The Role of Protein Palmitoylation for Protein Function at the Yeast vacuole

Der Stoffaustausch zwischen den Organellen eukaryotischer Zellen basiert auf dem geordneten Transport von Vesikeln. Diese entstehen durch Abschnürung der Membran des Donor-Kompartiments, nachdem die zu transportierende Fracht spezifisch angereichert worden ist. Die Vesikel fusionieren nach Erreichen des Ziel-Kompartiments mit dessen Membran und geben ihren Inhalt an das Innere des Kompartiments ab. Ein Großteil der Proteine, die eine Rolle beim vesikulären Trafficking spielen sind periphere Membranproteine, die aus dem Cytosol rekrutiert werden. Diese Proteine benötigen Membranrezeptoren, spezifische Lipide oder Lipidanker, um an die Membran zu binden. In meiner Doktorarbeit habe ich Lipidmodifikationen, die die physikalischen und funktionalen Eigenschaften von Proteinen beeinflussen, näher untersucht. Palmitoylierung ist eine Lipidmodifikation, die die Membranassoziierung von Proteinen erleichtert. Es handelt sich dabei um eine reversible Anbindung eines Palmitatrestes durch eine Thioesterbindung an die Thiolgruppe eines Cysteins im Zielprotein. Neben seiner Funktion als Membrananker beeinflusst der Palmitatrest die Funktion des angebundenen Proteins. Als Modellsystem wählte ich die Vakuole der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, die in ihrer Funktion den Lysosomen höherer Eukaryoten entspricht. Das vakuoläre Hefeprotein Vac8 ist palmitoyliert und wird in der Zelle für die Vakuolenfusion, die Kontrolle der Vakuolenmorphologie und die Weitergabe von Vakuolen an die Tochterzelle bei der Zellteilung, im folgenden Vererbung genannt, benötigt. In meinen Studien habe ich zwei wichtige Aspekte der Vac8-Palmitoylierung im Besonderen untersucht: (i) wie beeinflusst die Palmitoylierung die Funktion von Vac8 und (ii) auf welche Weise wird die Palmitoylierung von Vac8 reguliert? 1.Der Einfluß der Palmitoylierung auf die Funktion von Vac8. Vac8 beinhaltet eine N-terminale Src homology (SH) 4 Domäne, in der sich die Aminosäurereste befinden, die myristoyliert und palmitoyliert werden. In den meisten Fällen werden Proteine jeweils einmal myristoyliert und palmitoyliert, um stabil in der Membran verankert zu werden. Vac8 besitzt demgegenüber drei potentielle Palmitoylierungsstellen (Cysteine 4, 5 und 7) und es stellte sich die Frage, ob die drei Cysteine individuelle Funktionen erfüllen. Um diese Frage zu beantworten wurden Mutanten generiert, in denen entweder einzelne oder mehrere Cysteine durch Alanin ersetzt wurden. Dabei stellte sich heraus, das Mutanten mit nur einem Cystein, respektive einer Palmitoylierungsstelle, einen stark veränderten Phänotyp hinsichtlich der Proteinlokalisation und –funktion aufweisen, wobei die Position des Cysteins entscheidend für eine effiziente Palmitoylierung ist. Zur Untersuchung der Bedeutung der Palmitoylierung für die Funktion von Vac8 wurde das Protein mit der Src SH4 Domäne versehen, die myristoyliert wird aber statt der Palmitoylierungsstelle einen Abschnitt mit mehreren basischen Aminosäuren enthält. Diese Chimäre lokalisierte zwar wie erwartet auf der Vakuolenmembran, konnte aber eine Vac8 Deletion nicht funktionell komplementieren. Nur durch die Addition eines einzelnen Cysteins in der Src SH4 Domäne konnte die Wildtyp Funktion wiederhergestellt werden. Aufgrund der gewonnen Daten lässt sich daher sagen, dass die Palmitoylierung die Funktion von Vac8 entscheidend beeinflusst. 2.Der Effekt des DHHC Proteins Pfa3 auf die Palmitoylierung von Vac8. In vorhergehenden Studien wurde gezeigt, dass das SNARE-Protein Ykt6 die Palmitoylierung von Vac8 in einer nicht-enzymatischen Reaktion vermitteln kann. Demgegenüber ist die enzymatische Acylierungsreaktion von Vac8 bislang noch weitgehend unverstanden. Das vakuoläre Protein Pfa3 gehört zur Familie der DHHC Transmembranproteine, deren Mitglieder Proteinacyltransferase-Aktivität aufweisen. Daher wurde es als ein Zielprotein gewählt, dessen Einfluss auf die Palmitoylierung von Vac8 näher untersucht wurde. Tatsächlich konnte ich in meinen Studien nachweisen, dass Pfa3 spezifisch zur Palmitoylierung von Vac8 beiträgt. Eine Palmitoylierung anderer vakuolärer Proteine durch Pfa3 konnte demgegenüber nicht nachgewiesen werden. Pfa3 wird nicht für die Vererbung der Vakuole benötigt, muss aber für eine effiziente Vakuolenfusion vorhanden sein. Neben seiner Funktion als Proteinacyltransferase fungiert es als Vakuolen-Sortierungsfaktor für Vac8 und Proteine mit einer Src SH4 Domäne. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das DHHC Protein Pfa3 die Palmitoylierung und die Funktion des Vac8 Proteins beeinflusst

Theoretical Investigations of Structural and Magnetic Ground State Stability of BiMnO3

AbstractWe investigate the crystal structure and magnetic ground state of monoclinic BiMnO3 using first principles calculations, in order to shed some light on the long standing issues related to the structural stability and ferroelectric polarization of BiMnO3. Our total energy calculations based on full structural optimization reveals that BiMnO3 stabilizes to monoclinic C2/c (centrosymmetric) with ferromagnetic ground state. Furthermore, to validate model calculations report, in which antiferromagnetic ordering is assumed to co-exist with ferromagnetism, to drive ferroelectric polarization, we invoke antiferromagnetic ordering in our calculations and find that this ordering indeed breaks the inversion symmetry and induces ferroelectric polarization along x-z plane

Quantitating the epigenetic transformation contributing to cholesterol homeostasis using Gaussian process.

To understand the impact of epigenetics on human misfolding disease, we apply Gaussian-process regression (GPR) based machine learning (ML) (GPR-ML) through variation spatial profiling (VSP). VSP generates population-based matrices describing the spatial covariance (SCV) relationships that link genetic diversity to fitness of the individual in response to histone deacetylases inhibitors (HDACi). Niemann-Pick C1 (NPC1) is a Mendelian disorder caused by >300 variants in the NPC1 gene that disrupt cholesterol homeostasis leading to the rapid onset and progression of neurodegenerative disease. We determine the sequence-to-function-to-structure relationships of the NPC1 polypeptide fold required for membrane trafficking and generation of a tunnel that mediates cholesterol flux in late endosomal/lysosomal (LE/Ly) compartments. HDACi treatment reveals unanticipated epigenomic plasticity in SCV relationships that restore NPC1 functionality. GPR-ML based matrices capture the epigenetic processes impacting information flow through central dogma, providing a framework for quantifying the effect of the environment on the healthspan of the individual

HSP90 inhibitors reduce cholesterol storage in Niemann-Pick type C1 mutant fibroblasts

Niemann Pick type C1 (NPC1) disease is a lysosomal lipid storage disorder caused by mutations of the NPC1 gene. More than 300 disease-associated mutations are reported in patients, resulting in abnormal accumulation of unesterified cholesterol, glycosphingolipids and other lipids in late endosomes and lysosomes (LE/Ly) of many cell types. Previously, we showed that treatment of many different NPC1 mutant fibroblasts with histone deacetylase inhibitors resulted in reduction of cholesterol storage, and we found that this was associated with enhanced exit of the NPC1 protein from the endoplasmic reticulum and delivery to LE/Ly. This suggested that histone deacetylase inhibitors may work through changes in protein chaperones to enhance the folding of NPC1 mutants, allowing them to be delivered to LE/Ly. In this study we evaluated the effect of several HSP90 inhibitors on NPC

Chemical blackening of stainless steel

Chemical blackening of stainless steel from a chromic acid-aulphuric acid bath containing selenium compound as addition agent has been investigated. The effect of temperature, sulphuric acid concentration and additive concentretion on the Wenine charecteristics as well as the potential - time behaviour of the system have been studied. The corrosion resistance of the coating is also reporte

Hard anodising of internal bore of cylindrical aluminium alloy for engineering applications

Hard andisinad intemal bores d aluminium wide d i i used in shock absorbers cannot be canied out by the convenknal method d anodising. SO s b lty pe d jig has been fabricated to ha4d the rinps me over the other and the eledroMe is Rowed through the internal bore without seepage d the eledrolyte. The influence d the paramete& such as tempemiure, a r m t densily.Agw rate and the properties such as hardness, coating ratio and thickness were studied using different eleddyte systems

Single-phase grid voltage attributes tracking for the control of grid power converters

Grid interfacing power converters are indispensable for renewable energy conversion schemes. Fast and precise detection of grid signal parameters is essential for effective operation and control of these converters. For such applications, synchronous reference frame phase-locked loop (SRF PLL) involving two orthogonal signals is widely deployed. For singlephase system, this requires another signal orthogonal to the input. In this paper, single-phase SRF PLL with fixed sampling period sliding discrete Fourier transform (SDFT) filter as orthogonal signal generator is proposed. Additionally, this filter is capable of rejecting dc offset and harmonics present in the grid voltage. With this arrangement, loop filter of PLL need not be equipped with filtering capability. Therefore, PLL could be designed with larger bandwidth which will result in better transient performance. However, SDFT output will be erroneous with asynchronous sampling, under grid frequency drift.With suitable study, relation between those errors and deviation of frequency from nominal value is established. Using this relation, error compensation at any grid frequency can be achieved. To validate the proposed method, various grid abnormalities are emulated with the aid of programmable power source and dSPACE realtime controller board. The effectiveness of the proposed scheme is demonstrated through experimental investigations.by Chandrasekaran Subramanian and Ragavan Kanagara