Syanobakteerien antileukeemisten yhdisteiden tunnistus ja bioaktiivisuuksien seulonta

Syanobakteerit tuottavat lukuisia sekundäärimetaboliitteja, jotka voidaan jakaa rakenteensa ja synteesimekanisminsa mukaan laajempiin ryhmiin, kuten peptideihin polyketideihin ja alkaloideihin. Vaikka näiden yhdisteiden synteesien merkitys niitä muodostaville syanobakteereille on kiistanalaista, joillakin yhdisteillä on havaittu olevan bioaktiivisuutta eli ne vaikuttavat muiden eliöiden soluihin. Tunnetuimpia näistä yhdisteistä ovat ihmisille ja eläimille vaaralliset toksiinit, kuten mikrokystiinit ja saksitoksiinit, mutta osalla yhdisteistä voisi olla muokattuina myönteinen vaikutus ihmisten terveyteen. Tällaiset yhdisteet voivat mm. estää haitallisten patogeenien kasvua elimistössä tai vahingoittaa syöpäsoluja. Niinpä syanobakteerit ovat nousseet kiinnostavimpien eliöiden joukkoon uusia lääkkeeksi kelpaavia yhdisteitä etsittäessä. Kuitenkin vain harvasta syanobakteerikannasta on löydetty lääketieteelle potentiaalisia yhdisteitä ja niiden osuus on silloinkin vähäinen kyseisen kannan kaikista sadoista metabolian tuotteista. Näiden yhdisteiden löytäminen ja eristäminen edellyttävät tehokkaita seulonta- ja puhdistusmenetelmiä. Tutkimuksessa pyrittiin eristämään antileukeemisia fraktioita syanobakteerikannoista, joilla oli aiemmin todettu sytotoksisia ominaisuuksia solutesteissä. Fraktioista pyrittäisiin sitten tunnistamaan ja eristämään aktiivisuuden aiheuttama yhdiste tai yhdisteet. Fraktioinnissa käytettiin kiinteäfaasiuuttoa ja korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa. Fraktioiden antileukeemisuus testattiin alun perin ihmispotilaasta eristetyillä leukemiasoluilla. Edellä mainittuja menetelmiä käyttäen löydettiin yhdestä syanobakteerikannasta sytotoksisilta vaikuttavia yhdisteitä, jotka muistuttivat ominaisuuksiltaan karotenoideja. Tutkimuskannoilla suoritettiin myös maljadiffuusioon perustuvia seulontatestejä, joilla pyrittiin selvittämään syanobakteerikantojen metaboliittien kykyä estää erilaisten mikrobien kasvua sekä aiheuttaa hemolyysiä. Yksi tutkimuksessa mukana olleista kannoista ilmensi α-hemolyyttistä aktiivisuutta.Cyanobacteria produce several secondary metabolites which can be assorted into larger groups like peptides, polyketides and alkaloids based on their structure and synthesis pathways. Though the importance of these compounds to the cyanobacteria is under discussion, some compounds are detected to express bioactivity towards the cells of other organisms. The most known of these compounds are probably toxins like microcystins and saxitoxins which pose a health risk to humans and animals. However, some compounds, when modified, might have a positive affect towards human health. These compounds could for example inhibit the growth of pathogens in human body or harm cancer cells. Therefore, cyanobacteria have risen among the most promising organisms when it comes to finding new drug leads. Unfortunately only a few cyanobacteria strains seem to produce compounds with high medical potential and these compounds of interest are among the hundreds of others metabolites produced by the strain. Therefore, efficient screening and purification methods are needed. This study aimed to isolate antileukemic fractions from cyanobacteria strains, which had expressed cytotoxic activity in previous studies. The compounds of interest would be identified and purified out of these fractions. Fractions were made using solid phase extraction and high performance liquid chromatography. The antileukemic activity of the fractions were tested using human leukemia patient-derived cell line. Using described methods we found apparently cytotoxic compounds resembling carotenoids from one of the strains. We also performed screening based on plate diffusion. The tests were done in order to determine whether the compounds of cyanobacteria strains would be able to cause hemolysis or prevent growth of different microbes. One of the strains tested seemed to express α-hemolytic activity

Syöpälääkkeinä käytettävien antrasykliinien tuotto Escherichia coli -bakteerissa BioBrick-menetelmällä

Luonnontuotteet ja niiden johdannaiset ovat tärkeitä antibioottien ja syöpälääkkeiden lähteitä. Suuri osa näistä bioaktiivisista sekundaarimetaboliiteista tuotetaan jonkin Streptomyces-tuotantokannan avulla. Yhdisteiden tuottaminen Escherichia coli -bakteerin, eli kolibakteerin, avulla on kuitenkin yleensä nopeampaa, ja tuotantoreittien muokkaamiseen ja suunnitteluun käytettävät menetelmät yksinkertaisempia ja mahdollisuuksiltaan monipuolisempia. Tästä johtuen kolibakteerien hyödyntämistä luonnontuotteiden tuotannossa onkin tutkittu paljon. Sen hyödyntäminen lääketieteellisesti tärkeiden luonnontuotteiden, kuten tyypin II polyketidien tuotannossa on kuitenkin vielä alkutekijöissään. Antrasykliinit ovat tyypin II polyketidien alaluokka. Niiden rakenteet ovat monimutkaisia ja niiden muodostukseen liittyy useita eri tekijöitä. Antrasykliinien biosynteesiin osallistuu tyypillisesti 30-30 proteiinia. Vaikka tuotannon eri vaiheista ja mekanismeista tiedetään paljon, näiden muodostamassa kokonaisuudessa on edelleen avonaisia kysymyksiä. Tutkielman tarkoitus oli tuottaa nogalamysinonin synteesireitin polyketidejä kolibakteerissa fermentoimalla hyödyntäen Streptomyces nogalaterin geenejä. Tutkimuksen aikana kävi selväksi, ettei tämä reaktiotie toimi kuten odotettua, jolloin päädyin käyttämään homologisia geenejä aklasinomysiinin ja daunorubisiinin synteesireiteiltä. Daunorubisiinin fermentointitulokset vaikuttivat UPLC-tulosten perusteella lupaavilta. Nämä tulokset tulisi kuitenkin vielä varmentaa laajan mittakaavan kasvatuksissa ja NMR-mittauksilla. Tutkielman yksi tärkeimmistä päätelmistä on, että polyketidien tuotanto kolibakteerien avulla sen kaikki työkalut hyödyntäen on mahdollista. Polyketidien tuotanto kolibakteereissa on ollut haaste vuosikymmeniä, ja tulee varmasti olemaan vielä tulevaisuudessakin. Vaikka polyketidien tuotto kolibakteerien avulla vaatii vielä paljon tutkimusta ja lääkeaineiden tuoton teolliset sovellukset ovat edelleen kaukana, viime aikaiset tutkimustulokset ovat antaneet viitteitä, että tämä on mahdollista

Suursienten sienimyrkyt ja niiden vaikutukset

Sienilajeja tunnetaan maailmanlaajuisesti noin 100 000 lajia, joista noin 100 on ihmiselle myrkyllisiä. Sienten myrkyt voidaan jakaa karkeasti solumyrkkyihin, hermomyrkkyihin sekä muihin myrkkyihin. Tämä työ tarkastelee näiden erilaisten yhdisteiden vaikutuksia nisäkkäissä sekä niiden mahdollisia merkityksiä sienten kannalta

Suursienten sienimyrkyt ja niiden vaikutukset

Tiivistelmä. Sienilajeja tunnetaan maailmanlaajuisesti noin 100 000 lajia, joista noin 100 on ihmiselle myrkyllisiä. Sienten myrkyt voidaan jakaa karkeasti solumyrkkyihin, hermomyrkkyihin sekä muihin myrkkyihin. Tämä työ tarkastelee näiden erilaisten yhdisteiden vaikutuksia nisäkkäissä sekä niiden mahdollisia merkityksiä sienten kannalta

Bakteerien avulla antibiootteja mikrobi- ja syöpälääkkeiksi

Mikrobipohjaisilla luonnonyhdisteillä on vahva historia lääkekehityksessä. Maaperässä elävät aktinomykeetit ovat erityisen tunnettuja kyvyistään valmistaa kemiallisesti monimutkaisia bioaktiivisia yhdisteitä. Tavanomainen käyttökohde on bakteerilääkkeiden tuotto, mutta yhdisteitä käytetään yleisesti esimerkiksi myös syöpälääkkeinä, sienilääkkeinä ja loislääkkeinä. Esittelemme antibioottien historiaa ja avaamme nykyaikaisia geeniteknologiaan perustuvia menetelmiä, joiden avulla uusien yhdisteiden löytäminen on edelleen mahdollista. Tämä kehitys on johtanut useiden uusien ja eri toimintaperiaatteisiin perustuvien antibioottien löytymiseen luonnosta viime vuosien aikana. Luonnonyhdisteiden kemiallisen monimuotoisuuden jatkuva laajeneminen mahdollistaa uusien mikrobi- ja syöpälääkkeiden kehittämisen

Mikrobien tuottamat luonnonyhdisteet uusien lääkkeiden lähteenä

Mikrobien tuottamat luonnonyhdisteet ovat jo pitkään olleet tärkeä osa lääketeollisuutta, mutta uusia lääkkeiksi sopivia yhdisteitä ei ole enää löydetty samaan tahtiin kuin aluksi. Uusille mikrobien tuottamille bioaktiivisille yhdisteille on kuitenkin kasvava tarve muun muassa mikrobilääkeresistenssin lisääntyessä. Mikrobeista erityisesti streptomykeetti-bakteerit ovat olleet vuosikymmenten ajan merkittäviä luonnonyhdisteiden lähteitä tuottaen esimerkiksi puolet tunnetuista antibiooteista. Luonnonyhdisteet syntyvät biosynteesireittien tuloksena, ja synteesireittien eri vaiheista vastuussa olevat geenit sijaitsevat mikrobien DNA:ssa biosynteettisinä geeniryhminä (engl. biosynthetic gene cluster, BGC). Genomisekvensoinnin ollessa yhä laajemmin saatavilla ja genomitiedon analysoimiseen soveltuvien bioinformatiikan työvälineiden kehittyessä, mikrobien BGC:iden määrän on havaittu olevan huomattavasti suurempi, kuin niiden tuottamista yhdisteistä on voitu päätellä. BGC:iden ilmentyminen on tarkkaan säädeltyä, ja niistä suuri osa on laboratorio-olosuhteissa ilmentymättömiä. Uusien luonnonyhdisteiden tuottamiseksi BGC:t täytyy pystyä aktivoimaan. Aktivointiin soveltuvia menetelmiä on runsaasti, ja niiden kehittämisen ovat mahdollistaneet muun muassa saatavilla olevan genomitiedon kasvava määrä sekä genomien muokkaukseen soveltuvien teknologioiden kehitys. Menetelmät on mahdollista jaotella tiettyihin BGC:ihin kohdistettuihin menetelmiin sekä laajemmin vaikuttaviin eli pleiotrooppisiin menetelmiin

Structural and functional Studies of angucycline tailoring enzymes

Polyketides are a diverse group of natural products produced in many bacteria, fungi and plants. These metabolites have diverse biological activities and several members of this group are in clinical use as antibiotics, anticancer agents, antifungals and immunosuppressants. The different polyketides are produced by polyketide synthases, which catalyze the condensation of extender units into various polyketide scaffolds. After the biosynthesis of the polyketide backbone, more versatility is created to the molecule by tailoring enzymes catalyzing for instance hydroxylations, methylations and glycosylations. Flavoprotein monooxygenases (FPMO) and short-chain alcohol dehydrogenases/reductases (SDR) are two enzyme families that catalyze unusual tailoring reactions in the biosynthesis of natural products. In the experimental section, functions of homologous FPMO and SDR tailoring enzymes from five different angucycline pathways were studied in vitro. The results revealed how different angucyclinones are produced from a common intermediate and that FPMO JadH and SDR LanV are responsible for the divergence of jadomycins and landomycins, respectively, from other angucyclines. Structural studies of these tailoring enzymes revealed differences between homologous enzymes and enabled the use of structure-based protein engineering. Mutagenesis experiments gave important information about the enzymes behind the evolution of distinct angucycline metabolites. These experiments revealed a correlation between the substrate inhibition and bi-functionality in JadH homologue PgaE. In the case of LanV, analysis of mutagenesis results revealed that the difference between the stereospecificities of LanV and its homologues CabV and UrdMred is unexpectedly related to the conformation of the substrate rather than to the structure of the enzyme. Altogether, the results presented here have improved our knowledge about different steps of angucycline biosynthesis and the reaction mechanisms used by the tailoring enzymes behind these steps. This information can hopefully be used to modify these enzymes to produce novel metabolites, which have new biological targets or possess novel modes-of-action. The understanding of these unusual enzyme mechanisms is also interesting to enzymologists outside the field of natural product research.Siirretty Doriast

The effect of growth stage and silage additive on the fermentation characteristics and aerobic stability of white lupin-wheat silage

Tämän maisterintutkielman tavoitteena oli tutkia valkolupiinin (Lupinus albus) ja kevätvehnän (Triticum aestivum) seoskasvuston soveltuvuutta kokoviljasäilörehun raaka-aineeksi. Tutkimuksessa oli mukana kaksi seossuhdetta ja kaksi kehitysastetta. Erilaisilla säilöntäaineilla säilöttyjen rehujen laatua verrattiin kontrollina ilman säilöntäainetta tehtyyn painorehuun. Koerehut tehtiin Helsingin yliopiston Maataloustieteiden laitoksella 13. ja 27.8.2012. Ensimmäisessä kasvuasteessa (K1) vehnä oli taikinatuleentumisen alussa ja valkolupiinin palot olivat vihreitä ja täyttivät 50 % palkojen väliseinien välisestä tilasta. Toisessa kasvuasteessa (K2) vehnä oli taikinatuleentumisen lopussa ja lupiinin siemenet täyttivät 75 % palkojen väliseinien välisestä tilasta. Niiton jälkeen kasvustoista erotettiin eri kasvilajit, joista muodostettiin kaksi seosta. Ensimmäisessä (S1) oli tuorepainosta 1/3 valkolupiinia ja 2/3 vehnää, toisessa (S2) oli 2/3 valkolupiinia ja 1/3 vehnää. Säilöntäainekäsittelyt olivat: 1) ei säilöntäainetta (painorehu), 2) muurahaishappo (100 %:na 4 l/t), 3) natriumnitriitin (0,75 kg/t) ja heksamiinin (0,5 kg/t) seos ja 4) Lactobacillus plantarum 1x105 pmy/g. Rehut säilöttiin laboratoriosiiloissa kolmena rinnakkaisena. Siilot avattiin 100 vrk säilönnän jälkeen. Kokeessa määritettiin raaka-aineen koostumus, rehujen säilönnällinen laatu ja aerobinen stabiilisuus. Raaka-aineesta muodostettujen seosten kuiva-ainepitoisuus oli lupiinivaltaisissa seoksissa noin 220 g/kg ja vehnävaltaisissa seoksissa noin 300 g/kg. Valkolupiinin märkyys ja korkea puskurikapasiteetti, seoksen alhainen sokeripitoisuus ja klostridikontaminaatio vaikeuttivat säilöntää. Lupiinin osuuden noustessa seoksen raakavalkuais- ja sokeripitoisuus lisääntyi, mutta säilöttävyys heikkeni. Säilöntä ilman säilöntäainetta tuotti huonolaatuista rehua kaikissa rehuerissä. Painorehuissa esiintyi runsaasti voihappoa ja muita virhekäymiselle tyypillisiä käymishappoja ja valkuaisen hajoavuus oli suurta. Biologisella säilöntäaineella säilöttyjen rehujen laatu oli hyvä ensimmäisessä kasvuasteessa, kun raaka-aine oli kuivempaa ja seosten sokeripitoisuus oli suurempi. Toisessa kasvuasteessa biologinen säilöntäaine ei kuitenkaan toiminut yhtä hyvin ja rehujen laatu oli voihappo- ja ammoniakkipitoisuuden perusteella huono. Todennäköisesti muurahaishapon annostus ei ollut tässä kokeessa riittävä raaka-aineen vaikeaan säilöttävyyteen ja klostridimäärään nähden. Muurahaishapporehuissa esiintyi kaikissa rehuerissä paljon voihappoa. Toisessa kehitysasteessa myös valkuaisen hajoavuus oli suurta. Natriumnitriitin ja heksamiinin seoksen toimintavarmuus oli tässä kokeessa tutkituista säilöntäaineista paras. Natriumnitriitin ja heksamiinin seos tuotti hyvälaatuista säilörehua kaikissa rehuerissä. Vehnävaltaisissa seoksissa ei esiintynyt voihappoa lainkaan ja lupiinivaltaisissa seoksissakin pitoisuudet olivat erittäin pieniä. Suurin osa rehuista oli 13 päivän mittausjakson aikana aerobisesti stabiileja. Vain muutamat siilot lämpenivät (5/48 kpl) ja ne olivat aerobisesti varsin epästabiileja, sillä lämpeneminen tapahtui noin kahdessa vuorokaudessa ilmalle altistumisesta. Lämmenneistä siiloista valtaosa (4 kpl) oli biologisella säilöntäaineella säilöttyjä rehuja. Tämän tutkimuksen perusteella valkolupiini-vehnäkokoviljasäilörehun säilöntä on haastavaa. Raaka-aineen koostumuksen perusteella rehu kannattaa tehdä lupiinivaltaisemmasta seoksesta ja korjata aikaisemmassa vaiheessa, jos halutaan maksimoida rehun valkuais- ja sokeripitoisuus. Säilöntä on tällöin kuitenkin kuiva-ainepitoisuuden ja puskurikapasiteetin perusteella vaikeampaa ja sato jää pienemmäksi kuin myöhemmässä korjuussa. Säilönnässä tulee aina käyttää säilöntäainetta. Säilöntäaineista parhaiten toimi natriumnitriitin ja heksamiinin seos.The aim of this study was to investigate the esilability of white lupin (Lupinus albus) and spring wheat (Triticum aestivum) bi-crop when ensiled as a whole-crop. There were two plant mixture ratios and two growth stages in the study. Silages made with different additives were compared with untreated silages, which were as a control. The experimental silages were made at the research farm of the University of Helsinki in Viikki on August 13th and 27th, 2012. At the first growth stage (K1) wheat was at the beginning of dough stage and the pods of white lupin were green and the seeds filled 50 % of space between septa. At the second growth stage (K2) wheat was at the end of dough stage and the seeds filled 75 % of space between septa. After mowing plant species were separated and two ratios were formed. The first ratio comprised 1/3 white lupin and 2/3 wheat and the second 2/3 white lupin and 1/3 wheat of fresh weight. The additive treatments were: 1) without additive (untreated), 2) formic acid (4 l/t as a 100% acid), 3) the mixture of sodium nitrite (0,75 kg/t) and hexamine (0,5 kg/t) and 4) Lactobacillus plantarum 1x106 cfu/g. Silages were ensiled in the laboratory scale silos in triplicate. Silos were opened after 100 days of ensiling. The chemical composition of raw material at harvest and the fermentation characteristics and aerobic stability of silages were determined in the experiment. The dry matter content of plant mixtures was about 220 g/kg in the mixtures with higher proportions of lupin and about 300 g/kg in the mixtures with higher proportions of wheat. The preservation of silages were impeded by the low dry matter content and high buffering capacity of white lupin, the low sugar content of the mixtures and clostridial contamination. As the proportion of lupin increased the crude protein and sugar content of the mixture increased but the ensilability of the mixture declined. Preservation without additive produced low quality silages in all silage batches. High amounts of ammonia, butyric acid and other fermentation acids typical of bad silage fermentation were detected in the untreated silages. The fermentation quality was good in silages made with Lactobacillus plantarum at the first growth stage when the raw material was dryer and the sugar content of mixtures were higher. Based on the butyric acid and ammonia concentrations the use of Lactobacillus plantarum resulted in poor quality silages at the second growth stage. The dose of formic acid in this experiment wasn’t probably high enough in regard to the poor ensiling properties of raw material and clostridial contamination. High amounts of butyric acid were detected in all silages treated with formic acid. At the second growth stage the ammonia concentrations were also high. The most effective additive in the experiment was the mixture of sodium nitrite and hexamine resulting in good fermentation quality in all silage batches. No butyric acid was detected from the mixtures with higher proportions of wheat and amounts were extremely low also in the mixtures with higher proportions of lupin. Most of the silages were aerobically stable during 13 days of the period of measurement. Only a few silos (5 out of 48) were aerobically deteriorated and those silos were very unstable as the warming was noticed within 2 days. Most of the deteriorated silos (4) were treated with biological additive. Based on the present results the ensiling of white lupin-wheat whole-crop silage is difficult. The composition of raw material suggests that silage should be made from the mixture where the proportion of lupin is higher and cut at the earlier growth stage if the maximization of crude protein and sugar content is wanted. However, the ensilability of raw material is more difficult on the basis of dry matter content and buffering capacity. The yield is also lower than later in the growth stage. Silage additive should always be used when ensiling white lupin. The mixture of sodium nitrite and hexamine was the most effective additive in the study