MECCANISMI COINVOLTI NELLA FORMAZIONE DEGLI INCLUSI NEURONALI NELLE CELLULE STRIATALI

Il sistema Ubiquitina-Proteasoma (UP) è un complesso proteolitico responsabile della degradazione intracellulare di proteine coinvolte nel mantenimento e nella regolazione di vari processi cellulari, come le proteine nucleari e quelle citosoliche La mancanza di dopamina riduce significativamente le alterazioni ultrastrutturali indotte nel tessuto striato dalla MET. Ciò suggerisce che l’integrità dei terminali dopaminergici striatali svolge un ruolo chiave nell’induzione degli effetti post-sinaptici della MET. La dopamina è richiesta per l’induzione di inclusi intracellulari in colture primarie di cellule striatali. Tali inclusioni sono positive per l’ubiquitina e per l’α-sinucleina. La morte cellulare e la formazione degli inclusi sono inversamente correlate, suggerendo che gli inclusi neuronali possano rappresentare una fase più leggera e/o precoce di tossicità e supportando l’ipotesi di un ruolo protettivo degli inclusi stessi. La formazione di inclusi neuronali è correlata alla inibizione del sistema UP. Gli effetti neurotossici della dopamina sulle cellule striatali sembra mediato dalla stimolazione selettiva dei recettori D1. L’inibizione di tali recettori riduce significativamente la morte cellulare indotta da alte dosi di dopamina e aumenta il numero di cellule con inclusi, suggerendo che il meccanismo di formazione delle inclusioni neuronali possa rappresentare una risposta protettiva per la cellula contro gli insulti neurotossici

Particularitățile metabolismului acizilor grași în miocard

Cordul este considerat un organ cu un consum energetic foarte înalt. Cardiomiocitele permanent generează ATP, utilizat ulterior în contracție, procesele metabolice bazale și menținerea homeostaziei ionice. Actualmente se consideră că din totalul de ATP generat în miocard 50-70% se obțin din oxidarea acizilor grași (AG). Scopul acestui studiu este elucidarea particularităților metabolismului acizilor grași în miocard în condiții fiziologice. Calea metabolică de oxidare a acizilor grași reprezintă un proces complex dependent de un șir de factori regulatori. Controlul transcripțional al enzimelor implicate în metabolismul acizilor grași și biogeneza mitocondrială este unul din factorii determinanți ai ratei β-oxidării acizilor grași. Reglarea transcripțională a enzimelor este realizată de către factorii de transcripție a receptorilor nucleari, inclusiv PPAR și PGC-1. În miocard β-oxidarea acizilor grași reprezintă un proces dinamic, care se adaptează rapid la modificările (fiziologice și/sau patologice) consumului energetic sau mediului dat. Cercetările anterioare au prezentat date multiple și contradictorii privind rolul β-oxidării acizilor grași în acumularea intramiocardică a lipidelor. Datele recente confirmă ipoteza că ratele înalte de oxidare a acizilor grași (de ex. în obezitate sau diabet zaharat) sunt un factor important care contribuie la dezvoltarea cardiomiopatiilor.

Oncogenic KRAS-induced feedback inflammatory signaling in pancreatic cancer: An overview and new therapeutic opportunities

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) remains highly refractory to treatment. While th

Basi molecolari del medulloblastoma: ruolo delle E3-ligasi REN ed ITCH nel signaling di Hedgehog

Il medulloblastoma è la forma più comune di neoplasia infantile. È causato da alterazioni genetiche e epigenetiche che influenzano lo sviluppo delle cellule progenitrici dei granuli del cervelletto. Tali difetti comprendono delezioni cromosomiali, come la delezione del braccio corto del cromosoma 17, ed alterazioni nelle più importanti vie di trasduzione del segnale. È stato recentemente descritto che il medulloblastoma è strettamente legato all’attivazione costitutiva della pathway Sonic-Hedgehog-Gli. Sebbene il ruolo del segnale di Hedgehog (Hh) nei processi di embriogenesi e tumorigenesi sia ben noto, i meccanismi molecolari che ne sottendono la regolazione sono ancora ad oggi non definiti. Dati di letteratura riportano che processi proteolitici ubiquitina-dipendente rappresentano un evento cruciale per il controllo della via di Hh. Nel nostro laboratorio sono stati identificati due nuovi meccanismi di degradazione ubiquitina-dipendente coinvolti nella regolazione della proteina Gli1, il principale effettore del signaling di Hh: i) un meccanismo di degradazione promosso dalla proteina “adaptor” Numb e mediato dalla E3-ligasi Itch, appartenente alla famiglia delle HECT-E3 ubiquitin ligasi; ii) un meccanismo di degradazione indotto da una nuova E3-ligasi, REN/Cul3, da noi identificata, appartenente alla famiglia delle RING E3-ligasi. Dati precedentemente pubblicati dal nostro gruppo avevano dimostrato che una riduzione dei livelli di ubiquitinazione di Gli1, con conseguente accumulo, avvengono nel medulloblastoma a causa della perdita di Numb, una proteina coinvolta nella determinazione del destino cellulare, nel self-renewal e nel differenziamento (Di Marcotullio et al., 2006; Gulino et al., 2010). Inoltre era stato dimostrato come l’ubiquitinazione e la degradazione di Gli1 indotta da Numb fosse mediata dall’E3 ligasi Itch (Di Marcotullio et al., 2006). Sebbene, il ruolo dell’asse Gli/Numb/Itch nello sviluppo del medulloblastoma fosse stato ben sviluppato, i meccanismi molecolari coinvolti nella regolazione dell’attività di queste proteine non erano stati chiariti. Nella prima parte del mio lavoro di tesi ci siamo occupati di approfondire i meccanismi alla base dell’interazione tra Numb, Itch e Gli1 e di evidenziarne il significato funzionale. Numb interagisce con la regione centrale di Itch, contenente i domini WW, in particolare con il secondo dominio WW (WW2). Domini WW sono comunemente utilizzati per il legame con i diversi substrati di Itch, ed infatti abbiamo anche scoperto che Gli1 interagisce con la medesima regione. Tramite esperimenti di legame, sia in vivo che in vitro, abbiamo dimostrato che Numb ha la funzione sia di attivare Itch che di reclutare Gli1. Itch si trova infatti in una conformazione inattiva auto-inibitoria, in cui il ripiegamento del dominio catalitico HECT (C-terminale) in corrispondenza della regione dei WW (N-terminale), ne inibisce la sua attività catalitica. Il legame di Numb destabilizza l’interazione HECT-WW promuovendo l’apertura della struttura e portando quindi ad una conformazione attiva. Ciò favorisce l’entrata di Gli1 nel complesso e la sua successiva ubiquitinazione. A tal proposito, abbiamo dimostrato che Itch è in grado di legare direttamente Gli1 e che tale legame avviene tra i domini WW di Itch e i WW-binding sites PPXY e la S1060P, presenti nella regione C-terminale di Gli1. Importante, la proteina Gli1 mutata in questi siti non è soggetta alla proteolisi indotta da Itch e presenta maggiori proprietà oncogeniche. La seconda parte del lavoro di tesi è stata finalizzata all’analisi dei meccanismi molecolari che regolano l’attività di RENKCTD11/Cul3 ed alla loro alterazione nel medulloblastoma. In un lavoro precedentemente pubblicato, avevamo identificato RENKCTD11 come un oncosoppressore, localizzato sul cromosoma 17p e capace di antagonizzare l’attività di Hh. Sebbene fosse stata dimostrata la capacità di RENKCTD11 di inibire la funzione trascrizionale di Gli1, i meccanismi responsabili di questo processo non erano stati chiariti. Il fatto che REN possiede un dominio BTB/POZ (coinvolto nell’interazione con la Cullina3), responsabile del suo effetto sulla crescita e differenziamento dei progenitori neuronali e che uno dei meccanismi di ubiquitinazione di Gli1, vede il coinvolgimento del complesso HIB-SPOP/Cul3, ci ha fatto ipotizzare che RENKCTD11 fosse in grado di interagire con Cul3 e regolare la stabilità di proteine del signaling di Hh. Tramite esperimenti di co-IP e saggi di ubiquitinazione in vitro ed in vivo, abbiamo mostrato che RENKCTD11, attraverso un legame diretto con il dominio BTB/POZ, forma un complesso con Cul3 e svolge azione ubiquitin-ligasica. In particolare, abbiamo dimostrato che RENKCTD11 è capace di indurre ubiquitinazione e degradazione di HDAC1, una deacetilasi recentemente identificata nel nostro laboratorio come un potente attivatore del signaling di Hh e altamente espressa nei medulloblastomi. L’espressione ectopica di RENKCTD11, in linee cellulari di medulloblastoma, determinava una riduzione dei livelli di HDAC1, portando ad inibizione dell’attività di Gli1 e ad arresto della proliferazione. I risultati ottenuti da questa ricerca svelano la funzione di RENKCTD11 come una nuova Cul3-E3 ligasi ed il meccanismo attraverso il quale RENKCTD11, regolando negativamente HDAC1, inibisce il signaling di Hh. Queste evidenze sperimentali identificano nuovi meccanismi di regolazione dell’attività di Gli1 e forniscono una solida ragione per indagare sull'ipotesi che le proteine, Numb, Itch e RENKCTD11, sono coinvolte nello sviluppo del medulloblastoma e possono rappresentare bersagli per nuove strategie terapeutiche

Ruolo dell'autofagia e della dinamica mitocondriale nella segregazione del DNA mitocondriale

ABSTRACT Mitochondrial DNA is maternally inherited and its copy number can reach thousand per cell. Phatological mutations of human mtDNA have been known for many years and mutant mtDNA molecules frequently co-exist with wild-type copies of mtDNA. The most common point of mutation is adenine to guanine transition at nucleotide position (nt) 3243 of human mtDNA that is associated with the neuromuscular disease MELAS. How deleterious mtDNA mutations become established, and how they wax and wane over the course of the time are matters of intense investigation. Several reports have suggested that mutant mtDNA become fixed purely by the stochastic process of genetic drif. However, recent study in mouse suggest that a purification, selection process, operates in germline to week out deleterious mtDNA variants. The distribution of A3243G mtDNA in patients with mitochondrial disease was found to be non-random in on study. Thus, there is ample evidence that mutant load is not merely determined by random genetic drift. The segregation and transmission of mtDNA is dependent on mitochondrial movement and elimination. Even in non-dividing cells mitochondria are dynamic undergoing fusion and fission; they range from small spherical structures to complex interconnected networks. The extent of the network depends on the balance between elongation and fragmentation of mitochondria. In our laboratory was demonstrated that altering the balance between mitochondrial fission and fusion influences the segregation of mutant and wild-type mtDNA variants, suggesting that the level of mutant and wild-type mitochondrial DNA can be manipulated by alteing expression of nuclear encodedfactors involved in mitochondrial fission and mitochondrial quality control (mtQC). The goals of the project are i) the clarify the relationship between mutant mtDNA segregation and mitochondrial dynamics with a manipulation of the mitochondrialfusion by Mitofusin1 gene silencing and ii) study the autophagic and mitophagic machinery in cells with different proportion of MELAS mutant mtDNA : lung cybrids (0%, 35, 70%, 99% mutant) and muscle cybrids (0%,70%,80%,99%). Since lung (A549 adenocarcinoma) cybrids favour wild-type mtDNA and muscle (RD rhabdomyosarcoma) cybrids favour mutant mtDNA.In this work we have obtained the downregulation of Mfn1 in six clones of RD cybrids harbouring 80% mutant load by using RNAi method.In these clones a decrease of mutant mtDNA molecules wasn’t observed. Autophagywas tested by quantifying expression e protein levels of the autophagic markers LC3 and p62.. We found that both the proteins were well rapresented in both the cells harbouring A3243G mutant mtDNA with different nuclear background , indicating a good autophagy in both cell lines with no differences linked to the nuclear background;. We analysed the sequestration, sorting and elimination of damage mitochondria by quantifying expression and protein level of the mitophagic markers PINK1, Parkin and BNIP3 atmorphological, biochemical and molecular level. All the data demonstrated that in lung cybrids the mitophagy increased with the increase of mutant load, indicating an active elimination of damaged mitochondria. Interesting in muscle cybrids occurred the opposite: the mitophagic process decreased with the increase of mutant load. These data clarify that in muscle background the mutant mtDNA is favored since mitophagy is altered.compare lung cybrids

Functional Analysis of Jasmonates in Rice through Mutant Approaches

Jasmonic acid, one of the major plant hormones, is, unlike other hormones, a lipid-derived compound that is synthesized from the fatty acid linolenic acid. It has been studied intensively in many plant species including Arabidopsis thaliana, in which most of the enzymes participating in its biosynthesis were characterized. In the past 15 years, mutants and transgenic plants affected in the jasmonate pathway became available in rice and facilitate studies on the functions of this hormone in an important crop. Those functions are partially conserved compared to other plant species, and include roles in fertility, response to mechanical wounding and defense against herbivores. However, new and surprising functions have also been uncovered by mutant approaches, such as a close link between light perception and the jasmonate pathway. This was not only useful to show a phenomenon that is unique to rice but also helped to establish this role in plant species where such links are less obvious. This review aims to provide an overview of currently available rice mutants and transgenic plants in the jasmonate pathway and highlights some selected roles of jasmonate in this species, such as photomorphogenesis, and abiotic and biotic stress