Identification of Thai cassava cultivars using SCAR markers and multiplex PCR

บทคัดย่อ มันสำปะหลังเป็นพืชเศรษฐกิจที่มีความสำคัญ และมีการคัดเลือกพันธุ์ปลูกที่มีเปอร์เซ็นต์แป้งสูงเพื่ออุตสาหกรรม แต่พันธุ์ปลูกที่ได้รับการพัฒนาอาจมีลักษณะสัณฐานวิทยาคล้ายคลึงกัน ดังนั้นการจำแนกพันธุ์ปลูกจึงต้องอาศัยบุคลากรที่มีความชำนาญ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลสำหรับระบุพันธุ์ปลูกของมันสำปะหลังไทยจำนวน 16 พันธุ์ปลูกที่ได้จากแหล่งเชื้อพันธุกรรมในศูนย์วิจัยพืชไร่ระยอง โดยนำแถบดีเอ็นเอซึ่งมีความแตกต่างกันในพันธุ์ปลูกต่างๆ ที่ได้จากการทำ HAT-RAPD มาโคลนและหาลำดับนิวคลีโอไทด์ เพื่อออกแบบไพรเมอร์สำหรับ SCAR ที่มีความจำเพาะจำนวน 4 คู่ โดย SCAR marker ที่ได้สามารถใช้จำแนกพันธุ์ปลูกของมันสำปะหลังได้ ดังนี้ (1) 308-bp marker และ 850-bp marker ใช้ระบุอัตลักษณ์ของพันธุ์ปลูกระยอง 60 และห้านาที ตามลำดับ (2) 414-bp marker ใช้ระบุกลุ่มพันธุ์ปลูกระยอง 1 ระยอง 11 ระยอง 90 ระยอง 86-13 ห้วยบง 60 และเกษตรศาสตร์ 50 (3) 273-bp marker ใช้ระบุกลุ่มพันธุ์ปลูกระยอง 3 ระยอง 9 และระยอง 72 และ (4) 414-bp marker และ 273-bp marker ใช้ระบุกลุ่มพันธุ์ปลูกระยอง 5 และห้วยบง 80 นอกจากนี้ ยังได้มีการพัฒนาเทคนิค multiplex PCR ที่เหมาะสมกับการใช้ไพรเมอร์สำหรับ SCAR พร้อมกันทั้ง 4 คู่ในหนึ่งปฏิกิริยา เพื่อให้การตรวจสอบดีเอ็นเอเป้าหมายมีความรวดเร็วและประหยัดยิ่งขึ้น ABSTRACT   Cassava is an important economic crop which has been artificially selected to improve cultivars with high industrial yield of starch. Based on their morphoagronomic descriptors however, several improved cultivars are similar. Hence, accurate identification of each cultivar requires well-trained personnel. This study aimed to establish molecular markers for the identification of 16 Thai cassava cultivars from the germplasm collection in Rayong Field Crops Research Center. HAT-RAPD amplicons which were distinctive among the cultivars were employed for molecular cloning. Based on nucleotide sequences obtained four SCAR primer pairs were designed. SCAR markers were generated and used to differentiate the cultivars as follows: (1) 308-bp marker and 850-bp marker for Rayong 60 and Hanatee, respectively; (2) 414-bp marker for Rayong 1, Rayong 11, Rayong 90, Rayong 86-13, Huay Bong 60 and Kasetsart 50; (3) 273-bp marker for Rayong 3, Rayong 9 and Rayong 72; and (4) 414-bp and 273-bp markers for Rayong 5 and Huay Bong 80. For the procedure to be less time-consuming and more cost-effective, efficient multiplex PCR with optimal conditions was developed to incorporate all four pairs of SCAR primers in a single PCR reaction

HAT-RAPD Fingerprinting Analysis of Thai Cassava Germplasm and Economic Cultivars of Farmers’ Preferences

บทคัดย่อการศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของมันสำปะหลัง (Manihot esculenta Crantz) จำนวน 19 พันธุ์ปลูก โดยใช้เทคนิค high annealing temperature-random amplified polymorphic DNA (HAT-RAPD) ประกอบด้วยพันธุ์ปลูกที่ได้จากแหล่งเชื้อพันธุกรรมของศูนย์วิจัยพืชไร่ระยอง 16 พันธุ์ปลูก และพันธุ์ปลูกซึ่งเป็นที่นิยมของเกษตรกร 3 พันธุ์ปลูกจากจังหวัดนครราชสีมา ในการใช้ไพรเมอร์แบบสุ่มทั้งหมด 28 ไพรเมอร์ พบว่า 21 ไพรเมอร์ให้แถบดีเอ็นเอที่มีความแตกต่าง เมื่อวิเคราะห์ความต่างทางพันธุกรรมของพันธุ์ปลูกแต่ละคู่โดยใช้ Nei’s genetic distance พบว่ามีความแตกต่างตั้งแต่ 3 ถึง 82% นอกจากนี้เดนโดรแกรมแสดงความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของมันสำปะหลังที่ศึกษาด้วย unweighted pair group  method with arithmetic mean (UPGMA) จากแถบดีเอ็นเอที่มีความแตกต่างจำนวน 61 แถบ สามารถจัดกลุ่มทั้ง 19 พันธุ์ปลูก เป็น 5 กลุ่ม โดยแบ่งเป็นตัวอย่างของพันธุ์ขมจำนวน 4 กลุ่ม และพันธุ์หวานจำนวน 1 กลุ่ม ภายในกลุ่มของพันธุ์ขมพบ 3 พันธุ์ปลูกเศรษฐกิจที่นิยมโดยเกษตรกร ได้แก่ พันธุ์เกล็ดมังกร (มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับพันธุ์ระยอง 72) พันธุ์ไจแอนท์ (จัดอยู่ในกลุ่มเดียวกันกับพันธุ์ห้วยบง 60 และพันธุ์ห้วยบง 80) และพันธุ์นาคขาว (จัดอยู่ในกลุ่มเดียวกันกับพันธุ์ระยอง 3 และพันธุ์ระยอง 5) คำสำคัญ: มันสำปะหลัง แหล่งเชื้อพันธุกรรมมันสำปะหลัง เทคนิค HAT-RAPD วิธี UPGMAABSTRACTSixteen cultivars of cassava (Manihot esculenta Crantz) were obtained from the germplasm collection in Rayong Field Crops Research Center, and three other economic cultivars of farmers’ preferences from a well-established cassava plantation in Nakhon Ratchasima. Genetic diversity of these nineteen cultivars was assessed by high annealing temperature-random amplified polymorphic DNA (HAT-RAPD) technique. Out of 28 random primers used, 21 generated polymorphic bands. Pairwise distances between taxa calculated using Nei’s genetic distance varied from 3 to 82%. An unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) dendrogram constructed based on 61 RAPD characters classified all 19 cultivars into five clusters, four of which containing bitter-type accessions and one accommodating sweet-type accessions. The bitter-type clusters possessed three cultivars of farmers’ preferences, including Gled Mangorn (closely related to Rayong 72), Giant (placed with Huay Bong 60 and Huay Bong 80), and Nak Khao (placed with Rayong 3 and Rayong 5).Keywords: Manihot esculenta Crantz, cassava germplasm, HAT-RAPD technique, UPGMA metho

Species identification of economic bamboos in the genus Dendrocalamus using SCAR and multiplex PCR

Taxonomic and systematic studies of bamboos are traditionally based on floral morphology, but this can lead to difficulties in identification because of the irregular reproductive cycle of the bamboos. To overcome such problems several molecular-marker approaches have been used. In this study, eight species of the woody bamboos belonging to the genus Dendrocalamus were employed. For each species, DNA samples of 20 individual plants from different localities were isolated and then pooled to make eight bulks of DNA. Fifty RAPD primers were used to screen all bulked DNA samples. Only five primers yielded consistent and reproducible RAPD band patterns across all 160 individuals. The amplicons were present among five species of Dendrocalamus, but were absent in the other three species. They were cloned, sequenced and subsequently, five pairs of SCAR primers were designed. All SCAR primers were combined in multiplex PCR reactions to unequivocally discriminate five species of Dendrocalamus

MOLECULAR DISCRIMINATION BETWEEN INDIVIDUAL METACERCARIAE OF PARAGONIMUS HETEROTREMUS AND P. WESTERMANI OCCURRING IN THAILAND

Abstract. To accurately discriminate between individual metacercariae of Paragonimus heterotremus and P. westermani occurring in Thailand, polymerase chain reaction (PCR)-based molecular methods were established and subjected to an evaluation. We first amplified and sequenced the second internal transcribed spacer (ITS2) region of the nuclear ribosomal DNA of the two species. Based on their nucleotide differences, P. heterotremus and P. westermani were unequivocally discriminated from each other. These nucleotide differences were further utilized to select the ApaL1 endonuclease site for PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analyses and to design species-specific primers for multiplex PCR reactions. Both PCR-RFLP and multiplex PCR methods allowed a more rapid and labor-effective species discrimination. Furthermore, the multiplex PCR method enabled the most efficient discrimination because species identification involved a single round of PCR in a single tube. In Thailand, P. heterotremus is the only species affecting humans. Thus, the methods established in the present study can be used as reliable tools to identify the lung fluke metacercariae that cause human disease. primers. All of these methods utilize nucleotide differences in the second internal transcribed spacer (ITS2) of the nuclear ribosomal DNA (rDNA) for dicrimination between the two species. In the present study, we focused on the lung flukes occurring in Thailand and applied the methods for species discrimination between individual metacercariae of P. heterotremus and P. westermani. MATERIALS AND METHODS Parasite material and DNA isolation The metacercariae of P. heterotremus and P. westermani DNA amplification, restriction digestion and sequencing The rDNA region spanning the ITS2 from individual metacercariae of the two species was amplified by PCR using the primers, 3S (forward, 5'-GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG-3') and A28 (reverse, 5'-GGGATCCTGGTTAGTTTCTTTT CCTCCGC-3'). These primers were designed on the basis of the conserved rDNA sequences of the Schistosoma specie

Molecular systematics of a new form of Paragonimus westermani discovered in Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public Health

Abstract. This study aimed to clarify evolutionary relationships of P. westermani-like with other members of Paragonimus in Asia. The parsimony method was employed in molecular analyses of the second internal transcribed spacer (ITS2) region of nuclear ribosomal DNA and the partial cytochrome c oxidase subunit I (COI) region of mitochondrial DNA. A single most parsimonious tree obtained from the ITS2 region revealed two important groups within P. westermani complex that is based on geographical origins. From this study, it is evident that P. westermani-like is either placed well within the P. westermani complex or is located close to the complex. Since a significant genetic variation was observed between Thai P. westermani and P. westermani-like, further investigation on the specificity of first intermediate hosts should be carried out to determine a proper taxonomic status of P. westermani-like