ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГАЛЛОВОЙ КИСЛОТЫ, КАТЕХИНА, ЭПИКАТЕХИНА И КОФЕИНА В ЭКСТРАКТАХ ЧЕРНОГО ЧАЯ

Catechins, contained in tea, exhibit biological activity with its antioxidant, anticarcinogenic and antimutagenic properties. Catechins and other individual substances contained in the tea extract can be detected using the chromatographic method (HPLC) or the capillary electrophoresis (CE). Taking into account the composition of the tea, the extractability, stability and biological activity of its components, and the opportunity of their simultaneous determination,  Catechin (CT), Epicatechin (ECT), Gallic acid (GC) and caffeine (CF) were chosen as the indicator substances. These substances were extracted with hot water, separated in gradient elution conditions and determined by diode-array detector in UV-spectra. Direct quantitative determination of CT and ECT at 210 nm, GC and CF at 270 nm is possible if the analyte content in the extract is above 1 µg/ml. The developed method provides a complete separation of analytes, absence of foreign substances influences and the precision of the results (sr 7 %). The duration of the analysis of one sample was about 1.5 hours. The accuracy of the results was confirmed by the "added-found" method. The resulting data is consistent with the results of the analysis of the same samples by CE. According to the developed method the extracts of 14 black tea samples, which differed according to the type of tea plants and trade names, were analyzed. For all samples the analytes’ contents found reduced in a CF GC ECT CT sequence. The average content of “macrocomponents” (GC and CF) in the extracts of different samples was rather close. The content of “microcomponents” (ECT, as well CT) differed significantly more (4-5 times), and this cannot be explained by the random errors in the analysis.  The content of CT and ECT in different samples was correlated. The greatly varying ECT (or CT) content in the extract from one sample to the other may be a new indicator of the quality of black tea and more informative than the commonly used integrated indicators.  In conclusion, the significance of the obtained results and the perspectives of their practical application were discussed.Key words: HPLC, phenolic compounds, catechins, black tea, analysis of tea, quality measures, identification of quality measures.(Russian) DOI: http://dx.doi.org/10.15826/analitika.2015.19.4.011 Tsypko T.G., Mareeva D.O., Milevskaia V.V., Temerdashev A.Z.Federal State Educational Institution Kuban State University, Krasnodar, Russian Federation Катехины, входящие в состав чая, проявляют биологическую активность, обуславливая его антиоксидантные, антиканцерогенные и антимутагенные свойства. Содержания катехинов и других индивидуальных соединений в чайном экстракте находят хроматографическим методом (ВЭЖХ) или методом капиллярного электрофореза (КЭ). Учитывая состав чая, экстрагируемость, устойчивость и биологическую активность его компонентов, а также возможность их раздельного определения, в качестве индикаторных соединений выбрали катехин (КТ), эпикатехин (ЭКТ), галловую кислоту (ГК) и кофеин (КФ). Эти соединения экстрагировали горячей водой, разделяли в режиме градиентного элюирования и определяли методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором в УФ-области.  Прямое количественное определение КТ и ЭКТ при 210 нм, а ГК и КФ при 270 нм возможно, если содержания аналитов в экстракте выше 1 мкг/мл. Методика обеспечивает полное разделение аналитов, отсутствие влияния посторонних веществ и прецизионность результатов (sr 7 %). Длительность анализа одной пробы около 1.5 ч. Правильность результатов подтверждена методом «введено-найдено». Полученные данные согласуются с результатами анализа тех же проб методом КЭ. По разработанной методике проанализированы экстракты 42  образцов черного чая (14 торговых наименований, различающихся по типу чайного растения).  Для всех образцов найденные содержания аналитов  снижаются в ряду  КФ ГК ЭКТ КТ.  Усредненные содержания «макрокомпонентов» (КФ и ГК) в экстрактах из разных образцов довольно близки. Значительно сильнее (в 4-5 раз) различаются содержания «микрокомпонентов» (ЭКТ, а также КТ), что нельзя объяснить случайными погрешностями анализа. Содержания КТ и ЭКТ в разных образцах достоверно закоррелированы. Сильно меняющееся от образцу к образцу содержание ЭКТ (или КТ) в экстракте может быть новым показателем качества черного чая, более информативным, чем обычно применяемые интегральные показатели. Охарактеризованы значимость полученных результатов и перспективы их практического использования.Ключевые слова: ВЭЖХ, фенольные соединения, катехины, черный чай, анализ чая, показатели качества, выбор показателей. DOI: http://dx.doi.org/10.15826/analitika.2015.19.4.01

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ В ЧАЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ РАЗНЫХ ВАРИАНТОВ МЕТОДА FRAP

The total content (cΣ) of phenolic antioxidants (PhA) in black tea samples was determined at 10-3 mol/g level using different variations of the FRAP assay. The spectrometric analysis was performed in two independent laboratories using different subsidiary reagents (o-phenanthroline or 2.2'-dipyridyl) and different exposure times (60 or 10 min). The results of the analysis (c*) of tea samples were recalculated to different standard substances (Xst), namely gallic and ascorbic acids. The obtained data defined the total antioxidant activity of tea samples. The use of a weaker oxidizing agent (Fe3 ++ 2.2'-dipyridyl) in each case led to slightly lower values of c* (mM-eq/g) than the use of another agent (Fe3+ + o-phenanthroline). For the two samples the discrepancies were statistically reliable and for all samples they did not exceed 20% rel. The calculations obtained with the additives method or with the calibration curve (all other things being equal) led to the coincident values of c*. This fact indicated that the tea infusions did not contain any substances that reduced the sensitivity of PhA determination, and particularly did not include iron-binding complexants. The intervals of possible сΣ values were calculated for each sample taking into account the intragroup selectivity of the signals. The width of this interval defined the uncertainty of PhA total content data. The calculated interval estimates included c* values obtained with another Xst. These intervals were an order of magnitude wider than the confidence intervals calculated with the Student algorithm, which considers only the measurement precision. The approximate coincidence of the interval estimates obtained with the different standard substances, makes the FRAP assay appropriate not only for calculating the total index "antioxidant activity", but also for an objective estimate of the total PhA content. Obviously, the FRAP assay can be taken as a foundation of a new way to control the tea quality; this way seems to be more accurate and less sensitive to the influence of foreign substances than the conventional for many laboratories Folin-Ciocalteu method. The expression of the analysis results without recalculation of the Xst concentration is likely to provide the metrological correctness of these results. Current but still unresolved problem is to reduce the uncertainty of сΣ interval estimates. To solve this problem, it is necessary to level the sensitivity coefficients of the individual antioxidants.Keywords: tea, phenolic antioxidants, total content, interval estimates, analytical control, FRAP assay, antioxidant activity(Russian)DOI: http://dx.doi.org/10.15826/analitika.2019.23.1.011T.G. Tsypko1,  N.S. Brilenok2,  K.S. Guschaeva1,  V.I. Vershinin2  1 Kuban State University, Stavropolskaja str. 149, Krasnodar, 350040, Russian Federation2 Dostoevsky Omsk State University, Mira str. 55a, Omsk, 644077, Russian FederationСуммарное содержание (сΣ) фенольных антиоксидантов (ФА) в образцах черного чая определяли на уровне 10-3 моль/г, используя разные варианты метода FRAP. Спектрофотометрический анализ образцов вели в двух независимых лабораториях, применяя разные реагенты (о-фенантролин и 2.2'-дипиридил) и разные времена экспозиции (60 и 10 минут). Результаты анализа (с*), выраженные в пересчете на  разные стандартные вещества (галловую и аскорбиновую кислоты), характеризуют антиоксидантную активность чая (АОА). Применение более слабой окислительной системы (Fe3+ + 2.2'-дипиридил) ведет к несколько меньшим значениям с*, выраженным в мМ-экв/г, чем применение системы (Fe3+ + о-фенантролин). Для части образцов расхождения статистически достоверны, но во всех случаях они не превышают 20 % отн. Расчеты АОА по способу добавок и по градуировочному графику дают совпадающие значения, что указывает на отсутствие в чайных настоях веществ, снижающих чувствительность определения ФА, в частности железосвязывающих комплексантов. Интервальные оценки сΣ рассчитывали по найденным значениям с* с учетом внутригрупповой селективности сигналов. Полученные интервалы на порядок шире доверительных интервалов, вычисляемых по Стьюденту с учетом прецизионности измерений, и включают значения с*, полученные с применением другого стандартного вещества (Хст). Приблизительное совпадение интервалов возможных значений сΣ, полученных с применением разных методик измерения сигналов и разных Хст, позволяет считать метод FRAP пригодным не только для вычисления интегрального показателя АОА, но и для объективной оценки суммарного содержания ФА в чае. Очевидно, метод FRAP может стать основой нового способа контроля качества чая, менее чувствительного к влиянию посторонних веществ, чем традиционно применяемый в контрольно-аналитических лабораториях метод Фолина-Чокальтеу. Выражение результатов анализа чая по методу FRAP без пересчета на Хст  обеспечит их метрологическую корректность. Актуальной и пока что нерешенной задачей является снижение неопределенности результатов такого анализа. Способом решения этой задачи является сближение коэффициентов чувствительности при спектрофотометрическом определении индивидуальных ФА. Ключевые слова: чай, фенольные антиоксиданты, суммарное содержание, интервальные оценки, аналитический контроль, метод FRAP,  антиоксидантная активность DOI: http://dx.doi.org/10.15826/analitika.2019.23.1.01

HPLC determination and estimation of gallic acid, catechin, caffeine and epicatechin content in black tea extracts

Катехины, входящие в состав чая, проявляют биологическую активность, обуславливая его антиоксидантные, антиканцерогенные и антимутагенные свойства. Содержания катехинов и других индивидуальных соединений в чайном экстракте находят хроматографическим методом (ВЭЖХ) или методом капиллярного электрофореза (КЭ). Учитывая состав чая, экстрагируемость, устойчивость и биологическую активность его компонентов, а также возможность их раздельного определения, в качестве индикаторных соединений выбрали катехин (КТ), эпикатехин (ЭКТ), галловую кислоту (ГК) и кофеин (КФ). Эти соединения экстрагировали горячей водой, разделяли в режиме градиентного элюирования и определяли методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором в УФ-области. Прямое количественное определение КТ и ЭКТ при 210 нм, а ГК и КФ при 270 нм возможно, если содержания аналитов в экстракте выше 1 мкг/мл. Методика обеспечивает полное разделение аналитов, отсутствие влияния посторонних веществ и прецизионность результатов ( s r < 7 %). Длительность анализа одной пробы около 1.5 ч. Правильность результатов подтверждена методом «введено-найдено». Полученные данные согласуются с результатами анализа тех же проб методом КЭ. По разработанной методике проанализированы экстракты 42 образцов черного чая (14 торговых наименований, различающихся по типу чайного растения). Для всех образцов найденные содержания аналитов снижаются в ряду КФ > ГК > ЭКТ > КТ. Усредненные содержания «макрокомпонентов» (КФ и ГК) в экстрактах из разных образцов довольно близки. Значительно сильнее (в 4-5 раз) различаются содержания «микрокомпонентов» (ЭКТ, а также КТ), что нельзя объяснить случайными погрешностями анализа. Содержания КТ и ЭКТ в разных образцах достоверно закоррелированы. Сильно меняющееся от образцу к образцу содержание ЭКТ (или КТ) в экстракте может быть новым показателем качества черного чая, более информативным, чем обычно применяемые интегральные показатели. Охарактеризованы значимость полученных результатов и перспективы их практического использования.Catechins, contained in tea, exhibit biological activity with its antioxidant, anticarcinogenic and antimutagenic properties. Catechins and other individual substances contained in the tea extract can be detected using the chromatographic method (HPLC) or the capillary electrophoresis (CE). Taking into account the composition of the tea, the extractability, stability and biological activity of its components, and the opportunity of their simultaneous determination, Catechin (CT), Epicatechin (ECT), Gallic acid (GC) and caffeine (CF) were chosen as the indicator substances. These substances were extracted with hot water, separated in gradient elution conditions and determined by diode-array detector in UV-spectra. Direct quantitative determination of CT and ECT at 210 nm, GC and CF at 270 nm is possible if the analyte content in the extract is above 1 µg/ml. The developed method provides a complete separation of analytes, absence of foreign substances influences and the precision of the results ( s r < 7 %). The duration of the analysis of one sample was about 1.5 hours. The accuracy of the results was confirmed by the "added-found" method. The resulting data is consistent with the results of the analysis of the same samples by CE. According to the developed method the extracts of 14 black tea samples, which differed according to the type of tea plants and trade names, were analyzed. For all samples the analytes’ contents found reduced in a CF > GC > ECT > CT sequence. The average content of “macrocomponents” (GC and CF) in the extracts of different samples was rather close. The content of “microcomponents” (ECT, as well CT) differed significantly more (4-5 times), and this cannot be explained by the random errors in the analysis. The content of CT and ECT in different samples was correlated. The greatly varying ECT (or CT) content in the extract from one sample to the other may be a new indicator of the quality of black tea and more informative than the commonly used integrated indicators. In conclusion, the significance of the obtained results and the perspectives of their practical application were discussed

features of the element composition of krasnodar tea of Colchis variety

The range of content of a number of essential macro- and microelements, as well as non-essential and toxic elements in a 3-leaf flush of Colchis tea (raw material) grown in the conditions of the Black Sea coast of Russia has been established. The content of the main macronutrients was within (in% of abs. dry sub.): N-3.80-5.44; P-0.38-0.56; K-1.55-1.78; Ca-0.14-0.24; Mg-0.19-0.22. The content of micro- elements was (in mg / kg): Mn - 423-856; Fe - 28.8-52.2; Zn 29.6-45.8; Co-0.11-0.27. The content of non-essential and toxic elements varied in the following ranges (in mg / kg): Al -114-349; Si-25.4-98.2; Na-6.57-19.02; Ba-3.25-8.83; Ni-5.49-12.24; Pb-0.32-3.95; Ti-0.27-1.11; V-0.042-0.060; Li-0.04-0.08; Cr-0.13-0.30; Cd is 0.01-0.03

Determination of the total phenol antioxidants content in tea samples using diff erent variations of FRAP assay

Submitted 12 December 2018Поступила в редакцию 12 декабря 2018 г.The total content (c.) of phenolic antioxidants (PhA) in black tea samples was determined at 10-3 mol/g level using different variations of the FRAP assay. The spectrometric analysis was performed in two independent laboratories using different subsidiary reagents (o-phenanthroline or 2.2.-dipyridyl) and different exposure times (60 or 10 min). The results of the analysis (c*) of tea samples were recalculated to different standard substances (Xst), namely gallic and ascorbic acids. The obtained data defined the total antioxidant activity of tea samples. The use of a weaker oxidizing agent (Fe3 ++ 2.2.-dipyridyl) in each case led to slightly lower values of c* (mM-eq/g) than the use of another agent (Fe3+ + o-phenanthroline). For the two samples the discrepancies were statistically reliable and for all samples they did not exceed 20% rel. The calculations obtained with the additives method or with the calibration curve (all other things being equal) led to the coincident values of c*. This fact indicated that the tea infusions did not contain any substances that reduced the sensitivity of PhA determination, and particularly did not include iron-binding complexants. The intervals of possible с. values were calculated for each sample taking into account the intragroup selectivity of the signals. The width of this interval defined the uncertainty of PhA total content data. The calculated interval estimates included c* values obtained with another Xst. These intervals were an order of magnitude wider than the confidence intervals calculated with the Student algorithm, which considers only the measurement precision. The approximate coincidence of the interval estimates obtained with the different standard substances, makes the FRAP assay appropriate not only for calculating the total index “antioxidant activity”, but also for an objective estimate of the total PhA content. Obviously, the FRAP assay can be taken as a foundation of a new way to control the tea quality; this way seems to be more accurate and less sensitive to the influence of foreign substances than the conventional for many laboratories Folin-Ciocalteu method. The expression of the analysis results without recalculation of the Xst concentration is likely to provide the metrological correctness of these results. Current but still unresolved problem is to reduce the uncertainty of с. interval estimates. To solve this problem, it is necessary to level the sensitivity coefficients of the individual antioxidants.Суммарное содержание (с.) фенольных антиоксидантов (ФА) в образцах черного чая определяли на уровне 10-3 моль/г, используя разные варианты метода FRAP. Спектрофотометрический анализ образцов вели в двух независимых лабораториях, применяя разные реагенты (о-фенантролин и 2.2.-дипиридил) и разные времена экспозиции (60 и 10 минут). Результаты анализа (с*), выраженные в пересчете на разные стандартные вещества (галловую и аскорбиновую кислоты), характеризуют антиоксидантную активность чая (АОА). Применение более слабой окислительной системы (Fe3+ + 2.2.-дипиридил) ведет к несколько меньшим значениям с*, выраженным в мМ-экв/г, чем применение системы (Fe3+ + о-фенантролин). Для части образцов расхождения статистически достоверны, но во всех случаях они не превышают 20 % отн. Расчеты АОА по способу добавок и по градуировочному графику дают совпадающие значения, что указывает на отсутствие в чайных настоях веществ, снижающих чувствительность определения ФА, в частности железосвязывающих комплексантов. Интервальные оценки с. рассчитывали по найденным значениям с* с учетом внутригрупповой селективности сигналов. Полученные интервалы на порядок шире доверительных интервалов, вычисляемых по Стьюденту с учетом прецизионности измерений, и включают значения с*, полученные с применением другого стандартного вещества (Хст). Приблизительное совпадение интервалов возможных значений с., полученных с применением разных методик измерения сигналов и разных , позволяет считать метод FRAP пригодным не только для вычисления интегрального показателя Хст АОА, но и для объективной оценки суммарного содержания ФА в чае. Очевидно, метод FRAP может стать основой нового способа контроля качества чая, менее чувствительного к влиянию посторонних веществ, чем традиционно применяемый в контрольно-аналитических лабораториях метод Фолина-Чокальтеу. Выражение результатов анализа чая по методу FRAP без пересчета на Хст обеспечит их метрологическую корректность. Актуальной и пока что нерешенной задачей является снижение неопределенности результатов такого анализа. Способом решения этой задачи является сближение коэффициентов чувствительности при спектрофотометрическом определении индивидуальных ФА.This work was funded by RFBR and Omsk Region Administration according to the research projects № 17-03-01254 and 16-03-550479. The scientific equipment of the Ecological Analytical Center of Kuban State University was used for the research, the unique identifier is RFMEFI59317X0008.Исследования проведены при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Омской области (гранты 17-03-01254 и 16-03-550479). Использовано научное оборудование ЦКП «Эколого-аналитический центр» КубГУ (уникальный идентификатор RFMEFI59317X0008)

Determination of total content of antioxidants by FRAP assay

Выполнен обзор публикаций по определению суммарной антиоксидантной активности пищевых продуктов и других объектов методом FRAP. Оптимизировано влияние разных факторов на величину аналитического сигнала. Результаты анализа модельных смесей антиоксидантов (полифенолов) отличаются от суммарного содержания компонентов (в моль/л) в основном из-за разной стехиометрии взаимодействия компонентов с реагентом-окислителем. Для уменьшения систематической погрешности надо выражать результат анализа не в молях или миллиграммах, а в моль-эквивалентах стандартного вещества.Brief review of publications devoted to FRAP assay shows it as the tool for determination of total antioxidant capacity of foodstuffs and other objects. The effect of various factors on analytical signal has been investigated and optimized. Results of model mixtures analysis differ from total content of antioxidants (polyphenols). The main reason of such errors is the specific stoichiometry of components oxidation by oxydizing reagent. To decrease these errors we recommend to evaluate results of analysis not in moles or in milligrams, but in moles of equivalents