η υπερέκφραση των δύο αυτών ισομορφών έχει ως ενδεχόμενη συνέπεια τη διαταραχή του κυτταρικού κύκλου και της πορείας της ωογένεσης, με αποτέλεσμα την αύξηση των κυτταρικών διαιρέσεων και επομένως την εμφάνιση παθολογικών φαινοτύπων στις ωοθήκες και στα ωοθυλάκια. Ωστόσο, η υπερέκφραση είτε της πρωτεΐνης D14-3-3ε είτε της D14-3-3ζ δεν επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό την εκκολαψιμότητα των εντόμων D. melanogaster. Στη μειορρύθμιση των ισομορφών D14-3-3ε και D14-3-3ζ πιθανώς οφείλονται οι διαταραχές κατά τις πρώιμες κυτταρικές διαιρέσεις και το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων, με αποτέλεσμα την εμφάνιση παθολογικού φαινοτύπου στις ωοθήκες και τα ωοθυλάκια των ατόμων που εξετάσθηκαν. Απώλεια μόνο της D14-3-3ζ φαίνεται να έχει επιπτώσεις στην εκκολαψιμότητα των εντόμων, με τα άτομα που μεταβαίνουν από το στάδιο της λάρβας σε αυτό της πούπας να μην ολοκληρώνουν επιτυχώς την πορεία εκκόλαψης στο σύνολό τους. Αναφορικά με την επίδραση της μειορρύθμισης των δύο πρωτεϊνών στονοφθαλμό, σημειώνεται ότι μόνο η απώλεια της D14-3-3ζ ισομορφής φαίνεται να έχει επίδραση στο φαινότυπο των οφθαλμών νεαρών αρσενικών ατόμων, με το φυλοεξαρτώμενο φαινόμενο να σχετίζεται με τη διαταραχή της πορείας διαφοροποίησης των φωτοϋποδοχέων των οφθαλμών. Τέλος, απώλεια των δύο πρωτεϊνών φαίνεται να έχει έντονα αρνητική επίδραση στο φαινότυπο των φτερών των ατόμων και συγκεκριμένα στο πρότυπο φλέβωσης, με τη διαφορά στη συχνότητα εμφάνισης παθολογικού φαινοτύπου ανάμεσα στα δύο φύλα να υποδηλώνει φυλοεξαρτώμενο φαινότυπο. Συνοψίζοντας, από τα παραπάνω συμπεραίνουμε ότι οι πρωτεΐνες D14-3-3ε και D14-3-3ζ διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο τόσο στην ωογένεση και στην εκκολαψιμότητα, όσο και στην ανάπτυξη του εντόμου Drosophila melanogaster και συγκεκριμένα στη διαμόρφωση του προτύπου φλέβωσης των φτερών και τη μορφογένεση των οφθαλμών των ατόμων. Μάλιστα, τα αποτελέσματα της εργασίας υποστηρίζουν την υπόθεση ύπαρξης σχέσης πλεονασμού μεταξύ των γονιδίων που κωδικοποιούν τις ισομορφές D14-3-3ε και D14-3-3ζ, με το φαινόμενο αυτό να αποκτά ιστοειδικό χαρακτήρα και να εκδηλώνεται με διαφορετική ένταση, ανάλογα με τον ιστό στον οποίο εκφράζονται οι δύο ισομορφές, το φύλο και τη δυνατότητα αντιστάθμισης της απώλειας λειτουργίας της πρωτεΐνης που υπερεκφράζεται ή μειορρυθμίζεται από τη δεύτερη ισομορφή της πρωτεϊνικής οικογένειας.Drosophila melanogaster is a major model organism in basic research studies and during this research, it served as a basic genetic tool to elucidate the role of 14-3-3ε and 14-3-3ζ proteins in the processes of oogenesis, hatching and compound eye, and wing morphogenesis. After suitable employment of the GAL4/UAS binary genetic system and RNAi technology, we examined the effects of overexpression and silencing of the genes encoding for these two isoforms. The pathological phenotypes were examined with Photo- and Stereo-microscope, and Scanning Electron Microscope. Overexpression of the two isoforms likely results in deregulation of the cell cycle and the ovulation process, which may cause an increase in cellular divisions and ultimately development of pathological phenotype in the ovaries and follicles. However, overexpression of either D14-3-3ε or D14-3-3ζ protein does not significantly affect hatchability of D. melanogaster insects. In addition, by examining the negative effects of D14-3-3ε and D14-3-3ζ downregulation, we concluded that the pathological phenotype in the ovaries and follicles is probably caused by deregulation of the process of early cell divisions and chromosome separation. Furthermore, single loss of 14-3-3ζ isoform seems to have a negative impact on hatchability, as insects manage to transform from the larva stage to that of the pupa, but do not successfully complete hatching altogether. Downregulation of the two proteins in the eye disc indicated that single loss of D14-3-3ζ isoform resulted in the appearance of pathological phenotype in young male flies. This sex-dependent phenotype is likely related to the disorder of the differentiation process of the photoreceptors in the eye. Finally, loss of the two proteins seems to have a strongly negative effect on the phenotype of the wings of the individuals, and especially on the vein pattern. The difference in the degree of the pathological phenotype between the two sexes suggests that the phenotype is sex-dependent. Conclusively, this study suggests that the D14-3-3ε and D14-3-3ζ proteins play a key role in both oogenesis and hatching process, as well as in the fly’s development and in particular in the formation of wings and the morphogenesis of the compound eye. In fact, our results support the assumption that the genes encoding for D14-3-3ε and D14-3-3ζ isoforms carry redundant functions. Redundancy seems to be tissue-specific, sex-dependent and also depends on the ability of each protein to compensate for loss of function of the other isoform due to downregulation of its cognate gene