Immunohistochemistry Reveals TRPC Channels in the Human Hearing Organ : A Novel CT-Guided Approach to the Cochlea

TRPC channels are critical players in cochlear hair cells and sensory neurons, as demonstrated in animal experiments. However, evidence for TRPC expression in the human cochlea is still lacking. This reflects the logistic and practical difficulties in obtaining human cochleae. The purpose of this study was to detect TRPC6, TRPC5 and TRPC3 in the human cochlea. Temporal bone pairs were excised from ten body donors, and the inner ear was first assessed based on computed tomography scans. Decalcification was then performed using 20% EDTA solutions. Immunohistochemistry with knockout-tested antibodies followed. The organ of Corti, the stria vascularis, the spiral lamina, spiral ganglion neurons and cochlear nerves were specifically stained. This unique report of TRPC channels in the human cochlea supports the hypothesis of the potentially critical role of TRPC channels in human cochlear health and disease which has been suggested in previous rodent experiments

TRPC6-Kanäle in der humanen Cochlea : Anatomische Präparationstechnik und Immunhistochemische Untersuchung

Die Beteiligung von TRPC6-Kanälen (Transient Receptor Potential Classical) am Hörvorgang ist Gegenstand aktueller Forschung und bisher nicht hinreichend geklärt. In ihrer grundlegenden Funktion als nicht-selektive Kationenkanäle, spielen sie in physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen diverser Organe wie beispielsweise an Nieren, Herz und Blutgefäßen eine Rolle. Durch ihre Permeabilität für Calcium-Ionen vermitteln sie dabei intrazelluläre Signalkaskaden. Nach Kenntnisstand des Autors ist ein immunhistochemischer Nachweis dieser Kanäle am menschlichen Innenohr bisher nicht erfolgt. Ziel dieser Dissertationsarbeit war ein spezifischer, immunhistochemischer Nachweis von TRPC6-Kanälen in der menschlichen Cochlea. Des Weiteren wurden die Leitstrukturen hinsichtlich ihres Färbeverhaltens verglichen, was Rückschlüsse über die Expression von TRPC6-Kanälen in den verschiedenen Geweben zuließ. Darüber hinaus wurde eine anatomische Präparationstechnik entwickelt, mit der auch in zukünftigen Forschungsprojekten eine sichere Entnahme der Cochlea aus dem menschlichen Felsenbein möglich ist. Durch die Lage der Cochlea in der pars petrosa ossis temporale erfolgte vor der histologischen Aufarbeitung eine Decalzifizierung des Knochengewebes mittels EDTA-Lösung (Ethylendiamintetraessigsäure) um histologische Schnitte erstellen zu können und die Zielstrukturen zugänglich zu machen. Insgesamt wurden 28 Proben aus 14 Körperspendern des anatomischen Institutes der Universität des Saarlandes entnommen. Die Körper wurden im Vorfeld mit Formalin- bzw. NEP-Lösung fixiert. Zur Planung der Entnahme erfolgte eine computertomographische Untersuchung an einem humanen Schädel. Die erfolgreiche Entnahme wurde anschließend anhand der ersten gewonnenen Proben, ebenfalls per Computertomographie, kontrolliert. Anschließend konnten die Proben dem Decalzifizierungsprozess zugeführt werden. Nach einer mittleren Decalzifizierungszeit von 201 Tagen, konnten aus 15 dieser Proben verwertbare histologische Schnitte erstellt werden. Per indirekter, immunhistochemischer Färbung erfolgte anschließend die Untersuchung der Proben hinsichtlich ihrer Expression von TRPC6-Kanälen. Die Spezifität der Färbungen wurde durch eine Peptidkontrolle gesichert. Dabei wurde der Primärantikörper vor Verwendung mit einem TRPC-6-Blocking-Peptid inkubiert. 4 In der Auswertung der Ergebnisse konnte ein Nachweis von TRCP-6 Kanälen an diversen cochleären Leitstrukturen erbracht werden. Insbesondere das Corti-Organ mit den inneren und äußeren Haarzellen, sowie der Nervus cochlearis, zeigten deutlich positive Färbeergebnisse. Die Peptidkontrolle zeigte ebenfalls positive, jedoch deutlich abgeschwächte Färbeergebnisse. Es ist damit von einer Spezifität der verwendeten Methode hinsichtlich von TRPC6-Kanälen auszugehen. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit das Vorhandensein von TRPC6-Kanälen in verschiedenen Strukturen der humanen Cochlea nachgewiesen, eine sichere Entnahmetechnik der Cochlea aus dem Os temporale und ein zuverlässiger, gewebeschonender Decalzifizierungsprozess etabliert werden.The role of TRPC6-channels ((Transient Receptor Potential Classical) in the hearing process is the subject of current research and has not yet been fully clarified. In their basic function as non-selective cation channels, they play a role in physiological and pathophysiological processes in various organs, such as Kidneys, Heart and Blood Vessels. Due to their permeability for calcium ions, they mediate intracellular signaling cascades. To the best of the author's knowledge, no immunohistochemical evidence of these channels in the human inner ear has yet been obtained. The aim of this dissertation was a specific, immunohistochemical detection of TRPC6-channels in the human cochlea and their key structures. In addition, an anatomical preparation technique was developed that will also make it possible to safely remove the entire cochlea from the human petrous bone in future research projects. Due to the location of the cochlea in the pars petrosa of the temporal bone, the bone tissue was needed to be decalcified using an EDTA (Ethylenediaminetetraacid) solution to make the target structures accessible, before the histological processing and immunohistochemical staining. A total of 28 samples were taken from 14 body donors from the Anatomical Institute of the Saarland University. The bodies underwent fixation beforehand under the use of formalin or NEP solution. To plan the removal of the cochlea from the skull, a computer tomographic scan was carried out. The successful removal was then checked on the basis of the first samples obtained, also by computer tomography. The samples could then be fed into the decalcification process. After a mean decalcification time of 201 days, usable histological sections could be created from 15 of these samples. The samples were then examined for their expression of TRPC6 channels using indirect immunohistochemical staining. The specificity of the staining was secured by a peptide control by incubating the primary antibody with a TRPC-6-blocking-peptide before use. In the evaluation of the results, evidence of TRCP-6 channels on various cochlear key structures could be shown. In particular, the organ of Corti with the inner and outer hair cells, as well as the cochlear nerve, showed strong positive staining results. 6 The peptide control also showed positive, but weaker staining results. It can therefore be assumed that the method used is specific to TRPC6-channels. Overall, the detection of TRPC6 channels in the structures of the human cochlea has been successful and a safe extraction technique, as well as a reliable and gentle decalcification process has been developed